פרוטוקול משופר עבור microdissection הליזר של איי לבלב אנושיים מדוגמאות כירורגים

Summary

microdissection הליזר הוא טכניקה המאפשרת התאוששות של תאים נבחרים מכמויות זעירות של parenchyma. כאן אנו מתארים פרוטוקול לרכישת איי לבלב אנושיים מדגימות ניתוחיות שתשמש למחקרי transcriptomic. הפרוטוקול שלנו משפר את autofluorescence הפנימית של תאי הביתא אדם, ובכך להקל האוסף שלהם.

Abstract

microdissection הליזר (LMD) הוא טכניקה המאפשרת ההתאוששות של תאים ורקמות שנבחרו מכמויות זעירות של parenchyma ^1,2. התאים הגזורים יכולים לשמש למגוון רחב של חקירות, כגון מחקרי transcriptomic או proteomic, הערכה או ניתוח דנ"א הכרומוזומלי ^2,3. יישום מאתגר במיוחד של LMD הוא ניתוח transcriptome, אשר, בשל הרפיפות של רנ"א ^4, יכול להיות בולט במיוחד כאשר תאים גזורים מרקמות עשירות של RNases, כגון לבלב. פרוטוקול microdissection שמאפשר זיהוי ואיסוף מהיר של תאי היעד חיוני בהגדרה זו כדי לקצר את זמן הטיפול ברקמות וכתוצאה מכך, על מנת להבטיח שימור RNA.

כאן אנו מתארים פרוטוקול לרכישת תאים בטאו בלבלב אנושי מדגימות ניתוחיות שתשמש למחקרי transcriptomic ^5. חתיכות קטנות של לבלב של ג כ 0.5-1³ מ 'נחתכו מהשולים הבריאים המופיעים בדגימות לבלב resected, המשובצים ברקמות-Tek מתחם אוקטובר, הקפואים מייד ב2-Methylbutane מצונן, ומאוחסן ב-80 מעלות צלזיוס עד שחתך. ארבעים קטעים סידוריים של עובי מיקרומטר 10 נחתכו בcryostat תחת -20 ° C הגדרה, הועברו באופן פרטני לשקופיות זכוכית, התייבשו בתוך cryostat ל1-2 דקות, ומאוחסנים ב-80 ° C.

מייד לפני הליך microdissection הליזר, סעיפים תוקנו בקר כקרח, מוכן טרי אתנול 70% למשך 30 שניות, נשטפו על ידי 5-6 מטבלים במים קרים כקרח DEPC טופלו, ומיובש על ידי שתי incubations של דקה אחת ב100% קרים כקרח אתנול ואחריו קסילן (המשמש להתייבשות רקמות) עבור 4 דקות; חלקי רקמה היו אז אוויר יבשים לאחר מכן במשך 3-5 דקות. חשוב לציין, בכל הצעדים, למעט הדגירה בקסילן, בוצעו באמצעות ריאגנטים קרים כקרח - שינוי מעל ⁶ פרוטוקול שתואר לעיל. Utilization של ריאגנטים קרח קרים ביאה לעלייה בולטת של autofluorescence הפנימית של תאים בטאו, ואפשר זיהוי שלהם. לmicrodissection, ארבעה חלקים היו מיובשים בכל פעם: שתיים להציב לתוך צינור עטוף בנייר האלומיניום 50 מ"ל, כדי להגן על הרקמות מפני רטיבות והלבנה; 2 נותרי microdissected באופן מיידי. הליך זה בוצע באמצעות מכשיר PALM Microbeam (Zeiss) העסקת לחץ הליזר האוטומטי catapulting מצב (AutoLPC). ההשלמה של תאי הבטא / נתיחת איון מהארבעה cryosections נדרש לא יותר מ40-60 דקות. תאים נאספו לAdhesiveCap אחד וlysed עם חיץ תמוגה 10 μl. כל דגימת RNA בודדה עבור ניתוח transcriptomic הושגה על ידי שילוב של 10 דגימות תאים microdissected, ואחרי מיצוי RNA באמצעות פיקו הטהור רנ"א בידוד הקיט (ארקטורוס). פרוטוקול זה משפר autofluorescence הפנימית של תאי הביתא אדם, ובכך להקל ההכרה וג המהיר והמדויקת שלהםollection. שיפור נוסף של הליך זה יכול לאפשר נתיחה של תאי הביתא phenotypically שונים, עם השלכות אפשריות להבנה טובה יותר של שינויים הקשורים בסוכרת מהסוג 2.

Protocol

1. הקפאת רקמת לבלב אנושית

1. הסרת רקמת שומן, כלי דם, עצבים ורקמות שאינן parenchymal עם איזמל ופינצטה, ולחתוך את רקמת הלבלב לחתיכות (~ 0.5-1 קוביות סנטימטר).
2. הנח חתיכת רקמת לבלב אחד במרכז Cryomold, ומכסה אותו לחלוטין עם מתחם קר רקמות-Tek אוקטובר שים Cryomold לתוך צנצנת שתחתיתו מכוסית ב2-Methylbutane מראש מקוררים ונצמדת הקפאה בחנקן נוזלי. אחסן מדגם הקפוא ב-80 ° C.

2. הכנת סעיפים קפואים

1. תלבש כפפות לאורך כל הצעדים כדי למנוע denaturation של רנ"א.
2. נקה את סכין cryostat, בעל דגימה ומכחול עם אתנול קר 100% וRNase Away. הנח את הרקמה קפואה בתוך cryostat.
3. חכה עד הרקמות, הסכין והמברשת להגיע -20 ° C. תייג SuperFrost פלוס שקופיות ומראש להתקרר בתוך חדר cryostat בזמן ההמתנהלרקמה להגיע -20 ° C.
4. החל מתחם רקמות-Tek אוקטובר על בעל הדגימה ולמקם את הרקמה קפואה על העליונה.
5. ברגע שמתחם אוקטובר רקמות-Tek הקפוא לקצץ cryoblock ולהסיר כל עודף של רקמות Tek מתחם אוקטובר בסכין גילוח.
6. חותך כולל של 40 10 פרוסות מיקרומטר רצופות מגוש רקמת הלבלב. בנוסף אנו ממליצים לחתוך פרוסה ראשונה ואמצע ונשמר לציורי סקירה של סעיף הלבלב שיכול להקל על זיהוי של איונים בתוך הפרוסות במהלך תהליך microdissection.
7. העברת החלקים מלהב הסכין למרכז SuperFrost פלוס שקופית על ידי נגיעת הישבן של השקופית עם האצבע (מכוסה בכפפה) להתחמם רק באזור שאליו הסעיף, לדבוק.
8. ייבש את סעיפי 1-2 דקות בתוך cryostat ב -20 ° C, אחרי שאתה מכניס אותם לשקופית תיבה מונחת על קרח יבש. אחסן את הסעיפיםב-80 ° C.
9. אם יש צורך, מנקה את להב הסכין עם נייר סופג ו100% אתנול קר.

3. התייבשות של מדורים קפואים

1. הכן את ריאגנטים: לשפוך 30 אתנול מוכן טרי 70%, מי 30 מ"ל DEPC טופל, 100% אתנול 2x30 מ"ל וקסילן 30 מ"ל לתוך צינורות 50 מ"ל Cellstar (פלקונס) מ"ל; צינה ולשמור את כל החומרים כימיים (מלבד קסילן) על קרח.
2. נקה את מקום העבודה מתחת למכסת המנוע עם 100% אתנול וRNaseZAP.
3. 2 cryosections התהליך כדלקמן: לתקן באתנול 70% קרים כקרח למשך 30 שניות, לשטוף עם 5-6 מטבלים מהירים במים קרים כקרח DEPC טופלו, מייבש פעמים לדקות 1 באתנול 100% הקרח קר, דגירה במשך 4 דקות בקסילן בטמפרטורת חדר (25 מעלות צלזיוס), ואוויר יבש במשך 3-5 דקות. חזור על שלב זה עם עוד זוג cryosections.
4. הוסף שתי cryosections מיובש גב אל גב לתוך צינור 50 מיליליטר Cellstar העטוף בנייר אלומיניום כדי להגן עליהם מפני אור ולחות.

<כיתת p = "jove_title"> 4. Microdissection ליזר של תאי ביתא עם PALM Microbeam, Zeiss

1. נקה מיקרוסקופ עם RNaseZAP ולעלות יתר הדבק בRoboMover.
2. הגדר את ההגדרות הבאות: הגדרת מסנן 09 (עירור: 450-490 ננומטר, הפליטה> 515 ננומטר), AutoLPC מצב, אנרגית ליזר 50%, מוקד ליזר 65%, מהירות ליזר 100%, מרחק 5 מיקרומטר בין יריות AutoLPC, מרחק 6 מיקרומטר לשורה, עובד גובה: -10100.
3. הוסף שקף אחד לבמה.
4. לאתר את תאי הבטא autofluorescent תחת הדמיה מיקרוסקופית (עדשת 5x או 10x).
5. לעבור לעדשת 40X, בחר בתאים בטאו עם כלי הבחירה "Freehand" וmicrodissect באמצעות הליזר.
6. צלם את הרקמה של ארבע cryosections המיובש לAdhesiveCap אחד.
   תגובה 1: את הזמן כדי לנתח את תאי הבטא של cryosection המיובש אחד לא צריך להיות יותר מ 10-20 דקות, כדי למנוע התייבשות של חלקי הרקמות אשר יגרום לכךRNA שפלה.
   תגובה 2: לוודא תהליך microdissection מוצלח על ידי בדיקה חזותית לאחר שעבר את השלב למחסום.

5. תמוגה של רקמות מועשרות תא בטא Microdissected

1. הסר את AdhesiveCap מRoboMover.
2. 10 חיץ Pipet μl חילוץ (XB, PicoPure רנ"א בידוד הקיט, ארקטורוס) לתוך המכסה של AdhesiveCap ודגירתו במהופך על 42 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
3. ספין למטה ב10000 XG ולשים lysate בקרח יבש. לאחסן אותו ב-80 ° C עד מיצוי RNA הוא מבוצע.
4. חזור על שלבי 3.) עד 5.) עם כל חלקים אחרים.

6. RNA חילוץ

1. מערבב את כל 10 10 lysates μl
2. להמשיך בבידוד RNA על ידי העבודה בטמפרטורת חדר על פי הפרוטוקול של PicoPure רנ"א בידוד הקיט, ארקטורוס, באמצעות הצפת חילוץ יחס 1:1 (XB) לאתנול 70% (כולל טיפול DNase).

7. רנ"א ניתוח

1. השתמש 1 RNA μl לניתוח של איכות וכמות באמצעות 2100 Bioanalyser Agilent (PicoChip). הערכה כמותית נעשתה בהתייחסות לרנ"א הסטנדרטי עמוס במקביל על השבב.

תוצאות

כפי שניתן לראות בתרשים 1, פרוטוקול dehydrating השונה הוביל לשיפור של תאי הבטא autofluorescence לעומת ⁶ הפרוטוקול שפורסם הקודם. יישום הפרוטוקול המתואר, כל אחד 39 דגימות לבלב ניתוחיות שמש ליצירת 40 cryosections סדרתי עבור ממוצע של דגימת רקמה / לבלב 31'544'704 מיקרומטר ³ (ט...

Discussion

אנו מתארים גישה אמינה לmicrodissection הליזר (LMD) של איי לבלב אנושיים מדגימה כירורגית. ובלבד שמיקרוסקופ LMD זמין, הליך זה יכול להיות מיושם בכל מוסד מחקר ביצוע pancreatectomies החלקי, וכך להגדיל את הגישה לחומר איון אנושי משני 2 חולי הסוכרת שאינם סוכרתיים וסוג. זה רלוונטי במיוחד לאור מיע?...

Materials

שם המגיב	חברה	מספר קטלוגים	תגובות
2-Methylbutane (isopentane)	רוט	3927.1
AdhesiveCap (אטום, 500 μl)	ZEISS	415190-9201-000
Cellstar צינורות (50 מ"ל)	גריינר ביו 1	210 261	עם חצאית תמיכה
Cellstar צינורות (50 מ"ל)	גריינר ביו 1	227.261
Diethyl pyrocarbonate (DEPC)	SIGMA	ד 5758
קרח יבש
אתנול מוחלט	VWR	20821.310
חנקן נוזלי
לצייר מברשת
PALM Microbeam	ZEISS
פיל-A-Way הטבעת תבניות (מקוצץ), 12 12 מ"מ x	ProSciTech	RR12	מ"מ ראש העמוד פנימי 22x22, עומק 21 מ"מ
ארקטורוס PicoPure קפוא רנ"א בידוד קיט	אפלייד Biosystems	KIT 0204
מהדק פלסטיק
תער
RNase-חופשי DNase סט	Qiagen	79254
RNaseZAP	SIGMA	2020 R
אזמל /להב כירורגים	טכנו חותך	2800111
שקופיות מיקרוסקופ הידבקות Plus SuperFrost	Thermo Scientific	J1800AMNZ	25x75x1.0 מ"מ
מתחם רקמות-Tek אוקטובר	סאקורה	4583 או 0807000022
מלקט	BRAUN	BD168R
קסילן	VWR	28975.291