<em&gt; In vivo</em&gt; Assay לבדיקת חדירות כלי דם

Summary

אנו מציגים In vivo בדיקה לבדיקת חדירות כלי דם. בדיקה זו מבוססת על הזרקה תוך ורידית של הדמיה לצבוע ולאחר מכן של דיפוזיה שלו למרחבי ביניים.

Abstract

שיטה זו מבוססת על הזרקה תוך ורידית של אוונס הכחול בעכברים כמודל חית המבחן. אוונס הכחול הוא צבע שנקשר אלבומין. בתנאים פיסיולוגיים האנדותל בלתי חדיר לאלבומין, כך שרידי אלבומין כריכה כחולה אוונס מוגבל בתוך כלי דם. בתנאים פתולוגיים שמקדמים חדירות תאי אנדותל כלי דם מוגבר באופן חלקי לאבד הקשר הקרוב שלהם והאנדותל הופך חדיר לחלבונים קטנים כגון אלבומין. מצב זה מאפשר לextravasation של אוונס הכחול ברקמות. האנדותל בריא מונע extravasation של הצבע ברקמות כלי הדם הסמוכות. איברים עם חדירות מוגברות יציגו צבע כחול גדל באופן משמעותי בהשוואה לאיברים עם האנדותל בשלמותה. רמת חדירות כלי דם יכולה להיות מוערכת על ידי הדמיה פשוטה או על ידי מדידת כמותית של הצבע המשולבת למיליגרם של רקמה של שליטה מול חיים / רקמות ניסיוניות. שני poweהיבטי rful של assay זה הם הפשטות שלו ומאפייני כמותיים. אוונס הכחול צבע ניתן לחלץ מרקמות על ידי דוגר כמות מסוימת של רקמה בפוראמיד. מרבית הספיגה הכחולה אוונס הוא בעמ '620 ננומטר וספיגה מינימאלית היא ב740 ננומטר. באמצעות עקומת סטנדרט עבור אוונס הכחול, מדידות צפיפות אופטיות ניתן להמיר את צבע מיליגרם כבש למיליגרם של רקמה. ניתוח סטטיסטי יש להשתמש כדי להעריך הבדלים משמעותיים בחדירות כלי דם.

Introduction

גיבוש ותחזוקה של מחסומים חדירים סלקטיבית הם חיוניים להתפתחות איבר תקין ^ו1,2 ביצועים. תאי האנדותל קו לום כלי הדם ויוצרים מחסום חדיר למחצה כי הוא חיוני בהובלה סלקטיבית בין הדם למרחב ביניים של כל האיברים. מחסום חדירות נאותות נשמר באמצעות צומת תא לתא צפופים הנשלטים בקפידה על ידי גורמי גדילה, ציטוקינים ומולקולות הקשורות מתח אחרות ^3. שיבוש של מכשול התא האנדותל יכול לגרום לחדירות מוגברות ודליפה של כלי דם. תופעות אלו נצפות במצבי מחלה שונים וההבנה של האיתות המולקולרית הקו התחתונה דורשת שיטות רבות תחומיות ^4,5. במאמר זה, אנו מתארים בשיטת vivo למדוד חדירות כולים תוך שימוש במודל עכבר.

הבדיקה שאנחנו מתארים, הידוע גם כassay מיילס, היא-establ גםished שיטה לבדיקת חדירות כלי דם בגוף חי. הבדיקה מתבססת על העובדה שבתנאים פיסיולוגיים בסיסיים, אלבומין אינו חוצה את מחסום אנדותל. אוונס הכחול, צבע אזו עם זיקה חזקה לאלבומין, מוזרק לזרם הדם של בעלי חיים הניסיונות, ובתנאים פיסיולוגיים, אך הוא צפוי להיות מוגבל בתוך כלי דם. כאשר גירוי חדירות כלי דם נוסף, או topically או מערכתי, כלי דם מתחילים לדלוף חלבון ובכך, גם הכחול אוונס שהוא חייב אלבומין. התוצאה היא גוון כחלחל מהיר של רקמות שיש להם כולים חדירים.

זריקה מוצלחת של הצבע בוריד זנב העכבר לרוחב היא קריטית לתוצאות הטובות של הניסוי. טכניקת הזרקת וריד זנב דורשת תרגול רב וצריכה להיות שולטת לפני תחילת הניסוי.

חדירות כלי תלויות מאוד בגיל ובמשקל שלimal, ולכן כאשר משווים זנים שונים של עכברים הוא הכרחי כי העכברים או נושאים אחרים יש מבחן קרוב לתאריכי לידה זהים ומשקל. גורמים אחרים המשפיעים על החדירות של מחסום אנדותל הם תנאים סביבתיים כגון טמפרטורה, לחות, ומאוד חשוב, מתח הטיפול בעכבר. בשל ריבוי גורמים שיכולים להשפיע על התוצאה של הניסוי זה תמיד רצוי שהניסוי חוזר על עצמו לפחות שלוש פעמים וניתוחים סטטיסטיים בוצעו.

בדיקה זו יכולה לשמש או להשוואת חדירות כלי של עכברים שעברו שינוי גנטי, כמו גם עכברים עם רקע גנטי שונה. חדירות ניתן להעריך בנוכחותו או היעדריו של גירוי, בהתאם לפונקציה של הגן שהוא מווסת. assay זה יכול לשמש גם או כדי לבדוק את ההשפעה של תרכובות שונות בחדירות כלי דם.

Protocol

1. הזרקה תוך ורידית של אוונס הכחול בוריד זנב העכבר לרוחב

1. הכן 0.5% תמיסה סטרילית של אוונס הכחול ב PBS. במידת צורך, מסנן-לעקר את הפתרון כדי להסיר כל חומר חלקיקים שאינו מומס.
2. לשאוב פתרון 200 μl אוונס הכחול לתוך מזרק. הימנע מכל בועות האוויר שאולי נמלטו לתוך המזרק.
3. עכברי מקום שהם ישנים 8-12 שבועות לתוך מכשיר איפוק כדי שבעל החיים אינם חופשי ניידים אבל זנבו ניתן לטפל.
4. הנח את מכשיר איפוק העכבר על צידו כך וריד הזנב לרוחב הוא נראה בקלות והם פונים כלפי מעלה.
5. להחזיק את הזנב עם היד הלא הדומיננטית בין האגודל לאצבע המורה.
6. הכנס את המחט (מד קטן, 27-30) בזווית של 10-15 מעלות, שיפוע למעלה, מראש לתוך וריד הזנב לרוחב לכיוונו של הראש. שמור מקביל מחט מזרק ועד הזנב.
7. Do לא תחול שוב לחץ לאישור המיקום נכון שכן דבר עלול לכווץ את הווריד.
8. לאט לאט להזריק פתרון 200 μl אוונס הכחול בוריד הזנב של העכבר.
9. הקפד על קלות שבה התקדמות הבוכנה, כמו זה היא ההוכחה למיקום נכון של המחט בווריד.
10. שים את העכבר בחזרה לכלוב שלו ולבחון אותו למשך 30 דקות.

2. אוסף איברים והפקת אוונס הכחול מהאיברים

1. להקריב את העכברים דרך נקע בצוואר רחם. למטרות assay מיילס נקע צוואר רחם מומלץ משום שהוא מגביל את התערבות משמעותית בחדירות כלי דם. להקריב את כל העכברים באותו הזמן, מהר ככל האפשר. עבודה עם קבוצות של 6 עכברים או פחות, משום שזמן קצר לאחר שכלי הדם של מוות נעשים חדירים יותר.
2. מקם את העכברים על גבם ולהצמיד את רגליהם על לוח לבן.
3. פתח את חלל הבטן ובית החזה כדי לחשוף Thorאיברי acic ובטן.
4. קח תמונות מייצגות כדי להראות הבדלים בextravasation הכחול אוונס. כלול את כל העכברים באותו השדה כדי שתהיה לי תנאי תאורה זהות לכל העכברים.
5. איסוף איברים של עניין ולשים אותם בצינורות 1.5 מ"ל
6. שוקל צינור ריק ולהביא את ערך האיזון לאפס.
7. העברת דגימת הרקמה ומשקלו. חזור על פעולה עבור כל דגימות הרקמה. רקמות יכולות להיות אוויר יבש כדי לחסל את שונות תכולת המים בין איברים שונים.
8. . הוסף פוראמיד μl 500 לכל צינור דגימת רקמה.
9. להעביר את כל הצינורות לאמבטית 55 ° C מים או בלוק חום. דגירה במשך 24-48 שעות כדי לחלץ אוונס הכחול מרקמות.

3. כימות של אוונס הכחול Extravasated ברקמות ביניים

1. צנטריפוגה פוראמיד / התערובת הכחולה אוונס לגלולה כל ברי רקמה נותרות.
2. מדוד ספיגה ב610ננומטר. השתמש פוראמיד μl 500 כריקים.
3. חישוב ng אוונס הכחול extravasated לרקמת מ"ג.
4. עלילה כל הנתונים בגרף.
5. ביצוע ניתוח סטטיסטי כדי לקבוע הבדלים משמעותיים.

תוצאות

אנחנו השתמשנו בבדיקת חדירות vivo לבדוק זליגת כלי בעכברים 8-12 שבועות ישנים. בדיקה זו היא שימושית בהשוואת חדירות כלי דם היחסיות בין בעלי חיים של רקע גנטי שונה או בזן אחד של עכברים הנתונים לטיפולים המשפיעים על מערכת כלי הדם. התוצאות שלנו מראות כי זן של עכברים מ...

Discussion

חדירות כלי דם היא סמן קריטי למצב כלי דם. חדירות כלי דם מוגבר הוכחה להיות נוכח בכמה מחלות מערכתיות, כולל סוכרת, יתר לחץ דם, ומחלות אוטואימוניות ^6,7,8. חדירות כלי דם מוגבר הוכחה להיות מתווכות על ידי מאמץ גזירה, גורמי גדילת כלי דם האנדותל כמו גורם גדילה ופקטור גדילה פי?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
			מגיב
אוונס כחול	SIGMA	E2129
פוראמיד	Invitrogen	15515-026
PBS			פוספט 0.2m 1.5M NaCl pH 7.4
			ציוד
ספקטרופוטומטרים	אפנדורף	952000006
התקן ריסון MOUSE	הרווארד מכשיר	340012
מזרק	BD	309659
מחטים	BD	305106	המד של המחט תלוי בגודלו של בעל החיים.
מאזן	מכשיר דנבר	TP-64