ויזואליזציה של mRNAs לוקליזציה reticulum endoplasmic בתאי יונקים

Summary

כאן אנו מתארים שיטה לדמיין mRNAs endoplasmic reticulum הקשורים בתאי תרבית רקמת יונקים. טכניקה זו כרוכה permeabilization סלקטיבית של קרום הפלזמה עם digitonin להסיר תוכן cytoplasmic אחרי הניאון באתר הכלאה לזהות או פולי תפזורת () mRNA או תעתיקים ספציפיים.

Abstract

באאוקריוטים, רוב RNAs השליח (mRNAs) המקודדים מופרשת והחלבונים בממברנה מותאמת לשפה מקומיים על פני השטח של reticulum endoplasmic (ER). עם זאת, להדמיה של mRNAs אלה יכול להיות מאתגרות. זה נכון במיוחד כאשר רק חלק קטן מן mRNA הוא ER-משויך והפצתם לאברון זה הנה חסום על ידי תמלילים שאינם ממוקדים (כלומר "חופשי"). על מנת לפקח mRNAs ER-נלווה, פתח שיטה שבה תאי מטופלים עם חשיפה קצרה לפתרון חילוץ digitonin כי סלקטיבי permeabilizes קרום הפלזמה, ובכך מסיר את תוכן cytoplasmic, תוך שמירה על שלמות ER . כאשר שיטה זו היא בשילוב עם ניאון כלאה באתר (FISH), אפשר לחזות באופן ברור mRNAs ER-כפות על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. באמצעות פרוטוקול זה המידה של ER-עמותה לאו תעתיקי תפזורת פולי () או mRNAs הספציפי ניתן להעריךואפילו לכימות. בתהליך, אפשר להשתמש בבדיקה זו כדי לחקור את טבעו של אינטראקציות mRNA-ER.

Introduction

באאוקריוטים, קידוד ה-mRNA מופרש וחלבוני קרום יכולים להיות ממוקדים לחדר מיון השיתוף translationally ידי ^1,2 חלקיק הכרת האות ואפשר לקיים ER דרך האינטראקציות הישירות בין הריבוזומים וtranslocons במהלך תרגום ^3,4. עם זאת, האם יכול להיות ממוקד mRNAs ומתוחזק על ER העצמאי או הריבוזומים או תרגום לא היה ברור עד לאחרונה. מחקרים קודמים ניסו לענות האם יש קשר תרגום עצמאי mRNA עם ER באמצעות טכניקות חלוקה תאיות. בגלל תנאים כימיים קשים נדרשו לנתק את הריבוזומים משלפוחית ​​ER נגזר, שעשוי לשבש את ה-mRNA-ER העדינה פוטנציאלי העמותה, מחקרים אלה לא היו חד משמעיים, הוכחה ^ל5-8 ונגד ^9,10 עיגון ריבוזומלי עצמאי של mRNA לחדר המיון .

כדי להתגבר על בעיות אלו פתחנו פרוטוcol לבודד ותמונה mRNAs ER-כפות. הליך זה כרוך טיפול חילוץ קל, שמסיר ביעילות את כל תוכן cytoplasmic של התא (כולל mRNAs אינו ER-כפות) תוך שמירה על מורפולוגיה ER וכל המולקולות הקשורים אליו. באמצעות פרוטוקול זה אנו מראים כי קבוצת משנה של mRNAs ממוקדות ולאחר מכן שמרה על חדר המיון באופן עצמאי או תרגום של הריבוזומים ^11.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. הכנת חומרים להפקה

1. הכנת התאים
   1. תאי זרע רקמות תרבות על coverslips חומצה טופלה ללפחות יום אחד לפני הניסוי. אנו משתמשים COS-7 או U2OS, כשתי שורות תאים אלה מפגינים ייצור חזק של חלבון מופרש ויש ER מוגדר היטב. שים לב שעל מנת להשיג יעילות שאיבה גבוהה, תאים לא יעלו על 80% confluency על coverslip ביום של הניסוי.
   2. אם mRNA אקסוגני מסוים נחקר, תאים transfected יום אחד לאחר זריעה עם פלסמידים המכילים את הגן של עניין תוך שימוש בפרוטוקולים סטנדרטיים transfection. התאים אז מותר להביע mRNA ללפחות 18 שעות לפני השאיבה.
2. טיפול בתאים עם מעכבי תרגום
   1. כדי לבדוק את ההשפעה של ריבוזומים שלמים על התחזוקה של mRNAs קשר עם חדר המיון, תאים יכולים להיות מטופלים עם מעכבי תרגום שמשבשים את הקשרשל הריבוזומים עם mRNA ^11.
   2. מעכבים של ייזום תרגום, כגון homoharringtonin (HHT), pactamycin, או 2 - (4-methyl-2 ,6-dinitroanilino) - N-methylpropionamide (mdmp), למנוע הריבוזומים חדשים מלהתרועע עם התמליל ובמקביל מאפשרים הריבוזומים מאורסת להשלים תרגום ^12-14. הואיל ושיעור התרגום עבור רוב החלבונים בתאי יונקים הם 5 חומצות אמינו לשנייה, ללא קשר לשימוש או קודון אורך mRNA ^15, טיפול של 30 דקות צריך לנקות את הריבוזומים של הודעות עם מסגרות קריאה פתוחות כל עוד 27,000 נוקלאוטידים (קידוד לחלבונים כל עוד 9000 חומצות אמינו).
   3. מעכבים כגון puromycin לקדם את הפליטה המוקדמת של הרשת המתהווה וכך לשבש את ¹² polysomes. עם זאת כדי לשבש את הקשר של הריבוזומים puromycin טופלו-עם mRNA לחלוטין, chelators מגנזיום כגון EDTA יש להוסיף למאגר חילוץ digitonin ^11.
   4. בניסוי זה, תאים שטופלו בpuromycin 200 מיקרומטר, HHT 5 מיקרומטר, או בינוני שליטה למשך 30 דקות לפני החילוץ.
3. הכנת מאגר החילוץ Digitonin. כדי להמחיש mRNAs ER-מקומי ללא ההתערבות של תמלילים חופשיים (כלומר, שאינם cytoplasmic ER-קשורים), אנו סלקטיבי permeabilize תא עם digitonin, glycoside סטרואידים כי אינטראקציה מועדפת עם 3β-hydroxysterols. בריכוזים נמוכים, digitonin סלקטיבי permeabilizes חלקים של קרום הפלזמה, גורם "דליפות" ^16. לעומת זאת, קרום ER ומעטפת גרעין, שהם עניים בכולסטרול, נותרים ללא פגע ^16,17.
   1. אבקת Digitonin (סיגמה אולדריץ) מומסת במים מזוקקים במשקל 5% / נפח ופתרון שהמנייה הזאת aliquoted לנפחים קטנים ומאוחסנת ב-20 ° C. מניסיוננו, מחזורים רבים בהקפאת הפשרה מקטינים את היעילות של digitonin המומס.
   2. פתרון של מנייהחיץ CHO 10x (1x ריכוז עובד פתרון: 115 המ"מ כץ, 25 מ"מ HEPES pH 7.4, 2.5 המ"מ MgCl _2, 2 המ"מ EGTA וסוכרוז mM 150) מוכן עם חומרים כימיים RNase-חופשי ומאוחסן ב -20 ° C. פתרון עובד (1x CHO חיץ) הוא הוכן על ידי דילול פתרון המניות עם מי RNase חינם וניתן לאחסן ב 4 ° C.

2. הפקת Digitonin

1. הכנת פתרוני חילוץ
   1. בלוק חימום עם משטח שטוח הוא שחומם מראש ל 40 מעלות צלזיוס, ונשמר בטמפרטורה זו במהלך לחילוץ.
   2. כדי ליצור משטח עבודה שטוח שהוא RNase חופשי, בלוק החימום טבול במעט מים ומצופים בחתיכה טרייה של parafilm M (חברת Bemis, Inc). בועות אוויר בין גיליון parafilm ובלוק חימום הנן החליקה החוצה באמצעות כפפות RNase-חופשיות וkimwipes (VWR).
   3. 1x CHO החיץ מחומם ל 37 מעלות צלזיוס ידי דוגר באמבט מים.
   4. צלחות 6-גם משמשות כדי לשטוףולתקן תאים. כל שורה של 3 בארות משמשת לכיסוי 1 להחליק. לשתי הבארות הראשונות בשורה, 2 מ"ל של חיץ CHO התחמם הוא הוסיף. כדי גם האחרון, 2 מ"ל של תמיסת הקיבוע (PBS paraformaldehyde + 4% (מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים)) הוא הוסיף. מגש זה יכול להיות מאוחסן ב37 המעלות צלזיוס החממה עד שהתאים מוכנים להפקה.
   5. פתרון החילוץ Digitonin הוא הוכן על ידי דילול פתרון digitonin המניות כדי 0.025% עם חיץ CHO חם רק לפני שימוש. שוב, שים לב שתאים לpuromycin טופל, חיץ החילוץ חייב בנוסף מכיל 20 המ"מימ EDTA יעילות לשבש הריבוזומים ^11. טיפין של 100 μl של פתרון החילוץ מונחות על בלוק החימום parafilm המכוסה מייד לפני החילוץ.
2. הפקת Digitonin וקיבוע סלולרי
   1. מסיר את התאים מ37 המעלות צלזיוס החממה.
   2. בתהליך החילוץ, coverslips הוא מניפולציה בעזרת המלקחיים של jewler. עםהמלקחיים להרים את coverslip וטובלים אותו הראשון ולאחר מכן השני גם מכיל מאגר CHO לשטוף את מדיום הגידול.
   3. מהר למחוק את החיץ עודף מהצד האחורי של coverslip עם kimwipe ולמקם את coverslip, צד התא פונה כלפי מטה, על פתרון החילוץ באופן מיידי.
   4. לאחר 10 שניות, להרים את coverslip עם המלקחיים ולהעביר אותו באופן מיידי, בצד תא פונה כלפי מעלה, לרווחת המכיל 4% חיץ הקיבוע paraformaldehyde.
   5. תן לדגור במדגם מייצב ללפחות 15 דקות בטמפרטורת חדר.
3. הכנת תאי בקרה Unextracted. כדי לקבוע את הסכום הכולל של ה-mRNA בציטופלסמה זה רעיון טוב כדי להכין את מדגם שליטת unextracted.
   1. תאים שגודלו בcoverslips מוכנים כאמורים לעיל (ראה סעיף 2.2), אלא ששלב חילוץ digitonin (2.2.3) הוא דלג.
   2. לאחר קיבוע, תאים בלתי חולצו צריכים להיות permeabilized ב PBS + טריטון 0.1%X-100 במשך 15 דקות בטמפרטורת חדר.

3. כתמי דגים

1. עיצוב בדיקות עבור פלואורסצנטי כלאה באתר
   1. הרצף הראשוני של mRNA של עניין מקופל באמצעות תוכנת רנ"א משנית מבנה חיזוי, כגון RNAstructure 5.0 ^18. קפלי mRNA מוערכים חזותי לזיהוי אזור של כ 50 נוקלאוטידים שהוא ללא מבנים משניים גדולים.
   2. ההשלמה ההפוכה של אזור זה היא מסונתז עם Alexa546 fluorophore המחובר בקצה 5 'של החללית (שנרכש מטכנולוגיות DNA משולבות).
   3. החללית מדוללת במי RNase חינם לריכוז מניות של 100 מיקרומטר שניתן לאחסן ב -20 ° C.
2. הכתמה עם בדיקות FISH
   1. שימו לב שלמרות שהתאים digitonin-חולצו אינם דורשים permeabilization נוסף, טיפול בדגימות אלה קבועים עם 2 מ"ל של 0.1% טריטון X-100 בדילולPBS במשך 15 דקות בטמפרטורת חדר לפני צביעת דגים, עוזר להפחית את אות הרקע.
   2. את השקופיות אז נשטפות פעמים עם PBS להסיר כל paraformaldehyde שייר או טריטון X-100.
   3. התאים אז נשטפים פעמים עם פוראמיד 25% עד 60% במאגר ציטראט נתרן 1X (150 mM NaCl וציטרט הנתרן mM 15). באופן כללי, לבדיקות דגים ספציפיות שהם 50-60 נוקלאוטידים אורך, פוראמיד 60% בלבד, אך ל() הכתמת mRNA פולי עם חללית Oligo (dT) דגים, ברמה של פוראמיד מופחת עד 25%.
   4. כדי להכין את החדר המכתים, תחתית צלחת פטרי 150 מ"מ מכוסית במים ופיסת parafilm הוא צפה על פני המים. המים מוסרים על ידי הסיבוב מעל הצלחת, ובכך מאפשרים parafilm לדבוק בתחתית הצלחת. בועות אוויר יוסרו באופן ידני עם kimwipes.
   5. לכל coverslip להיות מוכתם, פיפטה μl 100 ירידה של פתרון ההכלאה המכיל דגי חללית של ריבית על השוויafilm בתא המכתים. בדיקת FISH המנייה מדוללת עם פוראמיד 25% עד 60% במאגר ההכלאה (1x SSC, 100 מ"ג / המ"ל dextran סולפט, 1 מ"ג / מיליליטר השמרים tRNA, מורכב riboside vanadyl 5mm, פוראמיד 25-60%) לריכוז עבודה של 0.2 מיקרומטר. שים לב שכמות פוראמיד צריכה להיות מותאמת לבדיקה מסוימת בשימוש, והוא נוכח באותו הריכוז כמו בחיץ לשטוף SSC (ראה שלב 3.3.3).
   6. Coverslip מונח בפני צד תא למטה, אל פתרון הדגים בתא המכתים וטופח ל5-24 שעות על 37 מעלות צלזיוס בתא humidified כגון רקמת תרבות חממה.
3. כביסה והרכבת הדגימות המוכתמות
   1. כדי להכין את אזור רחצה חופשיה RNase, נשכבה רצועת parafilm על משטח שטוח ברמה, כגון שולחן מעבדה. כדי להבטיח שparafilm הוא שטוח ורטוב המשטח ישר, הנח parafilm על גבי ולהסיר באופן ידני את כל בועות אוויר עם kimwipes.
   2. הקאמרי הוא המכתיםהוסר מהחממה ומונח על משטח שטוח ברמה. את coverslips מכן רחף על ידי pipetting כ 500 μl של חיץ לשטוף דגים ליד הקצה של כל coverslip. הפתרון יוצג ב- בין coverslip וparafilm באמצעות פעולת נימים.
   3. לכל coverslip, 1 מ"ל של חיץ לשטוף (1x SCC עם פוראמיד 25-60%, ראה שלב 3.3.3) הוא pipetted על parafilm אזור הכביסה (ראה שלב 3.4.1).
   4. באמצעות מלקחיים, את coverslips יוסרו מהתא המכתים וכל אחד ממוקם על הירידה של חיץ לשטוף והדגרה בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות. תהליך הכביסה חוזר 3 פעמים.
   5. שקופיות זכוכית נשטפות עם אתנול 70%, ומיובשים בkimwipes.
   6. לכל coverslip, 25 μl של פתרון תלייה (DAPI Fluoromount G, הדרום יוטק) היא pipetted לשקופית. שים לב שפתרון זה מכיל 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), ה-DNA שכתמים ומאפשר הדמיה של גרעינים.
   7. USIמלקחיים וkimwipes ng, החלק האחוריים של coverslip הם מיובשים וחיץ לשטוף דגים עודף נמחק בלי ייבוש המדגם. אז כל coverslip ממוקם צד תא פונה כלפי מטה, על הירידה של פתרון גובר.
   8. דגימות רכובות מסומנות ויכולות להיות חנות ב 4 ° C.

4. הדמיה וכימות

1. הדמיה
   1. מיקרוסקופ epifluorescence משמש לתמונת התאים הבאים מכתים דגים. תא transfected יכול להיות מובחן מתאי untransfected ידי אות פלואורסצנציה בהירה בערוץ המתאים. באופן אידיאלי, כל שדה שנרכש, מכיל גם תא untransfected לשמש כדי לקבוע את קרינת הרקע לכימות.
   2. לכל תמונות שדה של הדג וערוץ DAPI הם נרכשים. בנוסף, אם התאים הם שיתוף צבעוניים עם סמנים חלבוניים, תמונה של ערוץ immunofluorescence גם רכשה. שימו לב שחילוץ digitonin יכול לשמש גםכדי להמחיש הריבוזומים ER-כפותים וחלבונים ^11.
   3. כדי להבטיח שאת עוצמות הקרינה בין השדות ניתן להשוות, את זמן החשיפה לכל ערוץ צריך להישאר קבוע עבור כל קבוצה של ניסוי.
   4. שוב כדי לוודא שאת עוצמות הניאון בין התאים בcoverslips השונה ניתן להשוות, השינויים מהיום ליום בעוצמת epiluminescence או ריקבון באות הדג צריכים להיות ממוזערים על ידי הדמיה את כל coverslips בפגישה אחת.
2. כימות. כדי לכמת את הכמות של mRNA שהוא מקומית בחדר המיון, אנחנו משתמשים בתוכנת אלמנט ש"ח ניקון. עם זאת תוכנת ניתוח תמונה אחרת כגון ImageJ ניתן להשתמש.
   1. שימוש בכלי ניקון ש"ח אלמנט תמונת הניתוח, פריפרית התא ואת הגרעין מתואר כאזור נפרד של תחומי עניין (Rois).
   2. לכל החזר על השקעה, עוצמת הניאון (אני _T לעצמת התא המוחלטת, ואני _{N כדי}עצמה גרעינית) והאזור _(T ו _N) נרשמות ומיוצאות לגיליון Excel.
   3. עבור כל תמונה, עוצמת ניאון הרקע (אני _B) נקבעה על ידי הקלטת האינטנסיביות של תאים לא transfected. אם (A) רמות ה-mRNA פולי הם נתחו, אזור תא חינם נבחר.
   4. הסכום הכולל של חדר מיון (בתאים שחולצו) או cytoplasmic (בתאי unextracted) פלואורסצנטי מחושב על ידי הנוסחא:
      _{[ט] [אני} לא - אני _B] - _{[N] [N} - אני _B]
   5. העוצמת המכתימה הגרעינית גם ניתן לחשב ומשמשת כבקרה פנימית בין טיפולים שונים. מאז גרעינים אינם מושפעים מטיפול digitonin ¹⁷ או שיבוש הריבוזום ^11, הסכום של mRNA הגרעיני צריך להישאר קבוע בין כל אחד מטיפולים אלה. כדי לחשב פלואורסצנטי הגרעיני הנוסחא הבאה משמשת:
      _{[N] [N} - אניB]
   6. האחוזים של mRNA cytoplasmic שהוא ER-ממוקד יכולים להיות מחושבים על ידי לקיחה את הקרינה הממוצעת ER של תאים חולצו 30-40 (ראה 4.2.4) מחולקת בפלואורסצנטי cytoplasmic הממוצע מתאי unextracted 30-40 (שוב ראה 4.2.4) . זה קריטי, כי התאים שחולצו וunextracted מוכנים, מוכתמים וצלמו במקביל.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

כדי לקבוע את האחוז של mRNA שהוא ER-משויך, COS-7 תאים שtransfected עם פלסמידים שהכילו phosphatase אלקליין השליה (ALPP) או ציטוכרום P450-8B1 (CYP8B1) היה או חילוץ עם digitonin ולאחר מכן קבוע, או ישירות קבוע (ראה תרשים 1, להשוות "Unextracted Ctrl" כדי "לשלוף Ctrl"). פלואורסצנטי לא גרעינ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

הלוקליזציה של mRNAs לאתרי subcellular שונים, באמצעות האינטראקציה של תמלילים עם חלבוני לוקליזציה mRNA, היא תופעה נפוצה חשובה למיון הנכון של חלבונים ליעד הסופי שלהם, ולכוונון העדין של ביטוי גנים לדרישות המקומיות של subcellular אזור ^19,20.

באמ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.