פלטפורמת הפקת MultiBac החלבון המורכבת בEMBL

Summary

קומפלקסי חלבונים לזרז תפקודים תאיים מרכזיים. אפיון פונקציונלי והמבני מפורט של מתחמים רבים חיוניים דורש ייצור רקומביננטי. MultiBac הוא מערכת תא baculovirus / חרק מותאם במיוחד לביטוי חלבונים אוקריוטים והמתחמים שלהם. MultiBac יושם כפלטפורמת גישה פתוחה, ונהלי עבודה סטנדרטיים שפותחו על מנת למקסם את התועלת שלו.

Abstract

Proteomics מחקר חשף את המורכבות מרשימות של proteomes אוקריוטים בפירוט חסר תקדים. עכשיו זה רעיון מקובל שבעיקר חלבונים בתאים לא קיימים כישויות בודדות אלא להפעיל את הפעילות הביולוגית שלהם בשיתוף עם הרבה חלבונים אחרים, בבני אדם עשרה או יותר, ויוצרים קווי הרכבה בתא עבור רוב אם לא את כל הפונקציות החיוניות. ^{1 , 2} ידע של הפונקציה והאדריכלות של מכלולי multiprotein אלה מחייב מתן שלהם באיכות מעולה ובכמות מספקת לניתוח מפורט. מיעוט של קומפלקסי חלבונים רבים בתאים, במיוחד באאוקריוטים, אוסר על חילוצם ממקורות מקומיים, ומחייב ייצור רקומביננטי. מערכת וקטור ביטוי baculovirus (BEVS) הוכיחה להיות שימושי במיוחד עבור ייצור חלבונים אוקריוטים, הפעילות אשר לעתים קרובות מסתמכת על עיבוד שלאחר translational כי מערכות ביטוי נפוצות אחרות לעתים קרובות יכולהלא תומך. ³ BEVS להשתמש baculovirus רקומביננטי שלתוכו הגן של עניין הוכנס להדביק תרביות תאי חרקים אשר בתורו מייצרים את החלבון של בחירה. MultiBac הוא BEVS כי כבר מותאם במיוחד לייצור של קומפלקסי חלבונים אוקריוטים המכילים יחידות משנה רבות. ⁴ תנאי חיוני לייצור יעיל של חלבונים והקומפלקסים שלהם הם פרוטוקולים חזקים לכל המעורבים בניסוי שביטוי אידיאלי יכול להיות מיושם כצעדים נהלים סטנדרטיים (SOPs הפעלה) ולאחר מכן גם על ידי משתמשים שאינם מומחים בקלות יחסית. פלטפורמת MultiBac בביולוגיה המולקולרית המעבדה האירופית (EMBL) משתמשת בכתיבת נהלים לכל המעורבים בניסוי ביטוי מורכב multiprotein השלבים, החל מהחדרת הגנים לתוך הגנום baculoviral מהונדס מותאם למאפייני ייצור חלבון Heterologous לניתוח בקנה מידה קטנה של החלבון דגימות הופקו. ^5-8 הפלטפורמהמותקן במצב פתוח גישה בEMBL גרנובל ותמך במדענים רבים מהאקדמיה ומהתעשייה להאצת פרויקטים של מחקר מורכב חלבון.

Introduction

הפעילות ביולוגית נשלט על ידי אסיפות של חלבונים ויומולקולות אחרות הפועלות בתיאום כדי לזרז פונקציות סלולריות. דוגמאות בולטות ניתן למנות את המנגנון שמעתיק את המידע התורשתי הכלולים בדנ"א לתוך RNA השליח. בבני אדם, יותר מ -100 חלבונים לבוא יחד בתהליך מוגדר ומוסדר לתמלל גנים, ויוצרים מתחמי multiprotein גדולים עם 10 ויותר יחידות משנה כולל RNA פולימראז II ואת גורמי השעתוק הכלליים כגון TFIID, TFIIH ואחרים. ⁹ דוגמאות נוספות הם הריבוזום, המורכב מהרבה חלבונים ומולקולות רנ"א, שמזרזים סינתזה של חלבון, או מורכב הנקבובית גרעין האחראית על הלוך ביומולקולות דרך מעטפת הגרעין באאוקריוטים. נתיחה ביוכימי ואדריכלית מפורטת של מהות כל מכונות multicomponent בתא היא חיונית כדי להבין את תפקידם. הבהרת המבנה של פרוקריוטים וeukarהריבוזומים yotic, למשל, היוו סימן ההיכר אירועים מניבים תובנה חסרת תקדים לתוך כמה מכונות macromolecular אלה לבצע את התפקיד המיועד שלהם בתא. ^10,11

ניתן להשיג הריבוזומים באיכות ובכמות מספיקות למחקר מפורט על ידי מטהר את חומר אנדוגני מהתאים בתרבית, בשל העובדה כי עד 30% מהמסה התאית מורכבת של הריבוזומים. RNA פולימראז II הוא כבר פחות נפוץ בסדרי גודל, והרבה אלף ליטרים של תרבית שמרים הייתי צריך להיות מעובד כדי לקבל תצוגה מפורטת של האטום מורכב חיוני זה מרכזי לשעתוק. ¹² רובם המכריע של מתחמים החיוניים האחרים נמצאים באולם סכומים נמוכים בהרבה בתאים מקומיים, ולכן לא יכולים להיות מטוהרים במידה מספקת ממקור חומר מקורי. כדי להבהיר מתחמים כאלה נגישים לניתוח מבני ותפקודי מפורט דורש ייצור Heterologous באמצעות te רקומביננטיchniques.

היה לי ייצור חלבון רקומביננטי השפעה גדולה על מחקר במדעי חיים. חלבונים רבים יוצרו recombinantly, והמבנה והתפקוד שלהם גזורים ברזולוציה גבוהה. תוכניות גנומיקה מבניות ניצלו ההבהרה את הגנום של אורגניזמים רבים כדי לטפל ברפרטואר מוצר הגן של אורגניזמים שלמים במצב תפוקה גבוהה (HT). אלפי מבנים חלבוניים יש בכך נקבעו. עד כה, המערכת הנפוצה ביותר prolifically לייצור חלבון רקומביננטי כבר E. coli, ומערכות ביטוי רבות פותחו ושוכללו במשך השנים לייצור Heterologous בשורה זו. פלסמידים מחסה שפע של פונקציות כדי לאפשר ייצור חלבון בE. coli למלא קטלוגים שלמים של ספקים מסחריים.

עם זאת, א ' יש coli מגבלות מסוימות שהופכות אותו מתאימה לייצור חלבונים אוקריוטים רבים ובעמ 'קומפלקסי חלבונים במפרק עם יחידות משנה רבות. לכן, ייצור חלבון במארחים אוקריוטים הפך יותר ויותר את שיטת הבחירה בשנים האחרונות. מערכת המתאימה במיוחד היטב כדי לייצר חלבונים אוקריוטים היא מערכת וקטור baculovirus הביטוי (BEVS) המסתמכת על baculovirus רקומביננטי נושא את הגנים Heterologous להדביק תרביות תאי חרקים שגדלו במעבדה. מערכת MultiBac היא BEVS פותחה לאחרונה המותאמים במיוחד לייצור של קומפלקסי חלבונים אוקריוטים עם יחידות משנה רבות (איור 1). MultiBac הוצג לראשונה בשנת 2004. ^-13 מאז השקתו, MultiBac שוכלל ברציפות והזרם בשורה כדי לפשט את הטיפול, לשפר את איכות חלבון המטרה, ובדרך כלל מה שהופך את המערכת נגישה למשתמשים שאינם מומחים על ידי עיצוב נהלי עבודה סטנדרטי (SOPs יעילים). ⁴ MultiBac יושם במעבדות רבות ברחבי העולם, בACademia ותעשייה. בEMBL בגרנובל, תוכניות לגישה רב לאומיים היו לשים במקום על ידי הנציבות האירופית לספק הכשרה מקצועית בפלטפורמת MultiBac למדענים, שבקשו להשתמש במערכת הייצור הזה לקידום המחקר שלהם. המבנה והתפקוד של קומפלקסי חלבונים רבים שהיו עד כה לא היו נגישים הובהרו על ידי שימוש בדגימות המיוצרות עם MultiBac. ⁴ בחלק הבא, את הצעדים החיוניים של ייצור MultiBac מסוכמים בפרוטוקולים כפי שהם במבצע במתקן MultiBac ב EMBL גרנובל.

Protocol

1. Recombineering טנדם (CT) ליצירת בונה ביטוי Multigene

1. תכנון אסטרטגיית שיתוף הביטוי. גישת תכנון להחדרת גני העניין שלך לתורמי acceptors. submodules הפיזיולוגי המורכב הפוטנציאלי שלך צריך להיות מקובצים יחד על acceptors ותורמים ספציפיים. השתמש במודול כפל היקף של endonuclease ביות (HE) - זוגות BstXI לשלב קלטות ביטוי בתורם פרט ופלסמידים acceptor ^7,8 ליצור את כל המבנים הרלוונטיים בסיליקון ואסטרטגיה ולאמת באופן יסודי לפני שתמשיך לעבודה ניסויית.. לדוגמה, הגנים של עניין יש לבדוק שלא מכילים הוא או אתרי הגבלה אחרים ואת הנוכחות של מסגרות קריאה פתוחות נכונות (ORFs) צריכים להיות מאומתים. לשקול הזמנת גנים סינטטיים מותאמים לשימוש קודון תא חרק ומבנה המשני mRNA כדי לשפר את רמות ייצור חלבון, כמו גם להסרת של כל exiעוקץ אתרים מהגנים של עניין. לשקול הצבת תגי טיהור המבוסס על נתונים מהספרות על N-או גמישים או חשוף C-Termini של החלבונים על פי בחירתך. לשקול יישום אסטרטגיות polyprotein שמטרה בהפקה כמה יחידות משנה חלבון במתחם שלך, אם את הכמויות היחסיות של חלבונים בודדים צריכים להיות מבוקרות עקב בעיות stoichiometry במתחם. ⁴ כן מפורט "כיצד לבצע" מסמך (ספר אלקטרוני מעבדה מומלץ) המכיל כל צעדי הניסוי הצפויים של הפרויקט שהובילו למבנה multigene המלא (ים). יצירת קבצים אלקטרוניים של פלסמידים התמזגו Cre-loxP למשל על ידי שימוש בתוכנת Cre-ACEMBLER אשר ניתן להוריד מדף הבית של קבוצת ברגר (multiexpression_technologies www.embl.fr/multibac/ / cre-acembler).
2. הכנס הגנים של עניין שלך לתורמים ונבחריםAcceptors באמצעות אנזימי הגבלה ואנזים, או, לחלופין, על ידי שימוש בשיטות עצמאיות קשירת בעקבות פרוטוקולים שפורסמו. ^5,6,14 אם יש לך גישה לטיפול נוזלי תחנת עבודה ואם אתה מתכנן מספר גדול של מבנים שיופקו ( למשל לגישות קומבינטורית) לשקול השימוש ברובוטיקה תסריטים שפותחו ומיושמים על ידי קבוצת ברגר (איור 2). ^14,15 אם טיפול נוזלי תחנת עבודה אינו זמין, להפעלה ידנית באמצעות צלחות microtitre מאפשרת החדרת הגן בHT כמו אופנה.
3. אילוצים שהוטלו על ידי הצורך לשלוט בהרכב של יחידות מהשנה הביעה להתממש. במקרה של רמות ביטוי לא מאוזנים של יחידות משנה stoichiometrically בודדות של חלבון מורכב, לשקול יישום אסטרטגיות polyprotein לconjoin כמה יחידות משנה שלך מורכב ופרוטאז ספציפי (למשל הטבק לחרוט NIA פרוטאז וירוס) בORFs גדול בודד במרווחים על ידי Sאתרי proteolytic pecific. ^4,8 שקלו שיתוף עם קלטות להביע ביטוי יחידה polyproteins אחד או כמה אם יש לך מורכב מאוד גדול עם יחידות משנה רבות ונרחב הנע משקולות מולקולריות של יחידות משנה נפרדות. לשקול שיתוף להביע כמה הגנים מקודדים לחלבון באותו polyprotein או כמספר קלטות ביטוי זהות אם החלבון שמאופיין בתשואה נמוכה ייצור. ^4,13
4. לאמת את כל מבני תורם acceptor המשובטים על ידי מיפוי הגבלה (אופציונלית בתפוקה גבוהה) וסדר. המשך הפתיל שילובי התורם acceptor ידי רקומבינציה Cre-LoxP כדי ליצור את בונה ביטוי multigene של בחירה. לאמת מטוהר פלסמידים היתוך Acceptor תורם על ידי מיפוי הגבלה, השתמש רצפים אלקטרוניים שנוצרו על ידי תוכניות דומות כמו התייחסות Cre-ACEMBLER או.
5. אחסנו מטוהרים ומאומתים תורמים, וacceptors fusions-acceptor התורם ב -20 ° C או -80 ° C. ארכיון plasmids והרצפים שלהם (Microsoft Excel, Filemaker, אחרים) בזהירות לשימוש מאוחר יותר.

2. Composite Multigene דור baculovirus, הגברה ואחסון

1. לשלב וקטורי העברת multigene הגנום baculoviral MultiBac ע"י הפיכה לDH10 תאי מחסה הגנום הנגיפי ואת הפונקציות הנדרשות לTn7 טרנספוזיציה. שים לב שהגנום baculoviral Multibac ניתן מראש עם גנים מסוימים של עניין (YFP סמן, מלווים, וכו ') באתר שלו (LoxP הונדס לתוך הגנום הדיסטלי לאתר המצורף Tn7) על ידי בתגובת vivo Cre קדמה Tn7 אינטגרציה. ¹³ לאחר Tn7 טרנספוזיציה, תאים עם baculovirus מורכב המכיל את הגנים של עניין נבחרים על ידי הקרנה כחולה / לבן (תוצאות טרנספוזיציה Tn7 מוצלחות בהפסד של α-שלמה של β-גלקטוזידאז, ולכן, עם מושבות Tn7 טרנספוזיציה נכונה להישאר לבנים על סלקטיביתצלחות גאר המכילים X-גל) והוא הוכן על ידי הגנום תמוגה ואתנול / ממטרים isopropanol אלקליין. ^5,6
2. Transfection וייצור וירוס ראשוני. מקום צלחת תרבית רקמה 6 היטב לתוך מכסה המנוע סטרילית. מתרבית תאי חרקים Sf21 יומן שלב, זרע החוצה aliquots של תאים בבארות וtransfect ידי הוספת הגנום baculoviral מטוהר ומגיב transfection מעורב בתקשורת ובתרבות כפי שתואר. ⁶ קציר וירוס ראשוני לאחר 48-60 שעות על ידי הסרת בתקשורת ( איכות גבוהה, וירוס כייל נמוך ₀ V, בדרך כלל 3 מ"ל לכל טוב). מוסף תקשורת טרי, ולבדוק לייצור חלבון (ואם סמן YFP הוא הווה, לקרינה) לאחר 2-3 ימים נוספים. ^6,7
3. הגברה של נגיף, נמוך משרד הפנים משטר. השתמש וירוס V ₀ להדביק 25-50 מ"ל של תאים בשלב יומן (צפיפות תאים <1x10 ⁶ תאים למ"ל) בקטן (100-250 מ"ל) Erlenmeyer ייקר צלוחיות נסערותעל המלשינים פלטפורמת מסלולית (איור 3). ספירת תאים ולפצל כל 24 שעות עד שתאים להפסיק הכפלה (מעצר הפצה). עקוב משטר נמוך משרד הפנים (ריבוי של זיהום כלומר מספר של חלקיקי וירוסים לכל תא): תאים חייבים להכפיל (לפחות) פעם אחת (משרד הפנים <1), אחרת יחזרו על ניסוי בהיקף קטן יותר של V ₀ הוסיף. בדרך כלל, 3 מ"ל של V ₀ משמשים להדביק 25 מ"ל של Sf21 תאי חרקים בצפיפות של 0.5x10 ⁶ תאים / מ"ל. זה חיוני כדי למנוע מזיק על ההגברה ומחיקה האוטומטית של וירוס שיכול לגרום לאובדן של גני Heterologous של עניין. קציר וירוס V ₁ (25-50 מ"ל) אחרי 48-60 שעות על ידי pelleting תאים והסרה של התקשורת המכיל את הנגיף. להשלים עם תקשורת ולבדוק הטריים לYFP וייצור חלבון על ידי הסרת 1x10 ⁶ תאים בכל שעה 12 או 24, pelleting ואימות ייצור חלבון וחלבון אות סמן (YFP). ^6, להגביר את הווירוס (לV ₂₎ עוד יותר אם כרכי ביטוי גדולים יותר מכוונים על ידי הדבקה של עד 400 מ"ל בתאים 2 ליטר שייקר צלוחיות עם וירוס V ₁ מכבד את משרד הפנים הנמוך מעל המשטר (תאים חייבים להכפיל לפחות פעם אחת לאחר הדבקה עם ₁ V). מקפידים לבדוק את ייצור חלבון וחלבון אות סמן במהלך ההגברה, כדי למנוע הצטברות של וירוסים פגומים כבר לא מכילים את הגנים של עניין שלך. כדורי תא השתמש ^5-7 צבירה בכל צעד amplifications כבר להקמת פרוטוקולים לטיהור החלבון המורכבת הביע עניין.
4. אחסון BIIC של וירוס ייצור. אנו ממליצים בחום לאחסון וירוס V ₂ כוירוס ייצור באמצעות BIIC (B-aculovirus אני nfected אני nsect ג אמות) שיטה, כדי למנוע שינויים (לדוגמא אובדן של הגן של עניין) של נגיף רקומביננטי ולשמר ביטוי גבוה רמהשל ¹⁶ תאים נגועים גלולה 24 שעות לאחר מעצרו הוא ציין - התפשטות. בתאי שלב זה מכילים חלקיקים נגיפיים שלמים רגע לפני שהם ישוחררו (בניצנים) לכלי התקשורת. הסירו תקשורת וaliquots הקפאה של התא גלולה בחנקן נוזלי ולאחסן לזמן בלתי מוגבל. ^7,16

3. ייצור חלבון ועיבוד במורד זרם

1. הדבקה (r) תרבויות גדולות וYFP ניטור. השתמש ₁ V, V ₂ או aliquots BIIC קפוא להדביק תרביות תאים גדולות יותר לריצות ייצור (בדרך כלל 400 מ"ל ב2 צלוחיות L). לדבוק במשטר נמוך משרד הפנים (להתאים את עוצמת קול וירוס המשמש לזיהום התרבות נגועה כזה שמכפילה לפחות פעם אחת). הגדלת נפחי תרבות נגועים במידת צורך על ידי הכפלת מספר צלוחיות. אם חלבון סמן YFP הוא הווה, לסגת במרווחים מוגדרים ⁶ תאי 1x10, גלולה וlyse תאים ולעקוב אחר התפתחות של אות YFP עד רמה הוא הגיע indicating ייצור חלבון רקומביננטי מרבי. רמות YFP ניתן למדוד בקורא גם 96 סטנדרטי צלחת מסוגל להקליט אותות הקרינה (למשל טקאן SPECTRAFluor). קציר תאים בשלב זה. כדורי תא לאחסן ב -20 ° C (טווח קצר) או -80 מעלות צלזיוס (לטווח ארוך).
2. תמוגה תא וחלוקה. Lyse תאים בשיטה האהובה עליך של בחירה, המותאמים לדרישות החלבון שלך (בהקפאת הפשרה, sonication, עיתונות צרפתית, ואחרים). Cytosol fractionate ^5-7 וגרעינים ולבדוק את הימצאותם של חלבוני עניין שלך. לפתח פרוטוקולי טיהור המבוססים על התוצאות כדי לפשט טיהור חלבונים. לשקול יישום נהלי שרייה לחלץ החלבון שלך מהשבריר הגרעיני בתנאי KCl גבוהים אם החלבונים שלך מתגוררים בגרעין. ^7,18
3. טיהור חלבונים (בקנה מידה מיקרו, בקנה מידה גדול). שימו לב שלעתים קרובות כמויות קטנות (10 או 25 מ"ל) של תרבית תאים הן sufficient לקבלת כדורי תא לטיהור כמויות ניכרות של חלבוני העניין שלך בשל רמות הייצור בדרך כלל הגבוהות או גבוהות מאוד של חלבוני Heterologous במערכות הסלולריים baculovirus / חרק (לעתים קרובות 10-100 מ"ג של חלבון לכל תרבות ויותר לליטר). בשילוב עם מיקרו טיהור (multiwell צלחות, שיטות microtip, מערכת GE Healthcare ÄKTAmicro, אחרים) אפשר לקבל נתונים ביוכימיים ופעילות ולעתים קרובות גם כמות מספקת של החלבונים והמתחמים הרצויים להתגבשות תפוקה גבוהה nanoliter קנה מידה (HTX ). שקול להשתמש בטיהור זיקת מתכת (Clonetech Takara טאלון, שרפי Qiagen NiNTA מתכת chelator) ותג אוליגו-היסטידין (6-10 שאריות) ביחידות משנה חשופות של החלבון שלך מורכבות כדי להקל על טיהור, בשיתוף עם חילוף יונים וכרומטוגרפיה הדרת גודל בקטן כרכים באמצעות למשל ÄKTAmicro או מכונה טיהור דומה קטנה נפח (איור 4 ). צעדי טיהור זיקה אחרים והחלפת יונים (IEX) צעדים נוספים לטיהור הזיקה עם תגי אוליגו-היסטידין או תגיות אחרות (בחירת GST, MBP, CBP, אחרים) יכולים וצריכים להיחשב, על פי המאפיינים ביוכימיים של החלבונים של עניין והעדפותיו. קחו למשל תיוג מקטע אחד או יותר עם תגי זיקה כדי לשפר את יעילות טיהור. להתרכז קומפלקסי החלבונים המטוהרים שלך ולהקים פרוטוקולי אחסון כגון הקפאה עם או בלי גליצרול. לפתח קריטריוני בקרת איכות שניתן ליישם standardly (מבחני פעילות, בדיקות ביוכימיות וbiophysical) כדי להעריך את הווריאציה אצווה לקבוצה של החלבונים המטוהרים שלך.

תוצאות

שיתוף ביטוי חזק של חלבוני Heterologous שהושגו על ידי מערכת MultiBac מוצג באיור 1D (בדיקות שנלקחו 48 שעות לאחר הדבקת תרבית תאי השעיה). להקות חלבון overexpressed הם בבירור להבחין בכל תמצית התא (SNP) וlysate פינה (SN). האיכות והכמות של חומר החלבון המיוצר היא לעתים קרובות מספיק כדי לאפשר ק...

Discussion

וידאו Snap-יריות באיורים 2 ו -3 ממחישות את התהליך כולו מדור רובוט בסיוע מcDNA ביטוי multigene בונה את כל הדרך לזיהום של תרביות תאי חרקים לייצור חלבון. ריאגנטים חדשים (פלסמידים ווירוס) ופרוטוקולים חזקים פותחו כדי לאפשר לצינור להסתמך על כתיבת נהלים. כל הצנרת כב?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bluo-Gal	Invitrogen	15519-028 (1 g)
Tetracycline	Euromedex	UT2965-B (25 g)	1,000X at 10 mg/ml
Kanamycine	Euromedex	EU0420 (25 g)	1,000X at 50 mg/ml
Gentamycine	SIGMA	G3632 (5 g)	1,000X at 10 mg/ml
IPTG	Euromedex	EU0008-B (5 g)	1,000X at 1M
Cre-recombinase	New England BioLabs	M0298
X-Treme GENE HP transfection reagent	Roche	06 366 236 001
Hyclone SFM4 Insect	Thermo Scientific	SH 30913.02
6-well plate Falcon	Dominique Dutscher	353046
2 ml pipette Falcon	Dominique Dutscher	357507
5 ml pipette Falcon	Dominique Dutscher	357543
10 ml pipette Falcon	Dominique Dutscher	357551
25 ml pipette Falcon	Dominique Dutscher	357535
50 ml pipette Falcon	Dominique Dutscher	357550
50 ml tube Falcon	Dominique Dutscher	352070
15 ml tube Falcon	Dominique Dutscher	352096
1.8 ml cryotube Nunc	Dominique Dutscher	55005
100 ml shaker flasks Pyrex	Dominique Dutscher	211917
250 ml shaker flasks Pyrex	Dominique Dutscher	211918
500 ml shaker flasks Pyrex	Dominique Dutscher	211919
2 L shaker flasks Pyrex	Dominique Dutscher	211921
Certomat Orbital Shaker + plateau	Sartorius	4445110, 4445233
Liquid nitrogen tank dewar 35 L	Fisher Scientific	M76801
Biological Safety Cabinet Faster	Sodipro	FASV20000606
Optical Microscope	Zeiss	451207
Sf21 Insect cells
Hi5 Insect cells	Invitrogen	B855-02
Tecan freedom EVO running Evoware plus	TECAN
10 μl conductive tips (black),	TECAN	10 612 516
200 μl conductive tips (black)	TECAN	10 612 510
disposable trough for reagents, 100 ml	TECAN	10 613 049
twin.tec PCR plate 96, skirted	Eppendorf	0030 128.648
96 well V bottom, non sterile	BD falcon	353263
96 deepwell plate color natural, PP)	Fisher	M3752M
PS microplate, 96 well flat bottom	Greiner	655101
96 deepwell plate	Thermo scientific	AB-0932
24 well blocks RB	Qiagen	19583
DpnI restriction enzyme	NEB	R0176L	20 U/uL
NEBuffer 4 10X	NEB	B7004S
2X phusion mastermix HF	Finnzyme	ref F-531L
2X phusion mastermix GC	Finnzyme	ref F-532L
DGLB 1.5X	homemade		7.5% glycerol, 0.031% Bromophenol blue, 0.031% Xylen cyanol FF
High DNA Mass Ladder for e-gel	Life Technologies	10496-016
Low DNA Mass Ladder for e-gel	Life Technologies	10068-013
E-gel 48 1% agarose GP	Life Technologies	G8008-01
Nucleo Spin- robot-96 plasmid kit	Macherey Nagel	740 708.24
PCR clean-up kit, Nucleospin Robot-96 Extract	Macherey Nagel	740 707.2
Gotaq green master mix	Promega	M7113
T4 DNA polymerase, LIC-qualified	Novagen	70099-3
DTT 100 mM	homemade
Urea 2 M	homemade
EDTA 500 mM pH 8.0	Homemade
LB broth (Miller) 500 g	Athena ES	103