מדידות קשיחות כפיפה של Biopolymers שימוש במבחני דאייה

Summary

שיטה למדידת אורך ההתמדה או קשיחות כפיפה של biopolymers מתוארת. השיטה משתמשת assay גלישת microtubule kinesin מונע בניסוי כדי לקבוע את אורך ההתמדה של microtubules הבודד וניתנת להתאמה למבחני גלישה יקטין מבוססים.

Abstract

Microtubules הם פולימרי cytoskeletal אשר ממלאים תפקיד בחלוקת תאים, מכניקה של תאים, ותחבורה תאית. כל אחת מהפונקציות הללו דורש microtubules שנוקשים וישר מספיק כדי להקיף חלק משמעותי של קוטר התא. כתוצאה מכך, אורך microtubule התמדה, מידה של נוקשות, נחקר באופן פעיל בשני העשורים האחרונים ^1. עם זאת, נותרו שאלות פתוחות: microtubules הקצר הם 10-50 פעמים פחות נוקשה מאשר microtubules הארוך ^2-4, ואפילו microtubules הארוך מדד אורכי התמדה המשתנים על פי סדר הגודל ^5-9.

כאן, אנו מציגים שיטה למדידת אורך התמדת microtubule. השיטה מבוססת על בדיקת גלישת microtubule kinesin מונחה ^10. על ידי שילוב של ניאון תיוג דליל של microtubules הבודד עם מעקב אחת של חלקיק הבודד fluorophores המצורף לmicrotubule, glidinמסלולי G של microtubules הבודד מתבצעים מעקב בדייקנות ננומטר ברמה. אורך ההתמדה של המסלולים הוא זהה לאורך ההתמדה של microtubule בתנאים המשמשים ^11. שגרת מעקב אוטומטית משמשת ליצירת מסלולי microtubule מfluorophores המצורף לmicrotubules הבודד, ואורך ההתמדה של מסלול זה מחושב באמצעות רוטינות שנכתבו בIDL.

טכניקה זו היא מהירות ישימה, ומסוגל למדוד את אורך ההתמדה של 100 microtubules ביום אחד מניסויים. השיטה ניתן להאריך למדידת אורך התמדה תחת מגוון רחב של תנאים, כולל אורך התמדה כפונקציה של אורך יחד microtubules. יתר על כן, את שגרת הניתוח משמשת יכולה להיות מורחבת למבחני שרירן מבוסס משחק גלישה, כדי למדוד את אורך ההתמדה של סיבי יקטין גם כן.

Introduction

Cytoskeleton, רשת של biopolymers נמצא ברוב התאים האיקריוטים, ממלא תפקיד בארגון סלולרי, תחבורה תאית, ומכניקת תא. המאפיינים המכאניים של biopolymers של cytoskeleton (בעיקר תקטין וmicrotubules) לשחק תפקיד משמעותי בקביעת התכונות המכאניות של התא ככולו ^12. מאז שלמה מכניקה סלולרית יכולה לאפיין תאים בריאים וחולים ^13,14 ומעורב בתנועתיות סלולריות ^15, את התכונות המכאניות של רכיבי cytoskeletal הבסיסיים היו אזור פעיל של מחקר בשני העשורים האחרונים ^1.

הגמישות (או נוקשות) של biopolymers מאופיין באורך ההתמדה, אורכו של פולימר אשר מתכופף על ידי כ 1 רדיאן תחת תנודות תרמיות בטמפרטורת הסביבה. מספר הטכניקות פותח כדי למדוד אורך התמדה ^16, לexampטכניקות פעילות le אשר כרוכות כיפוף הפולימר באמצעות זרימה הידרודינמית, מלכודות אופטיות, או שדות חשמליים ^4,17,18, וטכניקות פסיביות אשר מודדות את התנודות של פולימרים חופשיים בפתרון ^5,6. המדידות הפעילות, עם זאת, דורשות setups המיוחד כדי ליישם את הכוחות ידועים בסולם מיקרומטר, והמדידות, התנודות חופשיות יכולות להיות מאתגרות בשל דיפוזיה מחוץ למטוס של מוקד מיקרוסקופ בשימוש.

במאמר זה, אנו מתארים, טכניקה משלימה, פסיבית כדי למדוד את אורך ההתמדה של microtubules, פולימר cytoskeletal. הטכניקה כוללת מבחני דאייה, אשר להבטיח כי הפולימר נשאר תמיד במישור המוקד של ^19. יתר על כן, זה כרוך fluorophores מעקב הבודד מחובר באופן קבוע לפולימר של ריבית, כך שמקומות מסוימים לאורך הפולימר מאופיינים היטב.

קריקטורה של השיטה מוצגת בFigurדואר 1. Kinesin נע במיוחד לקראת הסוף + של microtubules, כך microtubules בassay גלישה הם מונעים unidirectionally. הסוף המוביל של microtubule, מעבר kinesin האחרון צורף, הוא חופשי להשתנות תחת כוחות התרמיות של הפתרון שמסביב. כmicrotubule מונע קדימה, הסוף משתנה עד קשירת מולקולה חדשה kinesin המשך שקופית הזכוכית קופא בתנודות נתונות. בגלל kinesin מייחס microtubules חזק מאוד, microtubule מוגבל ללכת בדרך של הסוף המוביל. לכן, התנודות הסטטיסטיות שקפאו למסלול microtubule זהות לתנודות הסטטיסטיות של הקצה החופשי של ¹¹ microtubules, ולכן יכולות לשמש כדי לחשב את אורך ההתמדה פי ²⁰

איפה אני _p הוא אורך ההתמדה של microtubule, θ _s היא הזווית בין משיקים למסלול המופרד באורך של קו מתאר, ו<> מסמן ממוצע לאורך כל הזוגות של עמדות המופרדות באורך של קווי מתאר.

Assay הגלישה עוצמה משתמש biotinylated kinesin ^{ב21-הסליל} מפותל קשורים באופן ספציפי לשקופית הזכוכית באמצעות הצמדת streptavidin-ביוטין. התקשרות זו מבטיחה כי התחומים המוטוריים חופשיים להיקשר ולהניע microtubules. על מנת לעקוב אחר מסלולי microtubule, microtubules מתויגים דלילות עם fluorophores אורגני ^22,23 - התוויות חייבות להיות דלילות מספיק שfluorophores היחיד הם פתיר באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מולקולה בודדה. fluorophores היחיד נמצאים במעקב באמצעות שגרת ניתוח תמונה נכתבה בIDL. המסלולים שכל fluorophore חייבים מיקרופון ניתןrotubule משולבים לתוך מסלול microtubule מורכב באופן אוטומטי ^24. זוויות θ לכל נקודה לאורך מסלול המשיקות מחושבות; מזוויות משיקות אלה של> הערך מחושב לכל אורכו של קו מתאר. לבסוף, נתונים אלה מתאימים למשוואה. 1 כדי לחלץ אורך התמדה לmicrotubule נתון, או לmicrotubules רב באותו assay הדאייה.

השיטה היא חזקה מספיק כדי לעבוד עם microtubules הוכן במגוון רחב של מצבים (עם סוכנים שונים מייצבים או מולקולות קטנות אחרות מאוגדים לmicrotubule, עם חלבונים מאוגדים microtubule קשור (מפות), או עם מגוון רחב של פתרונות צמיגים). במעבדה שלנו, הטכניקה נעשתה שימוש כדי לאפיין את אורך ההתמדה של microtubules כפונקציה של אורך לאורך microtubules וmicrotubules עם סוכני מייצבים שונים. המגבלה העיקרית היא שmicrotubules חייב עדיין שלתנועתיות upport kinesin. מאז kinesin הוא אנזים מנוע חזק, זוהי מגבלה די רופפת. על ידי החלפת microtubules עם אקטין וkinesin עם משפחת אנזים מיוזין, אורך ההתמדה של אקטין יכול להימדד באותה הטכניקה.

Protocol

1. פתרוני microtubule דאיית Assay מניות

להכין מראש assay דאייה.

1. פלמר 0.5 microtubules מ"ג כותרת דלילות עם ²² fluorophore האורגני הבהיר. ריכוז תווית היעד הוא fluorophore 1 לכל מיקרומטר של microtubule, או צפיפות תיוג של כ 1 fluorophore ל1500 הדימרים טובולין. אחסן בטמפרטורת חדר, אור שמוגן באלומיניום, נייר כסף לתקופה של עד שבועות.
2. טהר ²¹ ביוטין-kinesin בכ 1 מיקרומטר. חנות ב -80 מעלות צלזיוס ב5 aliquots μl לשימוש בניסויים נפרדים.
3. הכן את חיץ assay (א.ב.) של imidiazole 50 מ"מימ, אשלגן כלורי mM 50 (KCl), 4 מגנזיום כלוריד מ"מ (MgCl _2), אתילן גליקול 2 מ"מ tetraacetic החומצה (EGTA), 6.7 pH. מסנן וסטרילי חנות ב 4 ° C.
4. ממס biotinylated שור אלבומין (ביוטין-BSA) עד 2 מ"ג / מ"ל ​​בא"ב. סנן עם מסנן מזרק מיקרומטר 0.2.חנות ב -80 מעלות צלזיוס ב100 aliquots μl לתקופות ארוכות, ב4 מעלות צלזיוס למשך עד חודש.
5. ממס streptavidin (SA) עד 10 מ"ג / מ"ל ​​בא"ב. סנן עם מסנן מזרק מיקרומטר 0.2. חנות ב -80 מעלות צלזיוס ב20 aliquots μl לתקופות ארוכות, ב4 מעלות צלזיוס למשך עד שבועות.
6. ממס α-קזאין עד 5 מ"ג / מ"ל ​​בא"ב. סנן עם מסנן מזרק מיקרומטר 0.2. חנות ב -80 מעלות צלזיוס ב100 aliquots μl לתקופות ארוכות, ב4 מעלות צלזיוס למשך עד שבועות.
7. ממס dithiothreitol (DTT) במי deionized ב 200 מ"מ. חנות ב -20 ° C ב100 aliquots μl, השתמש בשעות 8 הפשרה. יכול להיות refrozen.
8. ממס פקליטקסל (PT) בsulfoxide דימתיל HPLC כיתה (DMSO) בשעת 4 מ"מ. חנות ב 10 aliquots μl ב -80 ° C לטווח ארוך, -20 ° C לטווח קצר. יש להשתמש תוך 8 שעות של הפשרה. יכול להיות refrozen.
9. לפזר סוכר במי deionized במינון 120 מ"ג / מ"ל. חנות ב100 aliquots μl ב -20 ° C. יכול להיות refrozen.
10. דיסלפתור אדנוזין טריפוספט (ATP) במי deionized ב150 מ"מ, 7.0 pH. חנות ב 5 aliquots μl ב -80 ° C, השתמש בשעות 8 הפשרה.
11. הכן 100x מניות חמצן הדחת ²⁵ על ידי המסת 10000 גלוקוז אוקסידאז יחידות ויחידות 156.000 catalase לחיץ assay סך μl 600. צנטריפוגה בקצרה בmicrocentrifuge לגלולה מוצקה; supernatant סינון עם מסנן מזרק 0.2 מיקרומטר. חנות ב -80 ° C ב 10 aliquots μl לתקופות ארוכות, ב4 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע.

2. Microtubule הרחיפה Assay, הכנת פתרון באותו יום

הכן את הפתרונים ב2.1-2.6 ביום של הניסוי. בעזרת תרגול, פתרונות 2.2-2.6 יכולים להיות מוכנים בזמן שטיפת זרימת תאים. אלא אם נאמר אחרת, לשמור פתרוני מניות על קרח.

1. הכן AB, 1 מ"ל של חיץ assay עם 10 μl של DTT המניות (AB עם 2 המ"מ DTT). שמור בטמפרטורת חדר.
2. הכן יו BSA חיץ, 40 & mu; מערבל תערובת ביחס 1:1 של ביוטין-BSA המניות וא.ב.. שמור בטמפרטורת חדר.
3. הכן את חיץ BSA, ערבוב 645 μl של AB עם 5.5 BSA μl (1 מ"ג / המ"ל BSA בא"ב). שמור בטמפרטורת חדר.
4. הכן את חיץ SA, ערבוב 57 μl של AB עם מלאי streptavidin μl 3 (0.5 מ"ג / המ"ל streptavidin בא"ב). שמור בטמפרטורת חדר.
5. הכן את חיץ α-קזאין, ערבוב 200 μl של BSA חיץ, מניית קזאין 50 μl, ו -0.8 μl של 15 מיקרומטר ATP (1 מ"ג / מ"ל ​​α-קזאין, 0.8 מ"ג / המ"ל BSA, 50 ננומטר-ATP בא"ב). שמור בטמפרטורת חדר.
6. הכן את חיץ פלואורסצנטי אנטי אקונומיקה, ערבוב 95 חיץ μl α-קזאין, מניית גלוקוז 2.5 μl, לערבב 1 μl 100x חמצן הדחה, מניית פקליטקסל 1 μl, μl 1 2-mercaptoethanol (βME). הוסף βME תחת מנדף. השתמש במאגר פלואורסצנטי אנטי אקונומיקה בתוך 1 שעה של הכנת זהירות:. ΒME הוא רעיל מאוד וריח נורא. הקפד לפתוח רק במנדף. בקבוק בחנותהיעדר האור, אור מדרדר βME ויכולתו להפחית photobleaching.

3. Assay microtubule הרחיפה

1. לבנות על ארבעה נתיבי זרימה בין coverslip 24 x 60 מ"מ והמ"מ coverslip 22 x 22 באמצעות גריז ואקום, extruded ממזרק דרך קצה פיפטה, כspacer. כל נתיב זרימה צריך להיות כ 10 μl בנפח (כרכים באים בקנה המידה בהתאם).
2. שטוף 10 μl של חיץ ביו BSA לתוך כל סמטה. דגירת 5 דקות על מנת לאפשר לBSA מעייל משטחי הזכוכית.
3. שטוף את כל מסלול שלוש פעמים עם חיץ BSA μl 15 להסיר חופשי ביוטין-BSA, תוך המשך כדי לחסום את שקופית פני השטח. השתמש Kimwipe או נייר סינון כדי להסיר את החיץ מהצד השני של תא זרימה, להיות בטוח שלא לאפשר לבועות אוויר לצאת דרך חדר הזרימה.
4. שטוף 15 μl SA-החיץ לתוך כל סמטה. חכה 10 דקות, או עד 2 שעות. Streptavidin יהיה לאגד את המשטח בכריכת ביוטין-BSA.
5. שטוף את כל מסלול שלוש פעמים עם חיץ BSA 15 μl להסיר החופשי SA תוך כדי לחסום את שקופית פני השטח.
6. שטוף את כל מסלולים עם 15 חיץ μl α-קזאין. α-קזאין מסייע לחסום נוסף מחייב שאינו ספציפי של kinesin וmicrotubules לזכוכית.
7. דלל kinesin עד 10 ננומטר במאגר α-קזאין ותרחץ כל שביל עם 15 μl של kinesin זה - פתרון α-קזאין. חכה 15 דקות (או עד שעה) לkinesin biotinylated כדי לאגד באופן ספציפי לstreptavidin קרקע המאוגדת. התחומים המוטוריים kinesin יישארו חופשיים microtubules אגד.
8. דלל פקליטקסל ל40 מיקרומטר בטמפרטורת חדר חיץ α-קזאין, ותרחץ כל שביל עם 15 μl של פתרון זה לשטוף את kinesin החופשי ומראש לטעון כל תא זרימה עם פקליטקסל פתרון כדי למנוע מmicrotubules depolymerizing. קר גם depolymerizes microtubules, כדי לוודא שהצעדים הללו מתרחשים בטמפרטורת חדר עם החדר temperatuמחדש פתרונות.
9. לדלל כותרת fluorescently microtubules 1:100-1:1,000 במאגר פלואורסצנטי אנטי אקונומיקה עם mM ATP 1. שטוף 15 μl לנתיב אחד ולהתבונן בתוך 30 דקות.

4. איסוף נתונים

1. שים לב microtubules הגלישה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי; מיקרוסקופ מסוגל לפתור fluorophores הבודד כגון התקנת TIRF מסחרית או ביתי לבנות נדרש ²⁶ (איור 2).
   את microtubules צריך להיות מונע על ידי מנועי kinesin על המצע בכ 0.5 מיקרומטר / s, תלוי בטמפרטורה. אם השדה של הנוף של המיקרוסקופ הוא 50 מיקרומטר, microtubules הבודד צריך להיות גלוי לכ 100 שניות. הגדרת עוצמת תאורה, כך שfluorophores הבודד לא photobleach מהר יותר מ 100 שניות. אם אתם משתמשים בעירור ליזר, הגדרת הספק של כ 3-5 mW היא מתאימה.
2. איסוף רצפים של תמונות לניתוח. 600 תמונות ב5 הרץ (2 סך הכל דקות) עובד היטב. השתמש ברצפים ארוכים מספיק שmicrotubules חוצה את כל התחום של הנוף.

5. ניתוח נתונים

שגרת IDL, get_lp.pro, מצורפת. שגרה זו מחזירה ערך אורך התמדה מבוסס על כל microtubules הגלישה בתמונה ברצף נתון. כך או להפעיל את השגרה הזאת בכל תמונה ברצף, שינוי פרמטרים בעצימות בהתאם להגדרת מיקרוסקופ המסוימת שלך, או בצע את הפעולות הבאות:

1. עקוב אחר כל fluorophore המצורף microtubule ליצור מסלולי fluorophore.
2. מערבב את כל המסלולים של fluorophores על microtubule ניתן למסלול microtubule כלל החוזרים עבור כל microtubule בתמונה ברצף (איור 3).
3. חשבתי את זווית משיק לכל נקודה לאורך המסלול (איור 4)ולחשב θ _s> במשוואה. 1 על ידי ממוצעים של הקוסינוס של זווית ההבדל עבור כל זוג הנקודות המופרדות של הנתיב באורך (איור 5). מצא את אורך ההתמדה לmicrotubule בודד או קבוצת microtubules ידי _של θ> למשוואה. 1, שקלול נקודתי נתונים הבודדים בכושר על ידי מספר הערכים עצמאיים של cos θ _s המשמשים לחישוב ממוצע.

תוצאות

תמונת מצב מבדיקת גלישה מוצגת באיור 2. צפיפות microtubule טובה היא microtubules 1-10 לשדה הראייה; משמעותי יותר יגרום mistracking כmicrotubules חוצים זה את זה. עלילה של מסלולי 11 microtubule מבדיקת הגלישה באיור 2 מוצגת באיור 3. מסלולים אופייניים הם ארוכים 10-30 מיקרומטר; כמה מס?...

Discussion

מדידות אורך התמדה הן אפיון טוב של התכונות המכאניות של biopolymers הבודד. במאמר זה, יש לנו תאר שיטה למדידת אורך ההתמדה של microtubules. כפי שצוין במבוא, שיטה זו היא להרחיב בקלות לבחינת מאפייני microtubule מכאניים במגוון רחב של תנאים פשוט על ידי שינוי את ריאגנטים, הטמפרטורה, או הצמיגות ב?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Imidazole	סיגמה אולדריץ	I2399
אשלגן כלורי	סיגמה אולדריץ	P9541
מגנזיום כלוריד	סיגמה אולדריץ	M8266
EGTA	סיגמה אולדריץ	E3889
BSA	Calbiochem	126615
Biotinylated BSA	Thermo Scientific	29130
Α-קזאין	סיגמה אולדריץ	C6780
Streptavidin	Thermo Scientific	21125
Dithiothreitol	סיגמה אולדריץ	D0632
פקליטקסל	מעבדות LC	P-9600
גלוקוז אוקסידאז	סיגמה אולדריץ	G2133
Catalase	סיגמה אולדריץ	C100
גלוקוז	סיגמה אולדריץ	G8270
ה-ATP	סיגמה אולדריץ	A2383
2-mercaptoethanol	סיגמה אולדריץ	M3148	רעיל. קנה כמות קטנה.
24X60 מ"מ מס '1 1/2 כוס כיסוי	VWR	48393-252
22X22 מ"מ מספר 1 מכסה זכוכית	זהב חותם	3306
גריז ואקום גבוה	דאו-קורנינג	NA
מיקרוסקופ TIRF	רב	NA	מיקרוסקופ TIRF השתמש בשיטה זו היה התוצרת בית.
IDL (תוכנה)	Exelis	NA	יכול להחליף MATLAB, ImageJ, או תוכנת ניתוח תמונה אחרת.