זיהומים של תאי יונקים צייתנים עם חיידקי protozoan דרוך-

Summary

טכניקה זו מספקת שיטה לקצור, לנרמל ולכמת צמיחה תאית של חיידקים פתוגנים כי הם מראש מעובדים בתאי פונדקאי protozoan טבעיים לפני הזיהומים של תאי יונקים. שיטה זו יכולה להיות שונה כדי להתאים מגוון רחב של תאי מארח לבמה יחול כמו גם סוגי תאי היעד.

Abstract

חיידקים פתוגנים תאי רבה משתמשים הפרוטוזואנים מים מתוקים כמאגר טבעי לשגשוג בסביבה. הלגיונלה pneumophila, הגורם לכך מדלקת הריאות הליגיונרים, זוכה ליתרון על פני בחיידקים פתוגניים בתרבית מבחנה כאשר נקטפו ראשון מתאי protozoan לפני הזיהום של מקרופאגים יונקים. הדבר מרמז כי גורמים ארסיים חשובים לא יכולים לבוא לידי הביטוי כראוי במבחנה. פתחנו מערכת צייתנית ליחולו L. pneumophila דרך מארח protozoan הטבעי Acanthamoeba castellanii לפני הזיהום של תאי יונקים. תרומתו של כל גורם ארסיות ניתן לבדוק על ידי השוואת צמיחה תאית של זן מוטציה לחיידקי סוג פראי לאחר שהכין מראש protozoan. GFP-להביע פראי סוג והמוטציה L. זני pneumophila משמשים להדביק monolayers protozoan בשלב אתחול ואפשרו להגיע לשלבים מאוחרים של גידול תאי. חיידקי פלורסנט אז נקצרים מן התאים הנגועים האלה ונירמול של ספקטרופוטומטריה לייצר מספרים דומים של חיידקים לזיהום לאחר למקרופאגים יונקים. לכימות, חיידקי חיים מנוטרים לאחר הדבקה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, cytometry זרימה, ועל ידי ציפוי מושבה. טכניקה זו מדגישה ומסתמכת על התרומה של ביטוי גני התא תלוי מארח על ידי חיקוי הסביבה שהיה נתקלה במסלול רכישה טבעית. גישה זו יכולה להיות שונה כדי להתאים לכל חיידק שמשתמש מארח מתווך כאמצעי להשגת יתרון פתוגניים.

Introduction

חיידקים פתוגנים רבה יש להתאים את האסטרטגיות כלליות לניצול תאי מארח להישרדות ושכפולה בתא תאי. במקרים רבים, מנגנונים פתוגניים דומים בין תאים מטזואניים protozoan ו. עם זאת, שני microenvironments האלה שונים מאוד ויכול לגרום לביטוי הפרש של ^1-4 גורמים ארסיים. המחלה הליגיונרים חיידק הלגיונלה pneumophila קשור ubiquitously עם סביבות מים מתוקים ⁵ ברחבי העולם. חשוב לציין, L. pneumophila טפח בתאי protozoan לפני הזיהום של מונוציטים אדם להשיג יתרון פתוגניים, מה שמרמז כי פרופילי ביטוי גנים הגלובליים של חיידק יציאת תא protozoan הם שונים מזה של במבחנה טפחה האורגניזם ^6-8. בטבע, אמבות מים מתוקים לספק גבולות עשירים ברכיבים מזינים להגברה מהירה של חיידק פולש. רכישה אנושית ל ' pneumophמנהל מקרקעי ישראל הוא לרוב מיוחס לשאיפה של טיפי מים מזוהמים המכילות את החיידק. סביר להניח כי חיידקים אלו טיפי נמל protozoan תאים נלווים; בו תאי protozoan הם עמידים יותר לשיטות טיפול במים קונבנציונליים ^9,10. זיהום של תמורת מקרופגים מכתשיים ריאה באופן כמעט זהה למחזור החיים התאי של החיידק בתאי פונדקאי protozoan ^11-13.

כדי לשרוד ולהתרבות בתאים האיקריוטים, L. pneumophila משתמש במערכת מיוחדת סוג IVB הפרשה נקראת דוט / ICM כדי לספק כמעט 300 חלבונים 'מפעיל' לcytosol של התא המארח ^14-16. חלבונים אלה מפעיל קולקטיבי לתפקד לחתור תחת תהליכים תאיים על מנת ליצור תא מתירנית שכפול לחיידק ^17,18. מחיקות בכל של 26 גנים המרכיבים את תוצאת טרנספורטר דוט / ICM בזנים פגומים לmult התאיiplication ^19-23. מבחינה הסטורית, מחיקה של גני קידוד מפעיל בודדים כמעט והביאה לזנים מוחלשים לצמיחה תאית. תופעה זו יוחסה לכמה היפותזות כוללים פונקציה מיותרת ועותקים של paralogous effectors.

החלק מהגורמים ארסיים באים לידי ביטוי רק בהקשר של צמיחת מארח תא הקשורים תאית ^24. אנו רציונליזציה שאם מפעיל מסוים בא לידי ביטוי רק בהקשר של זיהום protozoan, אז התרומה של המפעיל, אינו יכולה להשתוות עם זן פראי סוג כאשר הן היו בתרבית במבחנה. L. pneumophila מעברים מreplicative לשלב מעביר כפי שהוא נכנס שלב נייח בתרבות ^25. פנוטיפ מיתוג השלב מייצג את הדלדול התזונתי נתקל במהלך צמיחה תאית ומודגם באמצעות הרכבה של וטונים לתנועתיות ^26. בגלל L. pneumophila הוא inva יותרsive וארסי כשנקצר מתאי protozoan, אנחנו בקשנו לפתח assay שייצג את המדינה הפתוגני של החיידק נאמן יותר כאשר הוא נתקל מקרופאגים המארחים.

לצורך כך, פתח assay יחול protozoan תכליתי שיכול להכיל את כל מארח מתאים לשני (תא המטרה) זיהומי השלב הראשונים (תא יחול) ושניים. תהליך ההדבקה הוא צייתן באמצעות שימוש בחיידקים ביציבות להביע חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP). המודל לזיהום protozoan Acanthamoeba castellanii כדלקמן המתודולוגיה בשימוש נרחב בתחום ^27. לצעד הנפץ, L. זני pneumophila מעובדות במבחנה לשלב נייח בתקשורת הנוזלית לייצור חיידקים שכותרתו "העברה ל'(איור 1 א). חיידקים משמשים הבא כדי להדביק monolayers של A. castellanii עבור 18 שעות כדי להשיג שלב מאוחר של מחזור החיים התאי. וקואולות גדולה מכילהחיידקי ing ניתן דמיינו בנקודת זמן זו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 1 א). תאי protozoan מכן lysed וחיידקים התאוששו מlysate נמדדים לפליטה ב512 ננומטר באמצעות קורא צלחת פלואורסצנטי. פלואורסצנטי מתואם עם צפיפות אופטית לחישוב ריבוי-of-זיהום (משרד פנים) להדבקת תאי היעד (1 איור, * המתאם Curve). לאחר פלישה (ט ₀₎ ו 18 שלאחר פלישה (ט ₁₈₎ שעות, תאי יעד לכימות לקרינה, המייצגים חיידקים תוך תאיים. פלואורסצנטי ניתן לפקח על ידי מיקרוסקופ וcytometry זרימה, וספירת קיימא ניתן למדוד באמצעות ציפוי מושבה. Assay יחול תמיד מלווה בזיהומים עם ל 'פרא מסוג pneumophila ומתח פגום במערכת דוט / ICM הסוג הרביעית ההפרשה (Δ DotA) (איור 1 א). זה חשוב מספק בקרות פנימיות להשוואה ישירה בין פרא מסוגnd כל זנים מוטנטים isogenic המשמשים בתהליך ההדבקה. ההכללה של זן dota Δ לא האלים בשלב יחול קובעת סף לתצפית של פנוטיפים צמיחה נחלשו קשורים בזנים מוטנטים isogenic כי הם בתרבית במבחנה.

Protocol

1. הכנת תרבויות הלגיונלה pneumophila לזיהומים בשלב קרקע

1. להפוך כל L. זני pneumophila משמשים assay עם pAM239 פלסמיד, קידוד איזופרופיל β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) מושרים חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) ^28. רצף של זני חיידקים על ברזל וציסטאין תוספת N-(2-Acetamido)-2-aminoethanesulfonic חומצה (ACES) נאגר אגר תמצית שמרי פחם (CYEA) המכיל 6.25 מיקרוגרם / המ"ל chloramphenicol (CM) (לתחזוקת פלסמיד) ודגירה במשך 72 שעות ב 37 ° C.
2. ההעברה בוצע בידוד של זן החיידקים לתוך ACES תוספת נאגר מרק תמצית שמרים (כן) עם 6.25 מיקרוגרם / המ"ל CM וIPTG 1 mM ולטפח לשלב נייח (O / N) בהקפה ייקרה ב 37 ° C.
3. אשר ביטוי של GFP בתרבויות במבחנה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. העברת 10 μl של תרבות על גבי זכוכית מתחת לכיסויתלוש ותמונה באמצעות אובייקטיבי 60x עם עירור GFP / קוביית פליטה (AMG EVOS fl).
4. מדולל aliquot μl 100 של כל התרבות במבחנה ל1:10 באמצעות H ₂ O. סטרילי לעשות שימוש 100 μl כן תקשורת ריקה עם IPTG 1 mM ו6.25 מיקרוגרם / מיליליטר סנטימטר ומים. קח OD600 מדידות של הדילולים באמצעות ספקטרופוטומטר (Bio-Rad החכם Spec פלוס). לחשב את הנפח דרוש כדי להדביק גם במשרד פנים = 20 לכל התרבות במבחנה: V = [(האמבה seeded) x משרד פנים] / [OD ₆₀₀ x (גורם דילול) x (קבוע)] = [(1 X 10 ⁶ ) X (20)] / [OD ₆₀₀ x (10) x (1 x 10 ^6)] = 2/OD _600. ריכוז החיידקים נקבע כOD ₆₀₀ = 1.0 = 1 x 10 ⁹ CFU / מ"ל.

2. זיהום שלב יחול שימוש Acanthamoeba castellanii

1. לשמור ולטפח את האמבות במדיום PYG ATCC 712 ב175 סנטימטר ² צלוחיות בRT.
2. החלף תקשורת במבוי סתום אמבותtures 24 שעות לפני תחילת התרבויות הנוזליות החיידקים. באותו היום תרבויות חיידקי נוזלים התחילו, לאסוף ולספור תאים במיקרוסקופ אור באמצעות hemocytometer.
3. דלל את האמבות עם תקשורת הטריה לריכוז סופי של 1 10 ⁶ תאים / מ"ל x. זרעי צלחות 12-גם תא תרבות עם 1 aliquots המ"ל של האמבות באמצעות pipettor חוזר ולדגור על RT O / נ
4. לאחר דגירה, לשטוף את הבארות של צלחות תא התרבות גם 12-3x עם 1 המ"ל סטרילי PBS באמצעות פיפטה 10 מ"ל סרולוגית וסיוע פיפטה ידנית.
5. לאחר השאיפה של PBS, להוסיף 1ml של זיהום תקשורת (712 ATCC תקשורת PYG מינוס גלוקוז, peptone ותמצית שמרים) עם IPTG 1 מ"מ ו6.25 סנטימטר מיקרוגרם / מ"ל ​​לכל באר. דגירת הצלחות בRT לשעה 1.
6. להדביק בארות במשרד פנים = 20. צנטריפוגה את הצלחת ב 400 XG למשך 5 דקות (אפנדורף 5810R) ותצוף באמבט מים 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. להעביר לצלחת 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ חממה על 18 שעות.
7. אשר את הזיהומים באמצעות הדמית תא חייה במיקרוסקופ פלואורסצנטי לפני לארח תמוגה תא וקציר של חיידקים.

3. זריעת THP-1 תאים לזיהום שלב תא יעד

1. (בגין 24 שעתי התהליך הזה לפני הקמת תרבויות חיידקים נוזליות). לטפח THP-1 תאים ב75 סנטימטר ² צלוחיות תרבות הקרובה confluency ב1640 תקשורת RPMI עם סרום 10% חום מומת עוברי שור (FBS).
2. ספירת התאים באמצעות השעית hemocytometer, לדלל את THP-1 תאי שנת 1640 תקשורת RPMI עם 10% FBS ו 100 ng / ml phorbol-12-myristate-13-תצטט (PMA) לריכוז של 1 10 x ⁶ תאים / מ"ל , וצלחת ב1 aliquots מ"ל על צלחות תרביות תאים 12-כן. דגירת הצלחות עבור 48 שעות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2.

4. עיבוד של חיידקים לזיהום שלב תא יעד לאחר זיהום שלב Priming

1. לשאוב את התקשורת מהאמבות הדרוכות.
2. Lysemoebae באמצעות 500 μl של הקרח הקר, Ultra-המסונן (UF) H ₂ O סטרילית ולדגור על RT למשך 10 דקות.
3. ברכת lysates לפי הסוג להתאמץ ולקחת מדידת _ננומטר E ₅₁₂ עבור כל אחד מlysates אסף באמצעות קורא צלחת פלואורסצנטי (המולקולרי ההתקנים Spectramax ג'מיני EM).
4. חישוב ₆₀₀ מדידה OD לlysates אסף: calcOD ₆₀₀ = 0.0008 (E ₅₁₂ - רקע lysate) + 0.0019. הנוסחא נקבעה בעבר על ידי שרטוט השוואה ישירה של שני OD ₆₀₀ ושל _{512 ננומטר} מדידות E של דילולים של L. pneumophila GFP פראי מסוג הבעה משלב נייח בתרבות חוץ גופייה (איור 1 *). את lysates של אמבה אינה נגועה, בכפוף לאותם תנאים ניסיוניים כמו אמבה הנגועה, משמש כריק וספק ערך תיקון (למשל רקע lysate), אשר התאגד למשוואה. T הנפח הדרושo להדביק גם במשרד פנים = 20 מחושב לכל ברכת lysate: V = [(THP-1 seeded) x משרד פנים] / [calcOD ₆₀₀ x (קבוע)] = [(1 X 10 ⁶⁾ x (20)] / [CalcOD ₆₀₀ x (1 x 10 ^6)] = 20 / calcOD _600.
5. שטוף את THP-1 תאי 3x עם PBS ולהוסיף 1 המ"ל RPMI טרי 1640 (10% FBS) לכל באר. THP-1 תאי דגירה במשך השעה 1 ב 37 ° C, 5% CO _2.
6. להדביק את תאי THP-1 במשרד פנים המחושבים באמצעות lysates אסף. אפשר סט של בארות להישאר נגוע, ושמש כשליטה שלילית לניתוח cytometric זרימה. העיבוד לבמה תחול אמור להסתיים בפחות מ 30 דקות. את lysates נשמרים על קרח כדי להגביל כל שינויים בביטוי גני חיידקים לפני הזיהום.
7. צנטריפוגה את הצלחת, לצוף להעלות את הטמפרטורה, ולדגור כמו בשלב יחול.
8. שעה אחת לאחר פגיעה, להסיר את המדיה על ידי שאיפה ולשטוף בארות 3x עם PBS להסיר חיידקים תאיים.
9. הוסף 1 מ"ל fresh RPMI 1640 (10% FBS) לבארות ולהחזיר את הצלחת לאינקובטור. הזמן מייד לאחר החלפת מדיה משמש כזמן אפס (ט _0). דגירת THP-1 התאים עבור 14-16 שעות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2.

5. ניתוח ניסויי

הדמית תא חייה 5.1

תמונת הבארות הנגועות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (AMG EVOS fl) ב10X או 20X הגדלה (תרשימי 1A-D). את התמונות ניתן להשוות בין איכותי או כמותית לקביעת רמות הזיהום הוא בשלב האתחול וזיהומים בשלב תא המטרה.

cytometry זרימה 5.2

1. פסגות הפליטה של ​​זיהומים שונים ניתן להשוות על ידי cytometry זרימה (FACS BD Calibur). Trypsinize את THP-1 התאים הנגועים ולשטוף בעדינות אותם מהבארות ידי הערבוב ב PBS עם פיפטה.
2. ברכת התאים לפי סוג הזן לתוך 15 מ"ל פלקון צינורות וגלולים ב 1800 XG ל2דקות בצנטריפוגה בראש הטבלה.
3. להשעות את הכדורים במ"ל PBS 1 ותעביר ל1.5 צינורות microcentrifuge מ"ל.
4. צנטריפוגה את המתלים ב1800 x גרם (אפנדורף 5424) ומחדש להשעות את הכדורים במ"ל PBS 1. אם כתוצאה מכך הם ההשעיות עכורות מאוד (OD ₆₀₀ ≥ 1.0) הם חייבים להיות מדוללים ב PBS נוסף (1:03) כדי למנוע סתימה של הקווים בcytometer הזרימה.
5. השתמש PBS סטרילי המסונן לאיזון של cytometer הזרימה ועל צעדים לרחוץ בין זריקות לדוגמה. עלילה מתפזרת קדימה / צד של תאי המטרה נגועים לפני ההזרקה של דגימות זיהום תא המטרה.
6. לאסוף 20,000 אירועים כלל לכל מצב באמצעות עירור 488 ננומטר ליזר וערוץ FL1.
7. אוכלוסיות תאים שלאחר לכידת שער להוציא תאים נגועים ואינטנסיביות עלילת פלואורסצנטי ביסטוגרמה (FlowJo) (האיור 1E).

5.3 ציפוי CFU

1. לבחון את יעילות oזיהום F ע"י ציפוי CFU של התאים נקצרו עבור cytometry זרימה. הכן דילולים סידוריים של הדגימות בH ₂ O Ultra-מסונן ב -10 ^-1, 10 ^-2, ו10 ^-3.
2. 20 μl הצלחת של כל דילול על 1/3 מצלחת CYEA עם 6.25 מיקרוגרם / המ"ל סי.
3. דגירת הצלחות על 37 מעלות צלזיוס למשך 72 שעות.
4. לספור את המושבות באמצעות קיסם ודלפק תא.

תוצאות

תוצאה אופיינית לתהליך ההדבקה כל מתוארת באיור 1. לחיות micrographs קרינה סלולרית המתאר monolayers של A.castellanii נגוע בL. פראי מהסוג pneumophila בשלב יחול מוצג באיור 1 א. מידת הצלחה של הצעד יחולו תוביל לאוכלוסייה של כ 90% מתאי המארח המכילים וקואולות גדולה המא...

Discussion

ביטוי גני חיידקי נתונה לפיקוח הדוק באמצעות שילוב של התקדמות ותגובה לאותות בmicroenvironment סביב מחזור חיים. פתוגנים Vacuolar כגון L. pneumophila להגיב לשפע של רמזים מארחים תא המופקים כאשר ממודר בphagosome. כתוצאה קולקטיבית של תשישות תזונתית בתא הפונדקאי, החיידק מפצה על ידי הבעת גורמ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
chloramphenicol	Fisher Scientific	BP904-100	antibiotic
IPTG	Fisher Scientific	BP1755-10
ACES	Sigma	A9758-1KG	media component
ATCC medium: 712 PYG	ATCC		growth media for protozoans
1X PBS	Fisher Scientific	SH30256FS	phosphate buffered saline
activated charcoal	Fisher Scientific	C272-212	media component
yeast extract	Fisher Scientific	BP1422-500	media component
peptone	BD Diagnostics	211677	media component
agar	Fisher Scientific	BP1423-2	media component
L-cysteine, 99%+	Acros organics	173601000	media supplement
Ferric nitrate nonahydrate	Fisher Scientific	I110-100	media supplement
Equipment
EVOS fl	AMG	EVOS fl	fluorescence microscope
Smart Spec Plus	Bio-Rad	170-2525	spectrophotometer
5810 R centrifuge	Eppendorf	22627023	bench top centrifuge
Repeater plus	Eppendorf	22230201	repeating pipette
SpectraMax Gemini EM	Molecular Devices		microplate reader
Softmax Pro 5.3	Molecular Devices	0200-310	microplate reader software
5424 microfuge	Eppendorf	22620401	table top microcentrifuge
Fast-release pipette pump II	Scienceware	379111010	pipette aid
FACS Calibur	BD Bioscience		flow cytometer
FlowJo 7.6.1	FlowJo	license	flow cytometery software
15 ml tube	BD Falcon	352096	polypropylene conical tube
1.6 ml microfuge tube	Neptune	3745.X	microcentrifuge tubes