מודל עכברי של ריפוי פצע

Summary

מודל עכברי של ריפוי פצע עורי שניתן להשתמש כדי להעריך את התרכובות טיפוליות בהגדרות פיסיולוגיות וpathophysiological.

Abstract

ריפוי פצע ותיקון הם התהליכים הביולוגיים המורכבים ביותר המתרחשים בחיי אדם. לאחר פציעה, מסלולים ביולוגיים רבים להיות מופעלים. ריפוי פצעים לקוי, אשר מתרחש בחולי סוכרת לדוגמה, יכול להוביל לתוצאות חמורות שליליות כגון קטיעה. יש, אם כן, תמריץ להגדיל לפתח סוכני רומן המקדמים תיקון פצע. הבדיקות אלה היו מוגבלות למודלים של בעלי חיים גדולים כמו חזירים, שהם לעתים קרובות לא מעשיים. עכברים מייצגים את המודל האידיאלי קליני, כפי שהם חסכוני ונוחים למניפולציה גנטית, המאפשרת לחקירת מכניסטית. עם זאת, ריפוי פצעים בעכבר הוא שונה בהמהות לזה של בני אדם כפי שהוא מתרחש בעיקר דרך הצמצום. המודל העכברי שלנו מתגבר על זה על ידי שילוב של קיבוע באזור הפצע. על ידי קיבוע הפצע, תהליך התיקון הוא לאחר מכן תלוי באפיתליזציה, התרבות תאים ואנגיוגנזה, אשר משקפות באופן הדוקתהליכים ביולוגיים של ריפוי פצע אדם. בעוד הדורש עקביות וטיפול, מודל עכברי זה אינו כרוך בטכניקות כירורגיות מסובכות ומאפשר בדיקות חזקות של חומר מבטיח שעשויים, למשל, לקדם או לעכב אנגיוגנזה דלקת. יתר על כן, כל עכבר פועל כשליטה שלה כמו שני פצעים מוכנים, מה שמאפשר את היישום של שניהם במתחם ומבחן השליטה ברכב באותו בעל חיים. לסיכום, אנו מדגימים מודל מעשי, קל ללמוד, וחזק של ריפוי הפצע, שהיא דומה לזו של בני אדם.

Introduction

ריפוי פצע לקוי אחראי לתחלואה ותמותה בעולם משמעותית, זה נכון במיוחד עבור הסובלים מסוכרת ^1,2. בבני אדם, ריפוי פצע הוא רצף של תהליכים, שבו יש חפיפה משמעותית ^3. מייד התהליכים דלקתיים, פציעה הבאות הם יזמו. תאים דלקתיים לשחרר גורמים המעודדים את התהליכים של תא התפשטות, הגירה ואנגיוגנזה. לאחר היווצרות רקמה חדשה epithelialization מחדש ויש שלב של שיפוץ שכרוך גם אפופטוזיס וארגון מחדש של חלבוני מטריצה ​​כגון קולגן.

המורכבות של ריפוי פצע לא יכולות כרגע להיות משוכפלת במבחנה וזה מחייב שימוש במודלים של בעלי חיים. נכון להיום, לימודי ריפוי פצעים היו מוגבלים למודלים של בעלי חיים גדולים, כמו חזירים, על מנת להבטיח כי תהליכי הריפוי הם שווי ערך ודומים לבני אדם. עם זאת, שימוש האנימה גדולהLS למחקרים מסוג זה יכול להיות קשה לבית והם לא תמיד מעשיים ^4. עכבר המעבדה מייצג מודל חיה חסכוני, שניתן בקלות מניפולציות גנטית לחקירת מכניסטית ^5-7. עם זאת, פצעים עכבריים לרפא בצורה שונה לאדם ב, בעיקר בשל התהליך של התכווצות ^8. מדובר בין השאר, בשל שכבה תת עורית נרחבת משורטטת שריר נקראת carnosus מרפד שהוא במידה רבה חסר בבני אדם. בעכברים, שכבת שריר זה מאפשר לעור להעביר באופן עצמאי של השרירים העמוקים יותר והוא אחראי להתכווצות המהירה של הפציעה הבאה עור.

כדי להתגבר על מגבלה זו, ניתן להתאים את ריפוי פצע עכברי לשכפל ריפוי פצע אדם על ידי שימוש בסד (איור 1) ^8,9. בסרטון הזה אנחנו מדגימים את המודל העכברי הפצע החורץ שמבטל התכווצות פצע והדוק יותר קרובות לתהליכים האנושיים של מחדש epithelialization והיווצרות רקמה חדשה. במודל זה שני חתכים בעובי מלא הכוללים carnosus מרפדים נוצרים על dorsum, אחד בכל צד של קו האמצע של העכבר. סד סיליקון ממוקם סביב הפצע עם הסיוע של דבק ולאחר מכן הקיבוע מאובטח עם תפרים. כל עכבר משמש כשלט משלו, עם פצע אחד מקבל טיפול ושליטה ברכב האחר, ובכך להפחית מספרים של בעלי חיים. בעקבות יישומים אקטואליים, הלבשה אוטמת שקופה מוחלת. ניתן להסיר את החבישה בעת צורך ליישומים נוספים אקטואליים ו / או מדידה של אזור הפצע ^10,11. בהשלמת ניסויים, סגירת פצע, אדריכלות ומידת neovascularization המורפולוגי ניתן להעריך על ידי אימונוהיסטוכימיה. זה גם יכול להיות מנוצל חסכוני וקל לביצוע מודל להערכת ריפוי פצע בהקשר של סוכרת או pathophysiologies האחרים.

Protocol

1. הכנת סדים ותחבושות occlusive

1. מדורג 10 מ"מ חוגים ביריעות סיליקון בעובי 0.5 מ"מ ומספריים שימוש או ביופסיה כדי ליצור דיסקי סיליקון.
2. מרכז מ"מ ביופסיה 5 באמצע מעגל 10 מ"מ ולחץ בחוזקה כדי ליצור חור ליצירת "סופגנייה", כמו דיסק שישמש כסד.
3. מדורג 10 מ"מ על עיגולים שקוף הלבשה אוטמת כגון Opsite ומספריים להשתמש כדי ליצור תחבושות מעגליות.

2. חיות ניסוי

1. השג אישור ועדת אתיקה לבעלי חיים כל הניסויים שיבוצעו.
2. השתמש בעכברים ממין זכר C57BL/6J 8 שבועות ישנים (22-26 גרם) ממגדל מסחרי (למשל מעבדות ג'קסון).
3. שמור על עכברים בתנאים סטנדרטיים של 21 מעלות צלזיוס ומחזור 12 שעות אור בחושך עם גישה החופשית למזון ומים.
4. (אופציונלי): סוכרת יכולה להיגרם ב6 עד 7 עכברים ישנים שבוע על ידי בולוס intraperitoneal injection של 165 מ"ג / ק"ג streptozotocin (בחיץ ציטרט, pH 4.5), עם היפרגליקמיה אושר על ידי ניטור רמת סוכר בדם רגיל (AccuChek Glucometer). עכברים סוכרתיים עשויים להיות polyuria וכן המצעים שלהם ייתכן שיהיו צורך לשנות בתדירות גבוהה יותר כדי למנוע רטיבות והמשקולות שלהם צריכים להיות תחת פיקוח הדוק.

3. הרדמה והכנה אופרטיבית

1. לגרום להרדמה כללית באמצעות 5% isoflurane ב 100% חמצן (קצב זרימה 1 ליטר / דקה) ולשמור על הרדמה באמצעות 1-3% isoflurane.
2. להבטיח את הרפלקסים פדלים העמוקים של העכבר מדוכא ומניח את העכבר בעמדה פגיע.
3. הכן את אזור הניתוח על ידי הסרת פרווה עם קוצץ מבסיס הצוואר עד 3 ס"מ בהמשך הגב ובין השכמות שתי כתפיים.
4. יישום אור הקרם מקריח יכול להיות מיושם על לא יותר מ 2 דקות. מטליות גזה רטובות יכולות לשמש כדי להבטיח את כל השמנת ופרווה שנותרה מוסר.
5. לנגב את העור עםספוגית אלכוהול ושני יישומים של 10% povidone-יוד (פולידין) ולעטוף את העכבר.

4. כריתה וקיבוע של פצע

1. ייצוג בתרשים של מודל ריפוי פצעים העכברי מוצג באיור 1.
2. השתמש סטרילי 4 מ"מ ביופסיה להתוות שתי תבניות עגולות לפצע משני צדי קו האמצע של העכבר ברמה של הכתפיים (ראה איורים 2a-2b).
3. שימוש במלקחיים משוננים להרים את העור באמצע המתווה והמספריים איריס כדי ליצור פצע בעובי מלא המשתרע דרך הרקמה התת עורית (איורים 2 ג-2D), כולל carnosus מרפדים (2E איור), והבלו פיסה העגולה של רקמה.
4. חזור על התהליך עבור הפצע בצד השני של קו האמצע (איור 2F).
5. הסר ציפוי מגן פלסטיק מכל צד של סד סיליקון.
6. החל cyanoacrylate דבק (למשל דבק סופר או דבק מגע דבק) בצד אחד של סד סיליקון.
7. מרכז סד על הפצע (איור 2G) ועוגן הסד עם 6-0 תפרי ניילון הופסק כדי להבטיח מיצוב (איור 2H).
8. חזור על תהליך קיבוע על פצע האחר.
9. אם יש צורך בנקודת הזמן זו, להחיל המתחם הטיפולי להיבדק (μl עד 100) לפצע אחד (איור 2i), ושליטה ברכב לצד השני.
10. לכסות את הפצע עם תחבושת אוטמת שקופה (לדוגמה, OpSite) (איור י 2-2k).
11. שליט ממוקם מתחת לסדים ונלקח photomicrograph (איור 2L).

6. ניהול לאחר ניתוח

1. Carprofen (5 מ"ג / ק"ג) אחת ליום מנוהל באמצעות הזרקה תת עורית-להקלה על כאב שלאחר הניתוח.
2. אחרי החיות הניתוח הן בכלוב בנפרד ושמרו על חום מ 'ATS עד התאושש באופן מלא.
3. לפקח חיות פעמיים ביום למשך גילויים של כאב וירידה במשקל. הבחנו לא מוצג התנהגות בוטה של ​​כאב או ירידה במשקל.

7. מדידת פצע וטיפול

1. הפצע יכול להימדד מדי יום.
2. לגרום להרדמה כללית באמצעות 5% גז isoflurane (זרימת שיעור 1 ליטר / דקה), ולאחר מכן להבטיח את הרפלקסים התחושתיים העמוקים של העכבר מדוכאת באמצעות 1-3% isoflurane.
3. בעדינות לקלף את רוטב occlusive עם מלקחיים.
4. השתמש מחוגה כירורגיות כדי למדוד את קוטר הפצע. אנחנו לוקחים את הממוצע של שלוש מדידות לאורך X, Y ו-Z הציר (איורים 2 מ-2o), כמו גם photomicrograph לשימוש עתידי (איור 2).
5. אופציונלי: בשלב זה את החיה ניתן להעריך לזלוף הדם באמצעות לייזר דופלר imager (איור רבעון 2).
6. יישום מחדש של המתחם הטיפולי ושליטה ברכב יכול להיות ביצועיםתרופה בשלב זה.
7. הלבשה אוטמת שקופה נקיות היא מחדש מיושמת ואת החיות כל הזמן חם עד שהתאוששו באופן מלא.
8. הערה: אם סדים אינם מאובטחים כראוי את הפצע בקלות יהיה חוזה (איור 2 יח).

8. ניתוח היסטולוגית

1. להרדים את העכברים לאחר 10 ימים עם מנת יתר של הרדמה.
2. בעזרת מלקחיים ולהב סכין מנתחים להסיר את התפרים ובזהירות לקלף את הקיבוע.
3. השתמשו במספרי איריס ליצור כריתה רחבה, מלאה מסביב ומתחת לאזור הפצע ודגירת הרקמות בparaformaldehyde 4% בופר פוספט (PBS) בשעה 4 ° C למשך הלילה.
4. העברת רקמות לסוכרוז 17% בפתרון PBS עבור 24 שעות נוספות על 4 מעלות צלזיוס ולאחר מכן להסיר פתרון עודף על ידי מספיג בזהירות על רקמות ומקום במתחם והקפאת אוקטובר ב -80 ° C.
5. Hematoxylin ומכתים eosin יכולים לשמש כדי לחזות את המבנה ופער פצע אפיתל. Neovascularisation ניתן להעריך על ידי מנתח immunohistochemical כדי לקבוע את מספר הנימים (באמצעות גורם Willebrand פון).

תוצאות

עקומת סגירת פצע נקבעה על ידי חישוב הקוטר הממוצע של הפצע ולבטא את התוצאות באחוזים, כלומר 100 - (יום 0 קוטר / קוטר X יום). בניסוי זה מתחם טיפולי (או שליטה ברכב) יושם יומי לפצע. המתחם הטיפולי סגירת פצע מאוד מואצת (איור 3). חשוב לציין כי הסדים חייבים להישמר לתקופת הנ?...

Discussion

זהו מודל עכברי ניסויי של ריפוי פצע עורי. תכונה משמעותית של מודל זה היא השימוש בסדי סיליקון כדי למנוע התכווצות פצע כך שהיווצרות הרקמה חדשה epithelialization מחדש ועלול להתרחש, מה שהופך אותו דומה לתהליך המתרחש בבני אדם. מודל זה הוא תכליתי וניתן להשתמש בו כדי להעריך את ריפוי פצע ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Press-to-seal silicone sheeting 0.5 mm thick	Invitrogen	P18178	Cut into "donuts" with external diameter of 1cm external, 0.5 cm internal diameter
Biopsy punch 5 mm	Steifel	BC-B1-0500	To outline wound area to be excised
Vannas scissors 8.5 cm curved	World Precision Instruments	501232	For wound incision and excision
Dumonte #7b forceps, 11 cm	World Precision Instruments	501302	To grip skin when creating incision and excising skin
Graefe forceps, serrated 10cm	World Precision Instruments	14142	To help attach silicone splint to skin
Needle holder, smooth jaws, curved, 12.5 cm	World Precision Instruments	14132
Malis forceps, smooth, straight, 12 cm	Codman and Shurtleff, Inc (J&J)	80-1500	To suture the silicon rings to the skin
Ruler, 0.5 mm gradation	n/a
Calipers 0.25 mm gradation	Duckworth and Kent	9-653	To measure wound area
Opsite FlexiFix transparent adhesive film. 10 cm x 1 m	Smith & Nephew	66030570
Rimadyl (Carprofen)	Pfizer	462986