מדידה של תוחלת חיים ב<em&gt; דרוזופילה melanogaster</em

Nancy J. Linford; Ceyda Bilgir; Jennifer Ro; Scott D. Pletcher

doi:10.3791/50068

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

דרוזופילה melanogaster הוא אורגניזם מודל רב עצמה לחקר הבסיס המולקולרי של ויסות אריכות ימים. פרוטוקול זה יעסוק השלבים הכרוכים ביצירת מדידה לשחזור, המבוסס על אוכלוסייה של אריכות ימים, כמו גם בעיות פוטנציאליות וכיצד להימנע מהם.

Abstract

הזדקנות היא תופעה שגורם להידרדרות פיזיולוגית מתמדת בכל כמעט אורגניזמים שבו זה כבר נבדק, מוביל לביצועים פיסיים מופחתים ועלייה בסיכון למחלה. הזדקנות אדם היא מניפסט ברמת האוכלוסייה כעלייה בתמותה תלויה גיל, אשר לעתים קרובות שנמדדה במעבדה על ידי התבוננות תוחלת חיים בקבוצות גדולות של אנשי גיל מתאים. ניסויים המבקשים לכמת את המידה שבה גנטית או סביבתית מניפולציות השפעת תוחלת החיים באורגניזמים מודל פשוטים הייתה מוצלחת להפליא להבנת ההיבטים של הזדקנות, הנשמרים על פני מינים ועל אסטרטגיות חדשות להארכת תוחלת חיים מעוררי השראה ומניעת גיל הקשורים למחלה ביונקים .

זבוב החומץ, דרוזופילה melanogaster, הוא אורגניזם מודל אטרקטיבי לחקר מנגנוני הזדקנות, בשל אורך חיים הקצרים יחסית, גידול נוח, ושטחית גנטיקה.עם זאת, צעדים דמוגרפיים של הזדקנות, כולל הישרדות גיל ספציפי ותמותה, הם רגישים במיוחד אפילו שינויים קלים בעיצוב וסביבה ניסיוניים, והתחזוקה של נהלים מחמירים למעבדת משך ניסויי הזדקנות נדרשה. שיקולים אלה, יחד עם הצורך לתרגל שליטה קפדנית של רקע גנטי, הם חיוניים ליצירת מדידות חזקות. ואכן, יש הרבה מחלוקות בולטות המקיפות היקש מניסויי מאריך חיים בשמרים, תולעים, זבובים ועכברים שהיו לייחס לחפצים סביבתיים או גנטיים ^1-4. בפרוטוקול זה, אנו מתארים מערכת הנהלים שהיו מותאמים לאורך שנים רבות של מדידת אריכות ימים בדרוזופילה באמצעות בקבוקוני מעבדה. גם אנו מתארים את השימוש בתוכנת dLife, אשר פותח על ידי המעבדה שלנו, והוא זמין להורדה (http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab / תוכנה). dLife מאיץ את התפוקה ומקדמת שיטות עבודה טובות בעיצוב ניסיוני אופטימלי שילוב, פישוט טיפול זבוב ואיסוף נתונים, ניתוח נתונים ותקנון. נדונונו גם את החסרונות הפוטנציאליים רבים בתכנון, איסוף, ופרשנות של נתוני תוחלת חיים, ואנו מספקים צעדים כדי למנוע סכנות אלה.

Protocol

אנו ממליצים אחסון מזונות ניסיוניים, רסק שמרים, וצלחות אגרו ענבים המופיעים בפרוטוקול ב 4 ° C ושימוש בם תוך 1-2 חודשים, כל עוד עובש ויובש לא להגדיר פנימה תנאים סביבתיים רגילים לזחל והן למבוגרים לביים כרוך תחזוקה של זבובים בחממה ב 25 ° C עם מחזור 12:12 שעתי אור חושך ולחות יחסית 60%.

1. הכנת מזון ניסויי

להתפתחות רימות, אנו משתמשים modified קלטק בינוני ^5, וזה מצוין בפרוטוקול זה כCT.
אנו ממליצים על תזונה למבוגרת דרוזופילה (ש"י) שמורכבת מסוכר (סוכרוז) ושמרים (שמרים שלם שיכר lyophilized) בשיעור של 2% בסיס אגר, כי כבר רתח, בתוספת אנטיביוטיקה ותרופות אנטי פטרייתי, והופצנו (10 מ"ל לבקבוקון) ^6. מזון צריך להיות מותר כדי לגבש ומתאדה ל12-24 שעות לפני האחסון. משום שהסביבה התזונתית יכולה substantially אריכות השפעה, עקביות בתהליכי בישול היא חיונית גם בתוך ניסוי ולהשוואה בין ניסויים.
אם תרופתי הוא שיש להוסיף למזון למבוגר, תרופה זו יכולה להיות מעורבת לתוך יצווה קטנה של מזון ושכבתי (2 מ"ל) על פני האוכל, עם צלוחיות בקרה המקבלים שכבות המכילות רכב לבדו.

2. הכנת דבק שמרים חי

שלב 5-6 מיליליטר מים עם 3 גרם של שמרים יבשים פעילים ומערבב היטב. העקביות של רסק השמרים צריכה להיות זה של חמאת בוטנים חלקה.

3. הכנת צלחת אגרה ענבים

הוסף חבילת premix אגר בענבי 500 מ"ל של מים מזוקקים בבקבוק 1000 מ"ל ובצע את ההוראות שעל השקית לפזר את התערובת אגרה ענבים.
זהירות לשפוך שכבה עבה של התערובת לתוך צלחות פטרי 100 מ"מימ תוך הימנעות היווצרות בועה. מנה אחת premix מייצרת כ 14 graצלחות אגר PE.
בואו התקשורת להתקרר ולהתמצק בטמפרטורת חדר עם מכסים למשך 15 דקות. צלחות יכולות להיות כל זמן ב 4 ° C, עטוף בניילון נצמד, או בשימוש באופן מיידי.

4. אוסף של ביצים מסונכרנות

כל כלי התקשורת בשימוש בפרוטוקול זה, שמרים כלומר, צלחות אגרו ענבים, CT ו 10% מזון ש"י, צריכה להיות בטמפרטורת חדר.

מורחי שכבת 2-3 סנטימטר קוטר של שמרים להדביק על צלחת אגרה ענבים ומניחים בצד.
הצב כלוב אוסף ביצה גדולה על משטח CO ₂ עם הרשת בצד למטה כדי להרדים את הזבובים. הרדמת חנקן מבוסס היא חלופה לCO _2, בשימוש על ידי מעבדות מסוימות, שיכול להפיק תוצאות באיכות גבוהה ^7.
השתמש במשפך, להעביר 150-200 זוגות של זבובים לכלוב איסוף הביצים.
הנח את הצלחת אגרה ענבים כדי לכסות את הקצה הפתוח של הכלוב ולאבטח עם כובע סוף.
הנח את הכלוב בצד הדרך עד זבובים מתעוררים.לאחר מכן, לשמור את כלוב צד הצלחת, הענבים אגרו למטה, בחממה בן לילה.
ביום המחרת, להחליף את צלחת ענבים עם צלחת ענבים חדשים yeasted. לשים רק על 1 סנטימטר קוטר של רסק שמרים על פני השטח של הצלחת. השלך את צלחת ענבי יום 1 ^st.
אפשר לאסוף עוברים על פני השטח של הצלחת אגרה ענבים ל16-22 שעות. פעם עשה, לאסוף את הצלחת אגרה ענבים ולהשליך את הזבובים ההוריים.
לשטוף את פני השטח של הצלחות אגרו ענבים עם 1x נאגר מלוח פוספט (PBS). ביצים יכולות להיות מגויסות על ידי גירוד בעדינות עם צמר גפן. הקפידו לא שריטה, ניזק, או לגרד חתיכות דקות של אגר מעל פני השטח של הצלחת. בעזרת משפך, יוצק את הביצים נשטפו לצינור 15 מיליליטר חרוטים.
תן את הביצים ליישב לתחתית של התחתית ויוצקות את supernatant, נזהר שלא לאבד את כל ביצים. הנפח שנותר צריך להיות בסביבות 2-3 מ"ל.
הוסף 8-10 מ"ל של PBS לצינור וחזור מעל צעד 2-3 המורזמני דואר ללשטוף ביסודיות את הביצים עד supernatant הוא ברור. איך להיפטר של שמרי שיורים הוא המפתח בשלב זה.
לאחר השטיפה, לנקז את כל supernatant עד נפח נותר הוא 2 מ"ל. Aliquot 32 μl של ביצים לתוך בקבוקי CT באמצעות קצה פיפטה רחב משעמם. ביצים בקצה פיפטה צריכות להיות קומפקטיות, עם מעט נוזל aspirated. זו יכולה להיות מושגת על ידי הכנסת קצה פיפטה עמוקה לתוך יישוב הביצה ומשחרר את הבוכנה כדי לשאוב במהירות.
מקום seeded CT בקבוקים מייד בחממה לאורך התפתחות זבוב.

5. אוסף של מבוגרי גיל מתאים זבובים

מבוגרים בדרך כלל eclose מהיום 9 והלאה. השלך את הזבובים שעלו ביום הראשון ובקבוקים מכניסים ללילה החממה. בפועל זה ימנע את הבחירה שלא במתכוון לעולה וצומח מוקדמים ולאפשר לאוסף של מספר מרבי של זבובים מסונכרנים.
16-22 שעות מאוחר יותר, להעביר את המבוגר בן יום עף into בקבוקי SY מזון 10%. במידת צורך, עוד סדרה ניתן לאסוף ביום למחרת.
חזור עף חזרה לחממה ולאפשר זבובים כדי להגיע לבגרות מינית ובן זוג לימים. הקלט את היום של העברה לבקבוקי 10% SY כמו ביום הראשון של בגרות.

6. מיון זבובים וביצוע ניסוי אריכות ימים

הרדם קבוצות קטנות של זבובים על משטח ההרדמה, אז זכרים ונקבות מיון לשתי קבוצות באמצעות מכחול. אם אתם משתמשים בCO _2, זה קריטי כדי לצמצם את החשיפה כדי למנוע בעיות ארוכות טווח בריאותי אפשריות שיכול לסכן את היושרה של ניסוי אריכות הימים.
הנח 30 זבובים מאותו המין לצלוחיות אישיות. בהנחה שאין כרומוזומים איזון באוכלוסייה והצאצאים בריאים, כל בקבוק צריך לייצר סביב 3-4 בקבוקונים של כל מין. Aliquoting זבובים לתוך צלוחיות בודדות צריכה לקחת לא יותר מ 3-4 דקות, כך ש, בסך הכל, זבובים נחשפים להרדמה רק לתקופה מקסימלית של9-10 דקות.
חזור על שלבים 6.1-6.2 עד שיש 8-10 בקבוקון משכפל לכל מגדר וטיפול ניסיוני.

7. הגדרת הגיליון האלקטרוני של Excel כדי לעקוב אחר ניסוי אריכות הימים

אנו ממליצים אקראיים עמדת בקבוקון במקום בקבוקוני קיבוץ בתנאי ניסוי כדי למנוע הטיה קשורה למיקום הבקבוקון בחממה ולטשטש את זהות הבקבוקון לנסיין. לשם כך, תקצה זיהוי מספרים אקראי לכל בקבוקון בתוכנת גיליונות אלקטרוניים ראשון, ואז לסדר את הבקבוקונים במגשים על ידי מספר תעודת זהות. אם אתה משתמש בתוכנת ניהול ניסוי dLife, בצע את ההדרכה על הגדרת ניסוי להפקת מספר זיהוי לכל בקבוקון.
(אופציונלי) אם אתה משתמש בקורא RFID או קורא ברקוד בשיתוף עם dLife, לצרף RFID או תג הברקוד לכל בקבוקון ולשייך את התג עם המזהה המספרי של הבקבוקון בdLife. התכנית תזהה כל בקבוקון כשסרק עם קוראומדריך אחד כדי להקליט את הנתונים במיקום הנכון בגיליון אלקטרוני. שימוש בקורא תג בשיתוף עם dLife מפחית באופן משמעותי זמן איסוף נתונים וטעות הקלטה.

8. שמירת ניסוי אריכות הימים

הבקבוקונים המכילים מזון טרי צריכים להיות בטמפרטורת חדר במשך כל העברה.

במהלך תקופת הניסוי, זבובי העברה על גבי בקבוקונים חדשים המכילים מזון טרי כל 2 ימים (נקבות צעירות), או 3 פעמים בשבוע (זכרים או נקבות> 3 שבועות של גיל). צעד זה יבטיח שסביבת ההאכלה לנקבות צעירות לא תופרע על ידי הנוכחות של זחלים. העברה זו אמורה להסתיים ללא הרדמה, שיכול לגרום לתמותה חריפה, במיוחד בזבובים בוגרים יותר (Pletcher, תצפיות אישיות).
במהלך כל העברת בקבוקון, להקליט גיל, לספור את הזבובים המתים בבקבוקון הישן, והזבובים המתים שמתבצעים לבקבוקון החדש. לתעד מידע זה בנפרד בשתי עמודות בגיליון אלקטרוני (או dLife או הגיליון האלקטרוני שלך). זה יבטיח כי בצע את הזבובים הם לא כפול נספרו-. המספר הכולל של מקרי מוות (מת + ממומן) צריך לפחות שווה במספר הזבובים שבוצעו מההעברה הקודמת. להפחית את מספר הזבובים שבוצעו בעבר מהמספר הכולל של מקרי מוות, כדי לקבוע את מספר מקרי המוות חדש.
זבוב נחשב ימני מצונזר אם הוא עזב את הניסוי לפני המוות טבעי באמצעות בריחה או מוות מתאונה. חיות יוצאות בניסוי באופן זה צריכה להיות נכנס לתוך עמודה נפרדת ביום שהזבוב יצא הניסוי. זבובים מצונזרים הם לא נרשמו כמתים (ראו להלן).
תמשיך לחזור על שלבים 8.1-8.2 עד הניצול האחרון מת. להיות מודע לכך שככל שגיל הזבובים, כמה זבובים יכולים לשכב על הגב ונראו כמת עקב inactiveness. לכן כאשר סופרים זבובים בצעו (מת), קש בצד של הבקבוקונים כדי לקבוע אם יש תנועות רגליים. אם כן, thesזבובים אלקטרוניים הם עדיין בחיים. במקרה שבו זבובים נדבקים למזון בבקבוקון הישן, אבל בחיים, הם לא צריכים להיחשב כמתים וצריכים להינצל על ידי קשה של בקבוקון נוסף כדי לסלק זבוב. זבובים כאלה לצנזר יש להשתמש בזהירות כפי שהוא עלול לגרום להטיה ניסיונית.

9. ניתוח נתונים

עקומת שאירים מציגה את ההסתברות שאדם ישרוד לגיל מסוים ובדרך כלל מחושב באמצעות גישת קפלן-מאייר (איור 1) ^8. בהיעדר נתונים נכוני צנזורה, הנוסחא ניתן לפשט שאירים כך שהגיל ספציפי בגיל x (S _x) נקבע על ידי חלוקת מספר אנשי חיים בתחילת זמן מפקד בגיל x (N _x) במספר הכולל של זבובים בניסוי (N _0); S _x = N _X / N _0. 9.2) עקומות שארות הן הצורה הנפוצה ביותר של הצגת נתונים, והםניתן לבדוק את השוויון בין קבוצות באמצעות מבחן יומן משורה ראשונה. מסקנה הגיונית ניתן להסיק מכמה כמו 50-100 אנשים בקבוצה. אירי הוא מדד מצטבר, לעומת זאת, ולכן מוות שאינו הזדקנות קשורה, כגון אלה בשלב מוקדם בחיים, יהיה לדכא שאירים במהלך חיים ולכן קשה להשפעות ספציפיות להזדקנות לקבוע.
שיטת הדמית נתונים שנייה היא פונקצית תמותת גיל הספציפית, המציגה את הסיכון למוות בכל מרווח גיל ומציג תיאור מורכב יותר של נתוני הישרדות ^9,10. מדדי תמותה הם עצמאיים מגיל אחד למשנו, והצורה של עקומת התמותה שימושית להיסק על הדינמיקה של הזדקנות, במיוחד כאשר טיפולים מותאמים במהלך חיים בוגרים. אומדני תמותת גיל ספציפי, לעומת זאת, חסרי דיוק וגם דיוק עם גודל מדגם קטן, ולעתים קרובות דורשים כמה למאות רבות של אנשים לקבוצה לes אמיןtimate ^11.
שיטות אחרות לאמידת הבדלי אריכות ימים כוללות מודלים למחצה פרמטריים (למשל קוקס רגרסיה) פרמטרית (למשל Gompertz) ו. מודלים אלה יכולים להיות חזקים, אבל צריכים להיות מיושמים בזהירות בגלל ההנחות שנעשו על הצורה של עקומות התמותה והאופי של שפעות טיפול, דבר שעלול להוביל למסקנה שגויה ^11,12.