הכנת Liposome ענקית הדמיה ותיקון מהדק Electrophysiology

Summary

בנייה מחדש של חלבונים בממברנה פונקציונליים ליפוזומים ענקים של הרכב מוגדר היא גישה רב עוצמה בשילוב עם electrophysiology תיקון מהדק. עם זאת, ייצור liposome ענק קונבנציונלי עשוי להיות בקנה אחד עם יציבות חלבון. אנו מתארים פרוטוקולים לייצור ליפוזומים ענקים משומנים טהורים או ליפוזומים קטן המכיל תעלות יונים.

Abstract

הכינון מחדש של תעלות יונים בממברנות שומנים בדם הגדרה כימית להקלטת אלקטרו כבר טכניקה רב עוצמה כדי לזהות ולחקור את תפקודם של החלבונים החשובים אלה. עם זאת, הכנות הקלסיים, כגון bilayers מישוריים, להגביל את המניפולציות וניסויים שניתן לבצע בערוץ המשוחזר וסביבת הקרום שלה. מבנה דמוי תא יותר ליפוזומים ענקים מתיר ניסויי תיקון-מהדק מסורתיים מבלי להקריב את השליטה בסביבת השומנים בדם.

Electroformation הוא ממוצע יעיל כדי לייצר ליפוזומים ענקים> 10 מיקרומטר בקוטר אשר מסתמך על היישום של מתח חילופין לסרט שומנים רזה, מסודר שהופקד על פני האלקטרודה. עם זאת, מאחר שהפרוטוקול הקלסית קורא את השומנים שיופקדו מממסים אורגניים, זה לא תואם עם חלבונים בממברנה פחות חזקים כמו תעלות יונים וחייב להיות שונה. לאחרונה, יחסי ציבורotocols פותחו כדי electroform יפוזומים ענקים מיפוזומים קטנים באופן חלקי מיובשים, שיש לנו להתאים ליפוזומים המכילים חלבון במעבדה שלנו.

אנו מציגים כאן את הרקע, ציוד, טכניקות, ואת החסרונות של electroformation של יפוזומים ענקים מתפוצות liposome קטנות. אנחנו מתחילים עם הפרוטוקול קלאסי, שאמורה להיות שולטים ראשון לפני שתנסו את הפרוטוקולים מאתגרים יותר שבאים אחרי. אנו מדגימים את התהליך של התייבשות חלקית מבוקרת של שיווי משקל ליפוזומים קטנים באמצעות אדים עם פתרונות מלח רוויים. לבסוף, אנחנו מדגימים את התהליך של electroformation עצמו. נתאר ציוד פשוט, זול, שיכול להתבצע בבית כדי לייצר ליפוזומים באיכות גבוהה, ולתאר בדיקה ויזואלית של ההכנה בכל שלב כדי להבטיח את התוצאות הטובות ביותר.

Introduction

ליפוזומים ענקים (הנקרא לעתים קרובות שלפוחית ​​unilamellar ענקית, או GUVs) יש בעיקר נעשו שימוש כדי ללמוד את הפיזיקה וכימיה פיסיקלית של bilayers שומנים, כולל מחקרים של עיוות bilayer, דו קיום שלב לרוחב ("רפסודות"), איחוי קרום, וכו ^'1-4. יש להם מבנה גס דמוי תא: מעטפת כדורית של קרום המקיפה פנים מימיות אשר יכול בקלות להתבצע שונה מהמאגר הימי שמסביב. הם, בהגדרה, ≈ 1-100 מיקרומטר קוטר, כך שהם יכולים להיות צילמו באמצעות מגוון של גישות אור מיקרוסקופית. הם יכולים להתבצע באמצעות מתוחים הדרגתיים אוסמוטי או מתח מיושם באופן מכאני, כך שבדרך כלל תוך רכה, ניתן להשפיע המאפיינים שלהם לטיפול קל. בפרט, שליטה על "הקשיחות" של liposome עושה את זה פשוט כדי ליצור תיקונים "liposome-מצורפים" או נכרת לאלקטרופיזיולוגיה. בעבר, הכינון מחדש ערוץ יון בוצע בעיקר בסעיף ב 'שומנים מישורייםilayers. עכשיו, היכולת ליצור כתמים מיפוזומים ענקים ולהשתמש אשפה מבוטלת של כלים שפותחו עבור electrophysiology הקונבנציונלי (מיקרוסקופ פלואורסצנטי, שאיפת micropipette, זלוף המהיר ובקרת טמפרטורה, וכו ') גורמת ליפוזומים ענקים אטרקטיבית יותר ויותר עבור לימודי כינון מחדש ^5,6.

ליפוזומים ענקים שנעשו על ידי אסטרטגיות רבות. למעשה, ליפוזומים ענקים בצורה ספונטנית על ידי תהליך נפיחות כאשר סרט שומנים בדם מיובש הוא rehydrated ^4,7,8. התשוקה במהירות רבה יותר כדי להכין גדולים יותר, אחידים יותר ליפוזומים הביאו את החוקרים לגישות אחרות, ובראשם electroformation ^1,9. Electroformation גם מסתמך על הידרציה של סרט שומנים בדם מיובש, אבל מאיץ את התהליך באמצעות היישום של שדה חשמלי על פני נדנוד סרט השומנים בדם. תחום מיושם באמצעות שתי אלקטרודות, או חוטי פלטינה או שקופיות זכוכית מצופים אינדיום בדיל תחמוצת (איטו), מופרד על ידי מים אוהמאגר ואליו השומנים מופקדים. נהיגה במהירות מופרזת על ידי הנפיחות של יפוזומים, אחד משיג תשואה גבוהה יותר של יפוזומים גדולים יותר. לפיכך, electroformation הפך שיטת ברירת המחדל כדי לייצר ליפוזומים ענקים ^4.

המנגנון של electroformation לא מובן לחלוטין, ורוב הפרוטוקולים שפותחו באופן אמפירי (למשל ^10,11). יחד עם זאת, אנו יכולים ללמוד קצת על מה לצפות על ידי בהתחשב בתאוריה וכמה תוצאות אמפיריות. הוא האמין נרחב כי electroformation מתרחש על ידי הנהיגה זרימת אלקטרו האוסמוטי של חיץ בין bilayers שומנים הבודדים שנערמו בסרט השומנים הופקד ^10,11. צימוד אלקטרוסטטית לתנודות תרמיות של bilayers השומנים הוא כנראה מעורב גם ^12. השערות אלה לחזות איכותי גבולות עליונים לתדר השדה החשמלי וכוח שניתן להשתמש בי ^10,12. בפרט, הוא נבאה פתרונות מוליכות גבוהים ש( פתרונות מלח פיסיולוגיים כלומר מ ') להפחית את כוחות electrohydrodynamic שעשוי ליזום electroformation liposome ^12. ספיקות Electroosmotic בדרך כלל יורדות עם הגדלת ריכוז המלח והגיעו לשיאו בתדירות גבוהה בתדירות כלשהי תנודת שדה חשמלית (לדוגמה אם כי בגיאומטריה שונה, הירוק ואח'. ^13). לכן, עוצמות שדה גבוהות יותר ותדרים גבוהים יותר הם סבירות לפתרונות מוליכות גבוהים, בגבולות ^10.

עם זאת, חלבוני קרום עשויים להיות בקנה אחד עם שיטת הרגילה של הפקדת שומנים על גבי אלקטרודות להליך electroswelling, כלומר בממסים אורגניים אשר לאחר מכן התאדו לעזוב את סרט שומנים בדם דק. ישנם שני מסלולים עיקריים סביב קושי זה: לשלב חלבונים לאחר היווצרות liposome ענקית, או להתאים את האופן שבו השומנים מופקדים. הגישה שלנו בונה על אחרים ^5,11 להפקיד את השומנים וreconstituted חלבון קרום יחד מהשעיה של "proteoliposomes" קטן או גדול. אנו מתארים את התהליך הארוך ומאתגר יותר של ייצור proteoliposomes ממטוהרי חלבון ושומנים במקומות אחרים (וקולינס גורדון, בסקירה). כאן אנו מתארים את הפרוטוקול בהיעדרו של כל חלבון, אבל זה אותו הדבר כאשר החלבון משולב; אנו כוללים תוצאות מראות כי proteoliposomes המכיל יון הערוץ TRPV1 ניתן להפוך GUVs ומשמש לתיקון מהדק electrophysiology. בכל גישת electroformation, בדיקה ויזואלית של מדגם השומנים במהלך תהליך הדחת השומנים בדם היא קריטית להצלחה.

הגישה שלנו עשויה להיות רלוונטית מעבר ליישום מיוחד לכינון מחדש תעלת יונים. בזמן מאז שפותחנו לראשונה פרוטוקול זה ועכשיו, יש לו גם הראה כיצד אופן שבו שומנים מופקדים על אלקטרודות לelectroformation משפיע ההטרוגניות ההלחנה של GUVs כתוצאה מכך. Baykאל Caglar et al. הראה כי ¹⁴ GUVs נוצר בזהירות ליפוזומים המיובשים הייתה וריאציה קטנה יותר פי 2.5 בטמפרטורת המעבר של miscibility GUVs נוצר מתערובות של פוספוליפידים וכולסטרול שונים. העבודה שלהם מצביעה על כך ששומנים וכולסטרול במיוחד נמהר, במאי מתערובת השומנים בדם, כאשר הופקדו מממסים אורגניים, וכתוצאה מהווריאציה המרחבית גדולה בהרכב של סרט השומנים שהופקד. זה חשוב במיוחד ללימודים של התנהגות שלב קרום שומנים בדם, אך הוא עשוי להיות גם קריטי לניסויים כמותיים על תפקוד תעלת יונים. Baykal-Caglar אח' 's. פרוטוקול הוא דומה אך לא זהה לזו שלנו, ואנו מעודדים את קוראים ללמוד אותו גם כן.

פרוטוקול זה (ראה סקירה, איור 1) הוא אחד מרבים שיכולים להיות בשימוש. בהצלחת electroformation עיקרון תלויה בתערובת השומנים בדם, לחות, טמפרטורה, מומסים אחרים (בעיקר יונים), ושלכמובן מתח ותדר בשימוש במבנה. כelectroformation הופך להבין טוב יותר, אנו מצפים לשפר את הפרוטוקול שלנו יותר.

לבסוף, לעתים קרובות יש עקומה למידה תלולה בelectroforming יפוזומים ענקיים. אנו ממליצים מאסטרינג פרוטוקול המקובל (סעיפים 1 ו -4, ואם יש צורך, סעיף 5) לפני שלומדים להפקיד שומנים מהשעיות liposomal (סעיפים 2-5).

Protocol

1. בתצהיר של שומנים מממסים אורגניים: פרוטוקול הקלסית

1. הסר שומנים מהאחסון ב -20 ° C או -80 מעלות צלזיוס; חם לRT זהירות:. שומנים מאוד hygroscopic, ורבים מהם רגישים לחמצן. לכסות שומנים בארגון יבש או גז חנקן ובכל הצעדים לצמצם את החשיפה לאוויר.
2. במידת צורך, להשעות את השומנים בכלורופורם או cyclohexane ב1-10 מ"ג / מ"ל; לציין כי הריכוזים המוצהרים של היצרן הם בדרך כלל נומינליים בלבד זהירות: ללבוש כפפות מתאימות וציוד מגן אישי אחר בעת שימוש בממסים אורגניים.. הסר PPE במהירות אם הוא נשפך על הממס, כמו רוב החומרים עדיין חדירים לממסים אלה והם מספקים הגנה זמנית בלבד.
3. יש לנקות את שני הצדדים של שתי 25 x 37.5 מ"מ שקופיות איטו מצופה זכוכית עם אתנול
4. מערבבים את השומנים כדי להשיג את היחסים הטוחנים הרצויים. עבור כל ס"מ 1 ² של שטח של איטו מחליק להיות מצופים עם שפהid, לערבב ~ מיקרוגרם 15-20 של שומנים. לדוגמה, אם שתי שקופיות 25 מ"מ x 37.5 היו להיות מצופה במלואו, היינו משתמש בדרך כלל 30 μl של 10 מ"ג / מיליליטר תערובת שומנים בדם. הערה: להוסיף 0.1% מול טקסס אדומה DPPE עבור דימות פלואורסצנטי, וראה להלן מזהירה על צבעי ניאון.
5. ודא שהצד המצופה איטו משקופיות הזכוכית הוא פונה כלפי מעלה על ידי מדידת התנגדות המשטח עם מד התנגדות או מודד.
6. לשאוב את השומנים לתוך מזרק זהירות ממס עמיד:. לא דבקים או פלסטיק, חוץ מPTFE, צריך ליצור קשר עם הממס אורגני.
7. עם מחט המזרק לא ממש נגיעה במשטח איטו, להחיל השומנים הזזת המחט קדימה ואחורה על פני השקופית לאט. לכסות את פני השטח בצורה שווה, מחפש "קשת ברק" על משטח הזכוכית.
8. מניחים את השקופיות במהירות תחת <1 טור (מ"מ כספית 1) ואקום ל0.5-1 שעות כדי להסיר כל זכר ממס. לשחרר את הוואקום בגז אינרטי.
9. החלת אטם סיליקון, עםשכבה דקה של שומן ואקום סיליקון משני הצדדים. להשאיר לפחות 5 מ"מ של שקופית חשפו נחשפה בקצה אחד של השקופית.
10. פנה מייד לסעיף 4.

2. הכנת Liposome קטנה להתייבשות מבוקרת

1. מכין את תערובת השומנים בדם כמו בצעדים 1.1-1.4.
2. ייבש את השומנים באמצעות זרם של ארגון או גז חנקן בצינור בקוטר 10-15 מ"מ תרבות. לכמויות קטנות של שומנים, ≤ 0.5 מ"ג, סרט כתוצאה מכך יכול להיות התייבשות מייד לאחר הצבתו תחת ואקום עבור 0.5-1 שעה להסיר ממס שיורי; המשך לשלב 2.5. כמויות גדולות יותר של שומנים בדם נוטות ללכוד ממסים אורגניים בג'ל סמיך, אפילו תחת ואקום, ומוכנים טוב יותר על ידי lyophilization; לראות צעדים 2.3-4.
3. להשעות את סרט השומנים בדם המיובש בcyclohexane, מכסה בארגון וחותם עם פקק, הנח את הצינור בבלוק והקפאה קרים ב -80 מעלות צלזיוס למשך מינימום שעה 1.
4. מניחים את הגוש הקר ומדגם שומנים במערכת ואקוםמסוגל להגיע 100 mTorr. החל ואקום, זה יהיה "דוכן" בכ -1 טור כsublimes פעמי ממס. ואקום ברגע שהממס נמחק לחלוטין (~ 1 שעות) יהיה ירידה מתחת לרמה זו. לשחרר את הוואקום בגז אינרטי ולאטום את הצינור או מימה באופן מיידי.
5. בעוד השומנים הם תחת ואקום, מאגר לחות דגה באמצעות ואקום ותזת ^15-17.
6. מימה השומנים באמצעות חיץ degassed בגמר ריכוז 1-10 מ"ג / מ"ל. לאפשר את השומנים למימה לאט. לאחר 30 דקות, 1 שעות, מערבולת כדי לשבור את הגושים שנותרו. חכה 0.5-1 שעות נוספות כדי לאפשר ללחות מוחלטת. השתמש osmoticant, כגון סורביטול או סוכרוז עד 200 מ"מ, על מנת למנוע התייבשות מוחלטת בשלבים הבאים.
7. היכונו ליפוזומים 100-200 ננומטר בקוטר של חול. ראה פרוטוקול שחול של היצרן לפרטים נוספים. שים לב שחייב להיות החיץ פחות מ ~ 25 מ"מ חוזק יוני, או פרוטוקולי מתח electroformation מיוחדים יהיה צורך בסעיף 4.

3.בתצהיר של שומנים על ידי התייבשות מבוקרת של יפוזומים קטנים

1. זהירות: הפרוטוקול שלנו דורש שומנים כדי להיות ממוקמים בשיווי משקל עם אדי פתרונות מלח רוויים במשך שעות רבות. אנו ממליצים בחום לבצע את הפרוטוקול באווירת גז אינרטי, תוך שימוש בתא הכפפות או מתחם דומה.
2. זהירות: אם הכנת דגימות המכילות חלבונים, למנוע התייבשות מוחלטת. מימה את האווירה בכל מארז עם כוס מים חמים, או אדים מבוססי sonicator. השתמש במד לחות על מנת להבטיח שיש לפחות 30% לחות יחסית. השתמש סורביטול או סוכרוז בחיץ liposome הקטן כאמצעי זהירות נוסף על מנת למנוע התייבשות מוחלטת.
3. הכן תמיסת מלח רוויה של לחות היחסית מתאימה. לחות יעד תלויה בosmolarity של הכנת השלפוחית. לתכשירי הosmolarity הפיזיולוגי, השתמש 30-45% לחות יחסית, ואילו הכנות שלפוחית ​​osmolarity נמוכות יכולות להיות מספקת במיובשותשיווי משקל עם 75-90% לחות יחסית (ראה גם טבלה 1).
4. שים את תמיסת מלח רוויה ועודף מלח במכל בחוזקה רב סגר עם מדף פנימי. מיכלי מזון מסחרי ליוגורט וגרנולה עבודה טוב מאוד. החלף את המדף לאחר המילוי, ולהפוך את הנוזל בטוח הוא 5-10 מ"מ מתחת למדף.
5. שקופיות מצופים איטו נקיים כמו בסעיף 1. השתמש במודד כדי לקבוע באיזה צד הוא מוליך, ולתייג את הצד שאינו מוליך עם שם הדוגמא.
6. משמנים שני צידי (USP כיתה ו) אטם סיליקון (ים) עם אחד או חורים מרובים.
7. הנח את צד מוליך שקופיות על הספסל, ולהחיל את אטם סיליקון (ים) לכל שקופית שאליו שומנים ייושמו, כדי לוודא שיש לפחות 5 מ"מ של שקופית נחשפה בקצה אחד כדי להתחבר למנגנון electroformation. להחליק את האטם על מנת להבטיח חותם טוב.
8. לדלל את הכנת השלפוחית ​​בחיץ מליחות נמוכה מלח ל~ 1-2 מ"ג / מ"ל. אנו מוצאים כי concentr גבוה יותרations לייצר תוצאות עניות.
9. החל שומנים לשקופית בטיפות μl 1-10. טיפות קטנות יותר בדרך כלל לייצר תוצאות טובות יותר.
10. מניחים את השקף על מדף הפנים מעל תמיסת מלח הרווי ולאטום את המכל בחוזקה. השאר על RT במשך 3 שעות לO / נ ניתן להציב את המכל על 4 מעלות צלזיוס, אך שים לב כי עבור חלק מהמלחים, RH תלוי בחום על טמפרטורה, וקר שיגדיל את זמן איזון.
11. הסרט עשוי כתוצאה מכך יש לו ברק קשת קלה אליו, אבל בכל מקרה צריך להופיע כמעט מיובשת. פתרונות מתחילים מאוד האוסמוטי עשויים להיות בלתי אפשריים להתייבש לחלוטין לסרט שומנים בדם, זה לא ישפיע לרעה על התוצאות.

4. Electroformation של יפוזומים ענק

1. סרטי שומנים בדם, במיוחד אלו שנוצרו מיפוזומים מיובשים, הם משתחררים ממקומם בקלות. מימה בזהירות כל אחד גם על ידי הצבת מחט 27 G מזרק בקצה של האטם וליישם את החיץ לאט. מאגרים יכוליםכולל מים, סוכרוז ≤ 200 מ"מ, ≤ M 1 סורביטול ו≤ 5 HEPES המ"מ. תמיסת מלח יותר מ -10 מ"מ עשויה לדרוש פרוטוקולי מתח electroformation חלופיים. תמלא יותר מדי בכל אטם היטב על ידי ~ 10%.
2. הערה: פעם אחת השומנים הם התייבשות, להמשיך במהירות בשלבים הנותרים, שכן סרטי שומנים מתחילים delaminate באופן מיידי. התשואה וגודל הם מוגדל אם electroformation מתחילה מייד.
3. בתנועה אחת חלקה, יחול, שקופית פנים מוליך שני איטו ב, לחלק העליון של האטם. לוודא שיש לפחות 5 מ"מ של הסככה מחוץ לאזור האטם ומול הסככה הראשונה. לחץ בעדינות על מנת להבטיח חותם טוב.
4. נקה את שתי סככות באמצעות אתנול ולוודא כי צדדים העומדים בפני האטם הם מוליך עם מודד שלך.
5. התא יכול להיות מאובטח יותר עם parafilm או קליפים אביב מתח קלים אם תרצה בכך.
6. חברו לתא electroformation למקור מתח על ידי הבטחת סורגי אלומיניום או נחושת, "EMI Gaskקצף ואח ", או סרט מוליך מודבקות למשטחים מוליכים של שתי השקופיות. אנו משתמשים בקצף אטם EMI. תוכניות ללנענע ותפס מוצגים באיור 5.
7. ודא שאין קצר חשמלי בין המגעים, וכי המגעים להתחבר כראוי למשטחי איטו, באמצעות מודד.
8. מחממים את החדר 10 מעלות צלזיוס מעל טמפרטורת ההתכה הגבוהה ביותר של כל אחד משומני הווה; למשל עבור DPPC, חום עד 52 מעלות צלזיוס לפחות, 10 ° C מעל טמפרטורת התכת השרשרת של 42 ° C.
9. למאגרים דלי מלח, להחיל 10 הרץ גל סינוס, ~ 0.7 V _RMS לכל מילימטר פער בין שני המשטחים המצופים איטו, עבור 60-90 דקות. למאגרי מלח גבוהים, יש להשתמש בפרוטוקולי מתח אחרים (ראה הפניות).

5. הדמיה ופתרון בעיות

1. תמונת liposome באמצעות מיקרוסקופ הפוכה מצוידת במסנן עבור קוביית Rhodamine או אדום צבעי טקסס. Liposome צריך להיות כדורי,בעיקר unilamellar לפי העין, ונקי מפגמים, כגון "מחרוזות" תלויות מעל liposome.
2. אם הם קטנים מדי ליפוזומים, להשתמש בפחות שומנים בדם.
3. אם יש פגמים רבים או כמה ליפוזומים, זה יכול להיות בגלל שומני ג'ל שלב. לשקול העלאת טמפרטורת electroformation.
4. אם כמה, אם בכלל, ליפוזומים ענק נוצרו בכל מיפוזומים קטנים מיובשים, להפחית את כוח האוסמוטי של חיץ liposome, או להגדיל את כוח האוסמוטי של חיץ electroformation. זרימה פנימית של חיץ לפתרון חיץ ביניים המרוכז יכולה לגרום delamination של סרט השומנים שהופקד.
5. אם תשואת שלפוחית, איכות, או גודל הוא עניה, ואתה כלל מלחים או תמיסות בופר במאגרי electroformation או liposome, לשקול פרוטוקולי מתח electroformation חלופיים. לדוגמה, פוט, et al. ^-11, ממליץ פרוטוקול שלושה צעד באמצעות 500 הרץ sinewave, העלאת המתח מ50-1,300 Vpp / מ 'מעל 30 דקות, מחזיק עבור 90 דקות,n יורד תדירות ל -50 הרץ מעל 30-60 דקות. אלקטרודות פלטינה או טיטניום ייתכן שתהיינה הצורך במקרה הזה, אבל זה לא משנה באופן מהותי את הפרוטוקול.

תוצאות

בדוגמאות שלנו, שאנו מכינים ליפוזומים מתערובת של כ -55% מול POPC (1-Palmitoyl-2-oleoyl-SN-glycero-phosphocholine), 15% מול POPS (1-Palmitoyl-2-oleoyl-SN-glycero-phosphoserine , 30% מול כולסטרול, ו -0.1% מול טקסס האדומה שכותרתו 1,2-dipalmitoyl-SN-phosphoethanolamine (TxR-DPPE). הרכב זה נבחר כנציג של שומנים כ גנגליון שורש הגבי ^18....

Discussion

Electroformation של יפוזומים ענקים התפתח טכניקה גמישה תואמת עם שומנים שונים, תכשירים, וחוצצים. שליטה מדוקדקת של התהליך בתצהיר השומנים היא קריטית ביותר להצלחה. יש לנו הצגנו כלים פשוטים כדי להפוך תצהיר מבוקר של שומנים מהכנות liposome קטנות תהליך פשוט. הלחות היחסית היא קריטית להתי?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Digital Multimeter	Agilent Technologies, www.agilent.com	U1232A or similar	Any multimeter will do, but avoid old style analog ohmmeters which apply much more current to the resistance under test.
	Fluke	117 or 177	Any multimeter will do, but avoid old style analog ohmmeters which apply much more current to the resistance under test.
Function Generator	Agilent Technologies, www.agilent.com	33210A or similar	Most function generators work for simple protocols. This programmable model is useful for advanced electroformation protocols. Make sure the generator can drive 10 V peak-to-peak into a 50 Ω load
ITO coated glass slides	Delta Technologies, Loveland, CO www.delta-technologies.com	CB-90IN-S107 or similar	Break these in half to make two slides, 25 mm x 37 mm
Temperature controller	Omega Engineering Stamford, CT www.omega.com	CNi3233 or similar
Hygrometer	Extech, Nashua, NH, www.extech.com	445815
Silicone rubber sheet	McMaster-Carr Elmhurst, IL www.mcmaster.com	87315K64	Use USP Grade VI silicone for its high purity
EMI gasket	Laird Technologies www.lairdtech.com	4202-PA-51H-01800 or similar	Distributed by Mouser www.mouser.com
TxR-DHPE	Life Technologies, Carlsbad, CA www.lifetechnologies.com	T1395MP	Other fluorescently labeled lipids are available, but TxR-DHPE is one of the brightest and most photostable.
POPC	Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL www.avantilipids.com	850457P or 850457C	Lipids can be ordered as powders (P) or in chloroform (C)
POPS	Avanti Polar Lipids	840034P/C
Cholesterol	Sigma-Aldrich	C8667