רנ&quot;א<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה בעוברי הר שלמים והיסטולוגיה הסלולרית מותאמת לElasmobranchs הימי

Summary

על ידי שילוב של כל שיטות להר רנ"א באתר הכלאה והיסטולוגיה, ביטוי גנים יכולים להיות מקושרת עם החלטות גורל תא בעובר המתפתח. שיטות אלו הותאמו לelasmobranchs הימי ולהקל על השימוש בבעלי החיים אלה כאורגניזמים מודל למחקרים ביו, רעלים והשוואתיים.

Abstract

elasmobranchs הימי מוערכים מודלים של בעלי חיים למחקרים ביו וגנומית כפי שהם החוליות הפרימיטיביות ביותר שיש חסינות אדפטיבית ויש מנגנונים ייחודיים לויסות לחץ האוסמוטי ^1-3. כאמן חוליות לסת החיים הפרימיטיביים ביותר עם ספיחים לזווג, elasmobranchs הוא מודל אבולוציונית חשוב, במיוחד ללימודים באבולוציה ובהתפתחות. elasmobranchs הימי יש גם שמש ללמוד טוקסיקולוגיה הימית ופיזיולוגיה של לחץ במערכת יחסים עד ⁴ שינויי האקלים. לפיכך, פיתוח וההתאמה של מתודולוגיות נדרשים כדי להקל ולהרחיב את השימוש בחוליות הפרימיטיביות האלה לתחומים ביולוגיים רבים. כאן אני מציג את ההסתגלות המוצלחת של כל הר רנ"א כלאה באתר וטכניקות היסטולוגית ללמוד ביטוי גנים והיסטולוגיה תא בelasmobranchs.

ניטור ביטוי גנים הוא כלי היכר של Biol התפתחותיתogists, ונמצא בשימוש נרחב כדי לחקור תהליכים התפתחותיים ^5. כל הר רנ"א כלאה באתר מאפשר להדמיה והלוקליזציה של תעתיקי גנים ספציפיים ברקמות של העובר המתפתח. דפוס הביטוי של המסר של גן יכול לספק תובנה לגבי מה תהליכים התפתחותיים והחלטות גורל תא גן יכולים לשלוט. על ידי השוואת דפוס הביטוי של גן בשלבי התפתחות שונים, תובנה ניתן להשיג בכמה תפקידים של שינויים גנטיים במהלך התפתחות.

בעוד כל ההר באתר של מספק אמצעים לאיתור ביטוי גנים ברקמות, טכניקות היסטולוגית תאפשרנה זיהוי של סוגי תאים מובחנים ורקמות. כתמי היסטולוגית יש פונקציות מגוונות. כתמים כלליים משמשים כדי להדגיש מורפולוגיה של תאים, למשל hematoxylin וeosin לצביעה כללית של גרעינים וציטופלסמה, בהתאמה. כתמים אחרים יכולים לסמן תאים ספציפייםסוגים. לדוגמה, alcian כתם הכחול דיווח במאמר זה הוא בשימוש נרחב כתם קטיוני לזהות mucosaccharides. הכתמה של מערכת העיכול עם alcian כחול יכולה לזהות את חלוקת תאי גביע המייצרים mucosaccharides. שינויים במרכיבי mucosaccharide על פפטידים קצרים להבחין תאי גביע בתפקידו במסגרת מערכת העיכול ^6. באמצעות כל הר RNA בשל אתרו וhistochemical שיטות בו זמנית, החלטות גורל תא יכולות להיות מקושרות לביטוי גנים ספציפיים.

אמנם RNA בים וhistochemistry "אתר נמצאים בשימוש נרחב על ידי חוקרים, ההסתגלות והשימוש בם בelasmobranchs הימי נפגשו הצלחה מוגבלת ומגוונת. כאן אני מציג את הפרוטוקולים שפותח עבור elasmobranchs והשתמשו על בסיס קבוע במעבדה שלי. למרות שינויים נוספים של RNA בשיטת הכלאה של אתר עשויים להיות נחוצים כדי להסתגל למינים שונים, הפרוטוקולים מתוארים כאן עמrovide נקודת התחלה חזקה עבור חוקרים המבקשים להתאים את השימוש בelasmobranchs הימי לשאלות המדעיות שלהם.

Protocol

הר י רנ"א כל כלאה באתר בElasmobranchs הימי

1. קיבוע עובר והכנה

1. עוברי סקייט יכולים להיות מבוימים פי ⁷ באלארד. שלבים אופטימליים לזיהוי של ביטוי גנים תלויים ברקמות של עניין. כדי לעקוב אחר התבטאות גנים במערכת העיכול להחליק, שלבים 27-30 הם אופטימליים ^7.
2. לנתח עוברים לתוך PBS, מפריד את העוברים מצק החלמון.
3. תקן ב30 מ"ל של 4% paraformaldehyde טרי (PFA) בצינור חרוטים 50 מ"ל ב 4 ° C עם נדנדה עדינה. תקן עבור 24 שעות.
4. שטוף את העוברים בPBT, פעמים למשך 15 דקות, מסתובבות בטמפרטורת חדר. כל מתכוני פתרון לכל הר רנ"א באתר של כלולים (טבלה 1).
5. מייבש עוברים על ידי שטיפה בסדרת מתנול של 25%, 50% ו 75% מתנול: PBT נדנדה בטמפרטורת חדר. משך הכביסות שתלויות בשלב של העוברים. קדם-neurulation מבוים עוברים, 5 דקות מכל שטיפה בסדרת מתנול מספיקות. לעוברים מעל גיל 30 במה, מתרחץ יכול להימשך עד 30 דקות. כדי לקבוע אם עוברים הם חדרו מספיק והתאקלמו לכל שטיפה, החזק את הצינור זקוף ביד שלך. אם העוברים לשקוע לתחתית של התחתית, אז אתה מוכן לכביסה הבאה. אם העוברים לצוף לראש הפתרון, לשנות את הפתרון ולחזור על זה צעד התייבשות מסוים.
6. לשטוף פעמים במתנול 100% למשך 10 דקות בעדינות נדנדה.
7. לאחר ההתייבשות למתנול 100%, עוברים צריכים להיות מאוחסנים ב -20 ° C לפחות 24 שעות לפני שימשיך בפרוטוקול. עוברים כבר מאוחסנים בהצלחה ב -20 ° C ומשמשים לmounts השלם RNA עד לשנת 1.

2. סינתזה של RNA Probe

1. צור בר יניארית של ביטוי הגנים שברצונך לאתר. ניתן לעשות זאת גם על ידי הגברת PCR או linearizing פלסמיד עם הגן שלךשל עניין. כדי להגביר באמצעות PCR, בחר פריימרים שאתרי אגף מחייבים את הגן להוסיף ולשמור על אתרי קישור RNA פולימראז באזור המוגבר. לפלסמידים נפוצים כגון PBS או pGEM, M15 קדימה ופריימרים הפוכים הם אידיאליים. לחלופין, linearize פלסמיד ידי לעכל 15 μl של DNA miniprep Qiagen עם אנזים שחותך בקצה 5 'של הגן. ג'ל לחלץ ולטהר את השימוש בערכת QIAquick המתאימה.
2. הפוך לתמלל את החללית באמצעות רנ"א 8 μl של ng פלסמיד או 100 ליניארית של מוצר PCR כתבנית באמצעות RNA פולימראז המתאים (ראה טבלה 2 לתגובת שעתוק).
3. דגירת תגובה הפוכה לשעתוק 2 שעות ב 37 ° C.
4. כדי לאשר את התגובה, הפעל μl 1 לתגובת השעתוק על 1% agarose ג'ל / TAE. הפעל ג'ל ב 100 mVolts עד הצבע יש רק נתקל בג'ל. להקה בולטת יחידה צריכה להיות גלויה. בר תבנית ה-DNA יכול להיות ליניארי קלוש גלוי בmolecu גבוהlar משקל.
5. הוסף μl 1 מתוך RNAse ללא DNAse לתגובת השעתוק ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
6. למשקע, להוסיף 100 TE pH μl 8, 10 μl ז 4 LiCl, μl% EtOH 300 100 ו דגירה ב -20 ° C במשך לפחות 60 דקות או הלילה.
7. ספין למשך 10 דקות ב4 מעלות צלזיוס בmicrofuge 14000 סל"ד.
8. שטוף את הכדור עם 70% EtOH ואוויר יבש.
9. Resuspend רנ"א חללית ב20 μl של DH ₂ O. הוסף 80 μl של חיץ הכלאה (חיץ הכלאה יש מראש חמם-עד 70 ° C). הבדיקה יכולה להיות מאוחסנת ב80% חיץ הכלאה במשך כמה חודשים ב -20 ° C או יותר ב-80 ° C.

3. עובר טרום טיפול והכלאה

1. הסר עוברים מאוחסנים במתנול 100% מ-20 ° C. לעוברים צעירים להמשיך בצעדים (3.2). מאוחר יותר ביים עוברים (שלב 29/30 <) ייתכן שתראה שכבת האפידרמיס ש'הרים 'מעל גופו של העובר. מתחת למיקרוסקופ, להרגיז זהירותECT את שכבת האפידרמיס על מנת למקסם את חדירת חללית.
2. עוברי מקום בבקבוקוני scintillation זכוכית נקיות. Rehydrate את העוברים בסדרת מתנול ההפוכה לתאר לעיל: (75%, 50%, 25% מתנול: PBT) על ידי מתנדנד בעדינות כל פתרון עבור 5-30 דקות כל בטמפרטורת חדר. התייבשות מוחלטת עם שתי כביסות של PBT עבור 10 דקות כל אחת, מתנדנד קל.
3. כדי להסיר כל פיגמנט, עוברי אקונומיקה עם 6% מי חמצן בPBT לשעת 1 בטמפרטורת חדר, מתנדנד.
4. הסר מי חמצן על ידי שטיפת שלוש פעמים בPBT, (נדנדה בטמפרטורת חדר, 10 דקות כל אחד).
5. פנק את העוברים בעלי proteinase K כדי לאפשר חדיר של חללית במהלך הכלאה. כמות proteinase K ואת משך הזמן של הטיפול תלוי ברקמה שברצונך לבדוק וגיל העובר. רקמה שטחית יותר ועוברים צעירים ידרשו K קצר יותר ופחות proteinase, בעוד רקמות עמוקות יותר ועוברים מבוגרים דורשות ריכוז גבוה ועוד טיפול timדואר לpermeabilize מלוא העובר להכלאת חללית. לדוגמה, כדי לזהות ששישה באנדודרם המעיים של 29 עוברים להחליק במה, 30 מיקרוגרם / מ"ל של proteinase K / PBT הוא מודגרות למשך 20 דקות בטמפרטורת חדר.
6. מהר לשטוף עוברים בPBT כדי לשטוף proteinase ק
7. לביטול proteinase K, עוברי Postfix עם PFA, glutaraldehyde 0.2% בPBT במשך 20 דקות, 4% מתנדנדים בעדינות.
8. שטוף פעמים למשך 10 דקות עם PBT.
9. 1. עבור מראש הכלאה, להוסיף 2-3 מ"ל של פתרון ההכלאה שחומם מראש לעוברים, מספיק כדי לכסות אותם. רוק בעדינות באמבט מים מחומם על 70 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
   2. כדי להכין תמיסת הכלאה, מחמם רנ"א חללית עד 70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ומצננים על קרח. דלל μl 15-20 בדיקה של RNA עד 2 מ"ל של פתרון הכלאה חומם מראש טרי, כדי להשיג ריכוז סופי של 0.5-1.0 ק"ג / מ"ל. הסר מראש hybe ולהוסיף בדיקת רנ"א מדוללת לעוברים. עוברים צריכים להיות מכוסים על ידי פתרון פשוט,פתרון dd הכלאה יותר במידת צורך. מכסה הדוק ומאובטח של בקבוקון נצנץ. להכליא ידי מתנדנד בעדינות באמבט מים מחומם 70 מעלות צלזיוס בלילה.

4. הודעה שוטפת הכלאה והכלאת נוגדן

1. הסר פתרון הכלאה עם חללית מעוברים ומקום בבקבוקון נצנץ טרי או צינור אפנדורף. הבדיקה יכולה להיות מאוחסנת ב -20 ° C ולשימוש חוזר בעתיד. לשטיפות לאחר הכלאה, עוברי מקום בNetwell יושבים בצלחת תרבית רקמת 6-כן.
2. לשטוף 3 פעמים למשך 30 דקות כל אחד בפתרון מראש התחמם # 1, מתנדנד על 70 ° C.
3. לשטוף 3 פעמים למשך 30 דקות כל אחד בפתרון מראש התחמם # 2, מתנדנד על 70 ° C.
4. לשטוף 3 פעמים במשך 5 דקות כל אחד בTBST, מתנועעות בטמפרטורת חדר.
5. טרום בלוק עם סרום 10% חום מומת כבשים בTBST לשעה 1, מתנדנד בטמפרטורת חדר.
6. העברת עוברים מNetwell לבקבוקון זכוכית נצנץ טרי. הוסף אנטי DIGרסיסים (Fab 1:5,000) בסרום 1% חום מומת כבשים / TBST לעוברים. רוק הלילה ב 4 ° C.

5. הכלאת נוגדן הודעת שוטף

1. הסר נוגדן וזורקים. עוברים למקם אותו בחזרה לתוך Netwell לכביסות.
2. לשטוף 3 פעמים למשך 5 דקות כל אחד בTBST, מתנדנד בטמפרטורת חדר
3. שטוף לפחות 6 פעמים לשעה 1 בכל, מתנדנד בטמפרטורת חדר.
4. רחץ לילה בTBST, נדנדה ב 4 ° C. כלעזור לצמצם את כביסות שהודעת הנוגדנים על רקע מכתים, למקסם את המספר ומשך הזמן של שוטף עדיף. עוברים נשטפים באופן שגרתי בTBST ב 4 ° C, בסוף השבוע.

6. זיהוי של חללית

1. המצא פתרון NTMT טרי ולסנן לעקר.
2. השלך פתרון TBST לשטוף ועוברי מקום בבקבוקון נצנץ מזכוכית נקיה. שטוף את העוברים 3 פעמים בNTMT הטרי למשך 10 דקות כל אחד בטמפרטורת חדר, נדנדה.
3. הסר NTMT לשטוף ולהוסיף תערובת תגובהשל x NBT 1 / x BCIP 1 בNTMT. כמגיבים האלה הם רגישים לאור, לכסות בנייר הכסף בקבוקון נצנץ ורוק בטמפרטורת חדר.
4. לפקח תגובת צבע כל 15 דקות עד שביטוי הגן רצוי נראה בבירור. בדיקות חזקות עלולות לקחת קצת כמו 10 דקות כדי להתפתח. בדיקות חלשות עלולות לקחת 1-2 שעות. אל תתנה לתגובה לכי על מדי מכתים רקע ארוך או יתחיל להופיע (כל העובר מתחיל להפוך צבע סגול או חום עמום).
5. לשטוף 2 פעמים למשך 10 דקות כל אחד בPBT בטמפרטורת חדר, נדנדה.
6. עוברי Postfix בparaformaldehyde 4%, glutaraldehyde 0.1% לשעה 1 בטמפרטורת חדר. עוברים יכולים להיות זמן בלתי מוגבל בחנות מקבעים ב 4 ° C.
7. דמיינו עוברים עם stereomicroscope לנתח. כדי לייצר רקע כחול בהיר לתמונות, עוברי מקום בצלחת עם 1% מראש מוקשים agarose / PBS.

7. נציג תוצאות להר א רנ"א כל כלאה באתר בelasmobranchs הימי

כל הר RNA בשל אתר ביטוי של סוניק קיפוד מתאר (שש) וHoxa13 בעוברים להחליק מוצגים באיור 1. ביטוי של שישה בחוליות גבוהות יותר נמצא באנדודרם notochord ומעיים ודפוס ביטוי זה ניתן לחסוך בסקייט (האיור 1 א) ^8,9. elasmobranchs הימי יש שיטה ייחודית לויסות לחץ האוסמוטי המשתמשת בבלוטה רקטלית למלחים מפרישים. Hoxa13 הביטוי הוא גבוה בבלוטה רקטלית הפיתוח (האיור 1b) ^10. תפקיד מוצר הגן Hoxa13 בדפוסי הבלוטה רקטלית נותרת עלומה.

השני. פרפין והטבעה של קטגוריות קיים רקמות Elasmobranch

1. מסיק והכנה של רקמות

1. לנתח ולתקן רקמות רצויות ב10% פורמלין ל24-48 שעות, מתנדנד בטמפרטורת חדר. paraformaldehyde 4% (PFA) יכול לשמש גם כחומר מייצב(ראה דיון).
2. לשטוף את מקבע על ידי השטיפה בPBS, 3 פעמים למשך 30 דקות כל אחד. בהתאם לגודל של הרקמה, זמני כביסה יכולים להיות ירידה עד 10 דקות או עלו ל 1 שעה.
3. מייבש עוברים על ידי שטיפה בסדרת אתנול של 25%, 50% ו 75% אתנול: PBS נדנדה בטמפרטורת חדר. שוב, הזמן לכל שטיפה יהיה תלוי בגודל של הרקמה. במשך ³ רקמות סנטימטר 0.5, דגירה כל שטיפה במשך 15 דקות. הגדל את משך זמן לחתיכות גדולות. אם אחסון לטווח ארוך של רקמה הוא רצוי, לשטוף פעמים נוספות באתנול וחנות 75% ב-20 מעלות צלזיוס למשך עד שנה אחת. אחרת להמשיך לשלב הבא.
4. בהמשך מייבש על ידי שטיפת 3 פעמים באתנול 100% במשך 15 דקות כל אחת, מתנדנדת.

2. פרפין והטבעה של קטגוריות קיימים

1. להבהיר רקמות על ידי שטיפת 2 פעמים בקסילן למשך 5 דקות כל אחד בבקבוקוני זכוכית scintillation עם מכסים מתברגים. קסילן יהפוך את הרקמה שבירה, ולכן לא תעלה על סך של 10 דקות להיוהס. הרקמה צריכה להיראות שקופה כשמחזיקים אותו עד אור. אם הרקמה היא עדיין מאוד אטומה אחרי שתי הכביסות, לעשות שטיפה נוספת בקסילן למשך 5 דקות ולאחר מכן להמשיך בפרוטוקול. לטפל רק קסילן בתוך מנדף עם כפפות.
2. הסר קסילן ולמלא את בקבוקון נצנץ מלא 2/3 עם פרפין המותך. דגירה בתנור ° C 60 למשך 30 דקות. כאשר לשים פרפין לתוך הבקבוקון, תבחין פרפין לחזק צדי הבקבוקון. הנח את הבקבוקון בתנור ולאפשר לפרפין מחדש להתמוסס לכמה דקות. קח את הבקבוקון מהתנור ולתת הפתרון מהירה למערבולת לערבב ולהחליף בתנור למשך שארית דגירה.
3. פרפין חזור incubations עוד פעמים למשך 30 דקות.
4. הדגירה בפרפין פעמים לשעה כל אחד. שינוי פרפין פעם אחרונה, ודגירת הלילה בתנור ° C 60.
5. למחרת, הנח את הרקמה בחדר מחומם פרפין אמבטיה ומקום תחת ואקום ל2-3 שעות. זה יקל על החדירה של פרפין לתוך הרקמות ולהסיר את כל בועות אוויר. עבור סוגים מסוימים של רקמה דקה, צעד ואקום לא ייתכן שיידרש, אבל זה הכרחי לעוברים שלמים או במערכת עיכול ואיברים אחרים עם תאים של אור.
6. לאחר ואקום הקל חדירה של רקמות, רקמות מקום בתבנית מתכת עם פרפין מומס, ומצנן על צלחת קרח. השאר על קרח או ב 4 ° C למשך הלילה לפני שאתה מנסה להסיר את הרקמה מהעובש. בלוקי פרפין של רקמה ניתן לאחסן ללא הגבלה ב 4 ° C.
7. בלוק המקום פרפין על microtome ולחתוך 8 סעיפי מיקרומטר. סעיפים צריכים להיות צף על אמבט מים המחוממים ל 48 מעלות צלזיוס ומותקנת על גבי זכוכית Superfrost * שקופיות פלוס.
8. מגלשות יבשות לילה בתנור ° C 37.
9. סעיפי חנות ב 4 ° C עד צורך.

ג. Alcian כחול / אדום מהיר גרעיני כתם של רקמות Elasmobranch

1. Alcian כתם הכחול לMucins

1. מקום מחליק עם קטעים פונים כלפי מעלה בשקופית חמה יותר. ממסים למשך 45 דקות.
2. מקום מחליק לתוך החזיק שקופיות. כל הפתרונים הנובעים מכך, כלולים באמבטיות בתוך מנדף. שקופיות נשטפות בהעברתם מאמבטיה אחד עם פתרון לאחר. ודא כי רמות הפתרון באמבטיות מכסות את השקופיות; הרקמות על השקופיות שקועות לחלוטין. להמס פרפין על ידי שטיפת שקופיות 2 פעמים בקסילן למשך 5 דקות כל אחד.
3. שטוף את השקופיות פעמים עם אתנול 100% לכל 1 דקות.
4. Rehydrate שקופיות בסדרת אתנול (75%, 50%, אתנול 25%) כביסה בכל פתרון לדקות 1. שטוף בDH ₂ O לדקות 1.
5. כתם הכחול בפתרון Alcian, 2.5 pH למשך 15 דקות.
6. לפתח כתם על ידי שטיפה במים זורמים לברז 3 דקות. לטבול פעם אחת בDH ₂ O.
7. Counterstain בפתרון Counterstain גרעיני המהיר אדום למשך 10 דקות.
8. לשטוף במים זורמים לברז 3 דקות ולטבול בזמן DH ₂ O 1.
9. Dehydrate בסדרת אתנול (25%, 50%, 75%, 100%, 100%) במשך 20 מטבלים כל אחד, או 1 דקות כל אחד. לשטוף 2 פעמים בקסילן למשך 5 דקות כל אחד. הר עם מדיום וcoverslips הרכבת dpx. לאפשר הרכבה בינונית עד יבש ולהתקשות ל48 שעות במנדף לפני מניפולצית שקופיות.

תוצאות

דוגמאות לכתמים כחולים alcian באזורים שונים של L. מערכת עיכול erinacea מוצגת באיור 2. mucin חומצה המכיל תאי globlet הם נראים בבירור על ידי alcian כתם הכחול לאורך מערכת העיכול. חלוקת mucins חומצה שונה באזורים השונים של מערכת העיכול, ובכך הוא משקפת הבדלים בתפקוד. mucins חומצי...

Discussion

הפרוטוקולים שהוצגו הם שיטות קלסיות לניטור ביטוי גנים וזיהוי סוגי תאים מובחנים, והותאמו לשימוש בelasmobranchs הימי. שינויים נוספים של פרוטוקולים אלה עשויים להיות נחוצים כדי להסתגל למיני elasmobranch שונים.

הדאגה הנפוצה ביותר לגבי כל הר רנ"...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 x transcription buffer	Roche	11-465-384-001
DIG-RNA labeling mix	Roche	11-277-073-910
RNAse inhibitor	Roche	03-335-399-001
RNA polymerase - SP6	Roche	10-810-274-001
DNAseI, RNAse-free	Roche	10-776-785-001
Yeast RNA	Invitrogen	15401-029
CHAPS	EMD-Millipore	220201
heparin	Sigma-Aldrich	H4784
DEPC (diethyl pyrocarbonate)	Research Organics	2106D
Moria Perforated Spoon	Fine Science Tools	10370-17
Netwell inserts	Electron Microscopy Sciences	64713-00	Netwells for use in 6-well tissue culture dishes
6-well tissue culture plate	Corning	3516
Glass scintillation vials with screw-cap lids	Weaton Science Products	986540
formamide	Fisher	BP227500
Proteinase K	Invitrogen	59895 (AM2542)
NBT		11585029001
BCIP	Roche	11585002001
Hydrogen peroxide, 30%	EMD	HX0635-1
Sheep serum	VWR	101301-478
glutaraldehyde	Sigma-Aldrich	G5882
tRNA	Roche	10-109-541-001
Anti-DIG Fab Fragments	Roche	1137-6623
Table 3. Reagents and equipment for RNA whole mount in situ's.
1% Alcian Blue 8GS, pH 2.5	Electron Microscopy Sciences	26323-01
Nuclear Fast Red	Electron Microscopy Sciences	26078-05
DPX Mountant	Electron Microscopy Sciences	13510
Paraffin (Paraplast X-tra)	McCormick Scientific	39503002
10% Formalin, NBF	VWR	95042-908
Glass scintillation vials with screw-cap lids	Weaton Science Products	986540
Stainless steal base molds	Tissue-Tek	4161-4165	Multiple sizes available.
Cassettes	Tissue-Tek	4170
Slide warmer	Fisher-Scientific	12-594Q
Tissue Embedder	Leica Microsystems	EG1160
Microtome, rotary	Leica Microsystems	RM2235
Tissue-Tek Slide Staining Set	Electron Microscopy Sciences	62540-01
Tissue-Tek 24-Slide Holder	Electron Microscopy Sciences	62543-06
Superfrost*Plus slides	Fisherbrand	12-550-17
Table 4. Reagents and equipment for Alcian Blue stain.