באמצעות PCR כמוני בזמן אמת לקביעת engraftment תא התורם במודל תחרותי Murine מח עצם השתלה

Summary

קביעת engraftment תא התורם מציגה אתגר במודלי עכבר השתלות מח עצם שאין מוגדרים היטב סמני phenotypical. אנו תארנו המתודולוגיה לכמת engraftment תא התורם גברי בעכברי השתלה נשיות. שיטה זו ניתן להשתמש בכל זני העכבר לחקר פונקציות HSC.

Abstract

מודלי השתלת מח עצם Murine לספק כלי חשוב במדידה סלולרית פונקציות hematopoietic גזע (HSC) וגנים הקובעים / מולקולות המווסתות HSCs. במערכות מודל השתלות אלה, הפונקציה של HSCs נקבעת על ידי היכולת של תאים אלה נקלטים ולגבש מחדש עכברי נמען קטלני מוקרנים. בדרך כלל, התרומה / engraftment התא התורם נמדד על ידי נוגדנים לחלבונים בתא שטח תורם ספציפי באמצעות cytometry זרימה. עם זאת, שיטה זו תלויה במידה רבה על הספציפיות ואת יכולתו של סמן תא השטח כדי לבדל תאי תורם המופקים מתאי נמען מקורם-, אשר עשוי שלא להיות זמין עבור כל הזנים של העכברים. בהתחשב ברקע השונה של זני עכבר מהונדס גנטי בשוק, משטח זה תא / זרימת cytometry שיטה מבוססת יש מגבלות משמעותיות במיוחד בזני עכברים שאין סמנים מוגדרים היטב על פני שטח לתורם בתאים נפרדים מcongenic הנמען ceLLS. כאן, אנו מדווחים טכניקת PCR מבוססת כדי לקבוע engraftment / תרומת התא התורם בעכברי השתלה. אנו הושתלנו HSCs מח עצם התורם גברים לנקבות העכברים congenic קטלני מוקרנים. דגימות דם היקפיות נאספו בהשתלת הודעה שונה נקודתי זמן. דגימות מח עצם התקבלו בתום הניסויים. הדנ"א הגנומי היה מבודד וגן כרומוזום Y הספציפי, Zfy1, הוגבר שימוש בזמן אמת PCR כמותית. Engraftment של תאים זכריים תורם המופקים בעכברי הנמען הנשים חושב על עקומת סטנדרט עם אחוז ידוע של גברי DNAs לעומת נקבה. Bcl2 שמש גן התייחסות לנרמל את כמות הדנ"א המוחלטת. הנתונים שלנו הציעו כי גישה זו אמינה קובעת engraftment תא התורם ומספקת שיטה יעילה, פשוטה אך במדידת הכינון מחדש של תאי hematopoietic במודלים של השתלת מח עצם Murine. השיטה שלנו יכולה להיות מבוצעת באופן שגרתי ברוב המעבדות כי אףציוד יקר כגון cytometry זרימה נדרש.

Introduction

מודל Murine מח עצם (BM) השתלה פותח לראשונה ב -1960 ^1. דגם זה כבר נעשה שימוש נרחב לחקר התא תורם גזע hematopoietic (HSC) בביולוגית עכבר נמען מארח. מודל השתלת מח העצם Murine ספק לנו ידע רב ערך על פונקציות HSC והרגולציה שלהם והכרחי במחקר HSC. מודל allogeneic השתלת מח עצם כמו C57Bl/6J ^H2B-BALB / C ^H2d או מודל ההשתלה congenic כמו C56Bl/6J ^{CD45.2-B6.SJL CD45.1} משמש במעבדות רבות כדי ללמוד את תפקוד הגן על פעילות HSC ^2, השפעה של טיפול תרופתי על תפקוד ³ או השתלת HSC מחלות נלוות כגון מחלת שתל נגד מארח (GVHD) ^4.

סמנים בתא שטח כגון haplotype MHC או CD45.1 משמשים בדרך כלל לתאים מייחדים תורם הנגזרים מתאי נמען מקורם-. C57Bl/6J ^{H2B, CD45.2} , BALB / C ^H2d וB6.SJL ^CD45.1 הם זני העכבר הנפוץ ביותר בהשתלת מח עצם, כי תרומת התא התורם ניתן להעריך בקלות על ידי הזרימה cytometry מדידת CD45.1 לעומת CD45.2 או H2B לעומת H2d. עם זאת, זנים רבים אחרים, כגון FVB / ניו ג'רזי ⁵ ו C3H הם גם משמשים לעתים קרובות כדי לייצר מהונדסים בהנדסה גנטית או עכברים בנוקאאוט. עכברים אלו ניתן backcrossed לקו לדה ומתוחזק ברקע מעורב גנטי / MHC. במקרים אלה, קביעת engraftment תא תורם ותפקוד HSC יכולה להיות קשה כסמני שטח ספציפיים בתאים תורמים לא יהיו זמינים.

באמצעות בדיקת כרומוזום Y-DNA ספציפית כדי לזהות את תאי תורם גברים על ידי כתם דרומי בהשתלת מח עצם מין חוסר התאמה שפותח לראשונה על ידי הקבוצה של ד"ר Miwa ^6. ואז, PCR בזמן אמת לקביעת מין האזור Y-נמצא שיטה מדויקת וספציפית מאוד לכמת maתאים עובריים le במערכת הדם האם ^7. רעיון זה אומץ על ידי קבוצתו של ד"ר Schwarzenberger לפיתוח של טכניקה בזמן אמת PCR במודל עכברי השתלת מח עצם כדי לקבוע engraftment התא התורם ^8. אנחנו שונים בשיטה זו נוספת למדידת engraftment תא התורם במודל FVB / ניו ג'רזי עכבר השתלת מח עצם. שיטה זו כיום שימוש נרחב בקבוצה שלנו ללימוד התפקיד של Pim1 קינאז בביולוגית HSC.

Protocol

1. בידוד תאי מח עצם

1. להרדים תורמים עכברי FVB / ניו ג'רזי ועכברים ממין נקבת FVB / ניו ג'רזי באמצעות שיטת ₂ CO ואחרי עקירת צוואר רחם זכרים. התאים הנקביים FVB / ניו ג'רזי מח העצם ישמשו כתאים תחרותיים.
2. השתמש במספריים ומלקחיים קטנים, לנתח את עצמות ירך וtibiaes מעכברים ולמקם אותם בצלחת תרבית רקמה 60 מ"מימ המכילה 6 מ"ל קר כקרח RPMI1640 עם FBS המומת חום 5%. השתמש רקמת kimwipe להסיר שרירים ורקמות אחרות. חותך את שני הקצוות של כל פיר עצם בצלחת.
3. חבר את הקצה של העצם עם מחט 23 ז במזרק סמ"ק 3, לשטוף את מח עצם עם RPMI1640 עם FBS המומת חום 5% למנה. Disaggregate רקמות מוח עצם על ידי שאיפות חוזרות ונשנות תוך שימוש באותה המחט. להעביר את השעית התא לצינור צנטריפוגה מ"ל 15.
4. ספין למטה התאים למשך 5 דקות ב 400 XG, להסיר את supernatant, resuspend התאים ב1 מ"ל של חיץ טמפרטורת חדר תאי דם אדום תמוגה (155 mM pיקרבונט otassium, כלוריד אמוניום 10 מ"מימ, 0.1 מ"מ של EDTA, pH = 7.4) ו דגירה בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות ואז להוסיף 5-10 מ"ל של RPMI 1640 עם FBS המומת חום 5%.
5. להעביר את התאים דרך מסננת תא. לאסוף את הזרימה דרך לצינור חדש. ספין למטה למשך 5 דקות ב 400 x גרם. הסר את supernatant; תא הגלולה לא תכיל כל צבע אדום. היעדר הצבע אדום מציין הסרה מלאה של תאי דם אדומים. Resuspend התא גלול ב 10 מ"ל של RPMI1640 עם FBS המומת חום 5%. מערבולת בעדינות כדי לוודא השעית התא היא אחידה לחלוטין. קח aliquot וספירת התאים בhemacytometer. לחשב כמה נפח של תאים הנחוצים להשתלת מח עצם ומספיק תאי aliquot ולערבב תאי תורם גברים עם תאים נקביים מתחרים ביחס 05:02. ספין למטה למשך 5 דקות ב 400 XG, לשטוף עם PBS, resuspend ב PBS עם הריכוז הסופי של תאי תורם ב5 × 10 תאים ⁶ / מ"ל ומתחרה ב2 × 10 ⁶ / מ"ל.

2. השתלת מח עצם תחרותית

1. עכברים ממין נקבה להקרין נמען (8-12 wks גיל) עם רדיאטור קרני גמא 137Cs במנה אחת של 4-6 שעות 11Gy לפני השתלת מח עצם.
2. הנח את נקבות עכברים המוקרנים בעוצרים עכבר. הזרק תורם המעורב ותאים מתחרים דרך וריד זנב ב0.1 מ"ל של נפח באופן שכל עכבר מקבל 5 × 10 ⁵ תאים תורמים ו2 × 10 ⁵ תאי מח עצם מתחרה מוחלט.

3. אוסף מדגם

שבועות זוגות לאחר השתלת מח עצם, לאסוף דגימות דם היקפיות (~ 50 μl) מעכבר נמען נשי על ידי דימום רטרו מסלולית בתנאי הרדמה. דגימות נאספות לתוך צינורות מצופים EDTA. דגימות BM יכולות גם להיות שנאספו בסוף הניסוי, לפחות 4 חודשי השתלת הודעה בדרך כלל, עם את הנוהל כמו שתואר קודם (שלב 1);% בדרך כלל 20-40 של1 תאי BM שוקה הם מספיק לעשות מספיק כמות של ה-DNA. דגימות דם או BM מגיל עכברים נורמלים נקביים וזכריים מתאימים גם נאסף להכין עקומת סטנדרט.

4. בידוד הדנ"א הגנומי

1. הוסף 4 × נפח של טמפרטורת חדר RBC תמוגה חיץ (~ 200 μl) לכל דגימת דם. מערבב היטב ודגירה בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות. הוסף 1 מ"ל של PBS, אז ספין למטה כדי להסיר את רוב RBC lysed.
2. בודד דנ"א באמצעות ערכת חילוץ דנ"א דם (ערכת חילוץ דם DNA QIAmp). החיץ טרום החם elution (ע"א) על 37 מעלות צלזיוס כדי לשפר את התשואה של דנ"א eluted. DNAs זכר ונקבה לעקומת סטנדרט מבודד באופן דומה.
3. (אופציונלי) הדנ"א הגנומי יכול להיות מטוהר נוסף או מרוכז בשיטת משקעי EtOH בנוכחות נתרן יצטט M 3 (pH = 5.5). את כדורי DNA מכן resuspended במים מזוקקים 40-50 μl לניתוח באופן מיידי או מאוחסנים ב -20 ° C לשימוש עתידי.
4. מדוד את ה-DNA concentration עם פוטומטר הספקטרום Nanodrop ND-1000. דגימות עם OD 260/280 בין 1.8-2.0 משמשות לניתוח נוסף.
5. דלל DNA עם DNAase החופשי H ₂ O ל4ng/μl בהיקף כולל של 50 μl.

5. הכנת עקומת סטנדרט

דלל DNA הגברי והנשי DNA לריכוז של 4 ng / μl, ולהפוך את תערובת ה-DNA על פי הטבלה 1

% של ה-DNA הגברי ברקע נקבה	נפח (μl) של ה-DNA הגברי 4ng/μl	נפח (μl) של ה-DNA הנשי 4ng/μl	נפח כולל (μl)
0.2	1	499	500
0.5	1	199	200
2.5	5	195	200
12.5	25	175	200
50	100	100	200
87.5	175	25	200
100	200	0	200

טבלת 1. הכנת דוגמאות לעקומת סטנדרט. עכברי זכרים ונקבה רגילים FVB / ניו ג'רזי בגיל 8-12wks הוקרבו. תאי דם וBM נאספו. DNAs מתאים זכריים ותאים נקביים היינו מבודד ומחדש הושעה-בריכוז של 4ng/μl. את DNAs הזכר והנקבה היה מעורב ביחסים שונים על מנת ליצור את התערובות הסטנדרטיות מדגם DNA.

6. בזמן האמת PCR

1. הגדר את צלחת תגובת PCR על ידי ערבוב ירוק מגיב SYBR supermix עם פריימרים וDNA גנומי. נפח הריאקציה (20 μl) מכיל 400 ננומטר של כל מאיץ ו5 μl של הדנ"א הגנומי תאי דם (μl X5 4ng/μl = 20 ng) בכל תגובה. דנ"א sampהלס וסטנדרטים הוקמו בשלושה עותקים. הרצפים של primers מוצגים בטבלה 2.

שם גן	קדימה	הפוך
Bcl2	5'-AAGCTGTCACAGAGGGGCTA	5'-CAGGCTGGAAGGAGAAGATG
Zfy1	5-TGGAGAGCCACAAGCTAACCA	5'-CCCAGCATGAGAAAGATTCTTC

טבלת 2. רצף פריימר RT-PCR לBcl2 העכברי וZfy1.

2. מבצע תגובת PCR שימוש במכשיר ה-PCR Biorad iQ5 בתנאים הבאים: 95 ° C 3 דקות, 42 מחזורי ההגברה של 95 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות, 58 מעלות צלזיוס למשך 25 שניות ו 72 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, ואחרי התכה עקומה צעד.
3. השג סף ערכי מחזור (CT) על ידי מערכת Bio-Rad iQ5 2.1 Standard Edition אופטית. החישוב δCt (CT ^{Zfy1 <}/ Sup>-CT ^Bcl2) ערך, ורמת הביטוי Zfy1 מחושבת כערך של ^{Ct 2-δ.}
4. להקים עקומות סטנדרטיות עבור כל סדרת תגובה באמצעות קריאה ^2-δCt מתערובות ידועות גברים / נשים רגילות. העקומות הרגילות נוצרות על ידי קשירת קשר ערך הממוצע של ^2-δCt של triplicates ל% DNA הגברי הידוע בתערובת עם הולם רגרסיה לינארית.

תוצאות

איור 1 ו 2 הראו דוגמאות לעקומות סטנדרטיות זממו עם ערכים ממוצעים של ^2-δCt נגד אחוזי DNA הגברי. האיור 1A הראה טמפרטורת התכה ספציפית לBcl2 וZfy1 amplicons מותאם ב78.5 המעלות צלזיוס ו88.5 ° C, בהתאמה. Bcl2 משמש כגן התייחסות לנרמל את הסכום הכולל של ה-DNA הטעון בכל תגובת PCR....

Discussion

מטרת המחקר הנוכחי שלנו היא לספק לקהל טכניקה מבוססת PCR לכמת engraftment תא התורם במודל תחרותי עכברי מח עצם השתלה. מספר מחקרים שדיווחו על השימוש בRT-PCR לזיהוי תאי תורם במודלי השתלה ^9-10. קבוצתו של ד"ר Schwarzenberger פותחה לראשונה מודל עכברי השתלת מח עצם באמצעות PCR בזמן אמת כדי ל...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם המגיב	חברה	מספר קטלוגים	תגובות (אופציונלי)
RPMI 1640	Hyclone	SH30255.01
FBS	Invitrogen	16140-017	חום מומת
אמוניום כלוריד	חבר הפרלמנט Biomedicaals	194806
יקרבונט אשלגן	דיג	P184-500
QIAamp DNA הדם MINIKIT	Qiagen	51106
מסננת תא	BD מדעי חיים
iQ SYBR הירוק supermix	Biorad	170-8882
מכונת ה-PCR בזמן אמת iQ5	Biorad
ספקטרה פוטומטר	Nanodrop ND-1000	ND-1000