GST-טיהור: שני שלבי זיקה טיהור פרוטוקול מניב חלבונים מטוהרים באורך מלא

Summary

בפרוטוקול הנוכחי, אנו מדגימים שיטה יעילה וחסכונית מאוד בקנה מידה קטן טיהור חלבונים, המאפשרת טיהור של חלבונים רקומביננטיים על ידי באופן ייחודי המשלב GST-תג cleavable והתג שלו קטן.

Abstract

מבחני מפתח בהאינזימולוגיה לאפיון ביוכימי של חלבונים במבחנה מחייבים ריכוז גבוה של החלבונים המטוהרים של עניין. פרוטוקולי טיהור חלבון צריכים לשלב יעילות, פשטות ויעילות עלות ^1. כאן, אנו מתארים את שיטת GST-כמערכת חדשה בקנה מידה קטן טיהור זיקה לחלבונים רקומביננטיים, המבוססת על תג N-מסוף גלוטתיון Sepharose (GST) ^2,3 ותג 10xHis טרמינל ^C-4, אשר שניהם התמזגו לחלבון של עניין. המבנה השני משמש להפקת baculoviruses, לזיהום של תאים נגועים Sf9 לביטוי חלבון ^5. GST הוא תג ארוך למדי (29 KDA) המשמש כדי להבטיח את יעילות טיהור. עם זאת, זה יכול להשפיע על תכונות פיסיולוגיות של החלבון. לפיכך, הוא ביקע לאחר מכן את החלבון באמצעות אנזים PreScission ^6. על מנת להבטיח את טוהר מרבי וכדי להסיר את GST ביקע, אנחנוהוסיף צעד טיהור הזיקה שני המבוסס על התג שלו קטן יחסית. חשוב מכך, הטכניקה שלנו מבוססת על שני תגים שונים איגוף שני קצוות של החלבון, אשר הוא כלי יעיל כדי להסיר חלבונים מושפלים, ולכן מעשיר את החלבונים באורך מלא. השיטה שהוצגה כאן אינה דורשת התקנת אינסטרומנטלי יקרה, כגון FPLC. בנוסף, אנו משולבים MgCl ₂ ושוטף ATP כדי להסיר זיהומים חלבון הלם חום וטיפול nuclease לבטל לזהם חומצות גרעין. לסיכום, השילוב של שני תגים שונים איגוף N-וה-C-מסוף ואת היכולת לבקע את אחד מהתגים, ערבויות ההתאוששות של חלבון נקי במיוחד ואורך מלא של עניין.

Introduction

הטיהור של חלבונים רקומביננטי היא חיונית כדי לענות על שאלות בסיסיות בביוכימיה. דרכים מקובלות של טיהור חלבונים כמו כרומטוגרפיה חילוף יונים והרחקת גודל כרומטוגרפיה להסתמך על תכונות פיסיקליות של חלבון המטרה, כגון נקודה איזואלקטרית ותשלום או גודל, בהתאמה. מאפייני החלבון האחרונים משותפים למגוון של חלבונים, אשר מגדיל באופן משמעותי את הסיכוי לזיהום חלבונים באסטרטגיות טיהור חלבונים קונבנציונליות. בעיה זו עלולה לעקוף עם השימוש בעמודות טיהור מרובות, אשר זה זמן רב. במקביל, שיטות כרומטוגרפיה האחרונות דורשות התקנה ניסיונית יקרה. טיהור זיקת תג מגביר משמעותית יעד ספציפי, כמו ברוב המקרים התג יהיה ייחודי לחלבון של עניין. במחקרים שנערך לאחרונה, טיהור דגל או HA-זיקה כבר בשימוש נרחב.

בניגוד לrec הקייםפרוטוקולי טיהור חלבוני ombinant הבמשמשים תגים בודדים, הקמנו את השילוב הייחודי של שני תגים. השיטה שלנו כרוכה ההיתוך של GST-תג בN-הסופית והתג שלו בC-הסופית של החלבון של עניין, ליחס אופטימלי בין הכמות וטוהר של החלבון הרצוי. GST הוא תג ארוך (29 KDA), שהוא יעיל ביותר לטיהור בחרוזי Sepharose גלוטתיון. יתר על כן, באמצעות GST מבטיח עלות אפקטיביות של שיטת ¹ שלנו. האפשרות לבקע את GST עם אנזים PreScission (עם רצף הכרת LeuGluValLeuPheGln / GlyPro, וכתוצאה מכך התוספת של רק שתי חומצות אמינו) יש יתרונות רבים, למשל, אסטרטגיה זו תמנע שינויים של פונקציות החלבון הפיזיולוגיות בשל הפרעה allosteric. התג שלו הקטן התמזגו הגפיים חלבון האחרים משמש בשלב טיהור שני כדי להגדיל את טוהר חלבון על ידי שטיפה את GST ביקע, כמו גם חלבונים ואחרים מושפלים מזהמים. בנוסף, הפרוטוקול אינו מחייב צעד דיאליזה בעת מעבר מGST לעמודה שלו לטיהור צעד (שרף TALON). מזהמים נפוצים בתהליכי טיהור כאלה הם החלבונים Heat Shock (HSP). התוספת של שלב דגירה עם MgCl ₂ ו-ATP מאפשרת הסרת המזהמים אלה (איור 1).

חלבון מהיר כרומטוגרפיה נוזלית (FPLC) וביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית (HPLC) הן טכניקות נפוצות שתלויה במכשור יקר לייצר תשואה גבוהה של החלבון מטוהר של עניין. פרוטוקול הטיהור אצווה אנו מציגים כאן, לעומת זאת, הוא ידני ואינו דורש התקנת אינסטרומנטלי יקרה. ניתן להגיע לתשואה גבוהה של חלבון על ידי דרוג את הפרוטוקול. במקביל, עם פרוטוקול הטיהור אצווה, elution הנפח יכול להיות מותאם על מנת לשפר את ריכוז חלבון, שאינו נתון עם FPLC או HPLC.

ntent "> כמו כן, עם GST-פרוטוקול הטיהור אצווה, חלבונים עם גודל טווח של ~ 10-300 kDa יכולים להיות מטוהרים. אחד היתרונות הגדולים ביותר הוא שניתן על ידי העובדה שאחד יכול לטהר כמה חלבונים באותו הזמן , למשל, שניהם wild-type ו המוטציה בחלבון שלה. ההצלחה של הפרוטוקול המובא אך ורק תלוי ברמת הביטוי והמסיסות של החלבון של עניין.

Protocol

1. ייצור רקומביננטי baculovirus

Baculoviruses מופקים באמצעות מערכת ביטוי baculovirus Bac-to-Bac של Invitrogen בעיקר על פי הפרוטוקול של היצרן עם שינויים קלים בלבד:

1. וקטור pFastBac1 שונה (Gibco, חיים) נוצר המכיל GST ו תגים (איור 2). אתר MultiCloning (MCS) של וקטור PET-52b (+) (Novagen), המכיל 10xHis תג, היה מוכנס לתוך MCS של וקטור pFastBac1 ליצור pFastBac1 סטרפטוקוקוס-10xHis. רצף MCS PET-52b (+) היה PCR המוגבר בין אתרי הגבלת XbaI וBlpI, הוספת אתר BglII הגבלה ב5 'בגפיים ובאתר הגבלת HindIII ב3' בגפיים. מוצר ה-PCR שוכפל לאחר מכן בין BamHI ואתר הגבלת HindIII של pFastBac1, באמצעות ההתאמה של רצפי הגבלת BamHI וBglII. מאחר שהמטרה הייתה ליצור pFastBac1 המאפשר הביטוי שלחלבון רקומביננטי עם streptavidin ו10xHis תגים, אתר הגבלת BamHI של PET-52b (+) רצף MCS לא היה בשימוש. כמו כן, אתר הגבלת XbaI לא היה בשימוש, כדי למנוע את היתירות של אתרי הגבלה המתרחשים בין האתרים שכבר בMCS של pFastBac1 ואלה הוכנסו עם MCS של PET-52b (+). רצף קידוד GST עם אתר PreScission פרוטאז ההכרה (LeuGluValLeuPheGln / GlyPro) היה אז מוכנס לתוך pFastBac1 סטרפטוקוקוס-10xHis. רצף GST cDNA מpGEX-6P-2 (GE Healthcare) היה מוגבר PCR עם פריימרים המכילים אתרי הגבלת NcoI וKpnI ב5 'ו 3' גפיים, בהתאמה. אתר NcoI מאפשר תוספת של קודון התחלה אלא גם אלאנין לGST. מוצר ה-PCR היה אז משובט לתוך pFastBac1 סטרפטוקוקוס-10xHis בין אתרי הגבלת NcoI וKpnI, וכתוצאה מהמחיקה של Streptavidin התג. וקטור ההיתוך החדש ובכך הושג נקרא pFastBac1-GST-10xHis.
2. Clone קידוד cDNA ליחסי הציבורotein עניין לתוך וקטור pFastBac-GST-10xHis בין GST (N-מסוף) והתג שלו (בטרמינל C-). להיות זהיר כדי להסיר את קודון עצירת cDNA כדי לאפשר האיחוי עם התג שלו בטרמינל C-.
3. להפוך את ה coli DH10Bac עם pFastBac רקומביננטי (המתקבל בשלב 1.2) על מנת ליצור את bacmid. לאפשר מושבות לגדול בין לילה על 37 מעלות צלזיוס וכמה שעות ב30 ° C על צלחות סלקציה המכילות Bluo-gal וIPTG (10 מיקרוגרם / מיליליטר tetracyclin, 50 מיקרוגרם / מיליליטר kanamycin, 7 מיקרוגרם / מיליליטר gentamycin, 100 מיקרוגרם / מיליליטר Bluo- גל, 40 מיקרוגרם / מיליליטר IPTG).
4. פיק וrestreak 2 מושבות הלבנות (משלב 1.3) על צלחות בחירה כדי לאשר את הפנוטיפ הלבן.
5. לחסן 2 מיליליטר של LB המכיל 10 מיקרוגרם / מיליליטר tetracyclin, 50 מיקרוגרם / מיליליטר kanamycin, 10 מיקרוגרם / מיליליטר gentamycin עם שתי מושבות הלבנות משלב 1.4 ולתת להם לגדול בין לילה תחת תסיסה (250 סל"ד) ב 37 ° C.
6. כדי לטהר את ה-DNA bacmid, גלולה החיידקים מצעד 1.5,resuspend התאים 300 μl של פתרון שאני ולהוסיף 300 μl של הפתרון השני (ערכת Maxiprep מQiagen). דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר, להוסיף 300 μl של 3 M KOAc pH 5.5 ודגירה של 10 דקות על קרח. צנטריפוגה הדגימות ב 4 ° C, מהירות מקסימלית עבור 10 דקות. הוספת 800 μl של isopropanol לsupernatants ודגירה של 10 דקות על קרח. צנטריפוגה הדגימות ל15 דקות ב 4 ° C ולשטוף את הכדור עם 500 μl של 70% אתנול. תן את הכדור יבש וresuspend אותו בתנאים סטריליים ב40 μl של טריס-EDTA pH 8.0. ה-DNA bacmid יש לאחסן ב 4 ° C.
7. צור baculoviruses כפי שתואר בפרוטוקול של היצרן. ניתן לאחסן Baculoviruses ב 4 ° C המוגנים מפני אור.

2. ביטוי חלבון רקומביננטי

1. על מנת לבחור את baculovirus יעיל ביותר לטיהור וכדי לפקח על מה שפעם הוא הגיע לשיא של ביטוי חלבון, לבצע assay מיני זיהוםים כדלקמן: להדביק 2 x 10 ⁷ של Sf9 נגועים תאים בתרבית ב27 מעלות צלזיוס בתקשורת של גרייס (השלימה עם 10% FBS ו -1% P / S) עם 133 μl (1/150) של baculovirus. לאסוף aliquots של 1.5 מיליליטר ב 0, 24, 48, ו72 שעות לאחר פגיעה. גלולה התאים ולנתח את רמת הביטוי של החלבון של עניין על ידי מערבי סופג באמצעות נוגדנים נגד תג.
2. השתמש baculovirus יעיל ביותר משלב 2.1 להדביק טווה מכילה 1.0 x 10 ⁶ תאי Sf9 לכל מיליליטר ב500 מיליליטר של תקשורת עם יחס של 1/150 בין הווירוס ואמצעי תקשורת. בואו התאים הנגועים לגדול בתרחיף ב27 מעלות צלזיוס ולאסוף את התאים כאשר ביטוי החלבון המרבי (כפי שנקבע בשלב 2.1 לעיל) הוא הגיע. ניתן לאחסן את תאי pelleted ב-80 ° C עד שימוש נוסף.

3. הכנת lysate תא מסיס

את כל שלבי הדגירה הבאות מתבצעים על 4 מעלות צלזיוס בסיבוב קל.

1. Lyse Sתאי F9 לבטא חלבון עניין שלך ב~ 20 מיליליטר של חיץ מחייב GST (150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.05% Triton-X-100, מעכבי פרוטאז 1 מ"מ DTT בPBS1X לריכוז סופי של NaCl של 250 מ"מ, ו קוקטייל (Roche). באמבט מי קרח, dounce הפתרון 20x עם homogenizer dounce, sonicate 3x 30 שניות כל אחד (פלט 70%), וDounce שוב 20x.
2. (אופציונאלי). דגירה הכולל lysate התא עם 1 מ"מ MgCl ₂ וBenzonase ⁷ nuclease (2.5 U / ml) ל30 דקות ב 4 ° C כדי להסיר DNA או RNA זיהום.
3. צנטריפוגה ב 18,000 סל"ד במשך 30 דקות ב 4 ° C. שמור את supernatant.
4. (אופציונאלי). צנטריפוגה supernatant שוב ל30 דקות ב 18,000 סל"ד ב 4 ° C כדי לקבל lysate מסיס ברור. להעביר את supernatant דרך פילטר 0.2 או 0.45 מיקרומטר כדי למנוע סתימה.

4. כריכה של חלבון על חרוזים GST

1. דגירה lysate התא מסיס עם 1 מיליליטר של חרוזים GST (prewashed שתי פעמים עם10 מיליליטר של GST מחייב חיץ) במשך שעה 1 ב 4 ° C בסיבוב עדין.

הערה: זמן הדגירה צריך להיות מותאם בהתאם ליציבות של החלבון והיעילות מחייבת.

2. סיבוב מהיר ב700 סל"ד ולהסיר supernatant המכיל חלבונים מאוגדים (זה יכול להיות כל הזמן לניתוח נוסף). שטוף את החלבונים הנכנס GST (איור 3B, מסלול 1) עם חיץ הכביסה GST (GST חיץ מחייב עם 350 סופי מ"מ NaCl).
3. חזור על שלב 4.2 2x. בשטיפה האחרונה, להסיר כמה שיותר supernatant ככל האפשר.
4. דגירה את החרוזים עם 5 מ"מ ה-ATP ו15 מ"מ MgCl ₂ (ב 10 מיליליטר חיץ מחייב GST) במשך שעה 1 ב 4 ° C כדי למנוע ספציפי מחייב של חלבוני חום הלם ^8. שטוף את החרוזים שלוש פעמים עם חיץ הכביסה GST.

5. PreScission מחשוף של GST

1. צנטריפוגה חרוזים GST, להסיר את supernatant ולשטוף את חרוזי GST עם buf P5fer (50 ₄ pH מ"מ NaHPO 7.0, 500 mM NaCl, גליצרול 10%, 0.05% Triton-X-100, 5 imidazole מ"מ).
2. דגירה GST-החרוזים עם אנזים PreScission במאגר P5 מ3 שעות ללילה בשעה 4 ° C. (מחלקים את חרוזים GST בשברים של 100 μl ולהוסיף 4-8 יחידות (2-4 μl) של אנזים המדולל בשל חיץ P5 100 μl).

הערה: זמן הדגירה של צעד PreScission צריך להיות מותאם לפי המשקל המולקולרי, כמו גם את היציבות של החלבון. אם השפלה הוא ציין, זמן דגירה זה יכול להיות ירידה למינימום של 2 שעות במקום למשך הלילה.

3. ספין מהיר ולאסוף את supernatant. חזור על פעולה זו פעמיים לאחר הוספה של P5 100 μl חיץ לחרוזים וברכה כל השברים (איור 3B, מסלול 2).

הערה: חרוזים הנותרים יכולים לשמש לניתוח יעילות מחשוף (איור 3B , מסלול 3). בדרך כלל, 70-80% מהחלבון הוא ביקע.

6. לTALON מתכת זיקה שרף מחייב חלבון

1. מחלקים את elution מלמעלה ל3 שברים של 1 מיליליטר ודגירה כל אחד עם 100 חרוזים μl שרף זיקת מתכת טאלון יבשים (prewashed שתי פעמים עם חיץ P5) במשך שעה 1 בסיבוב.

הערה: חלוקת elution בכמה שברים מגבירה את יעילות מחייב / שוטף.

2. שטוף את דקות שרף 5 עם חיץ P30 (חיץ P5 עם ריכוז סופי של 30 imidazole מ"מ).
3. חזור על שלב 6.2 2x וברכת חרוזים בצינור יחיד. לפני השטיפה האחרונה, להסיר כמה שיותר supernatant ככל האפשר.

תגובה: זה מתאים למדגם TALON המאוגד (איור 3B, מסלול 4).

7. Elution של החלבון המטוהר

1. דגירה שרף TALON חלבון קשורה למשך 5 דקות ברוטציה עם P500 חיץ (חיץ P5 עם ריכוז סופי של 500 imidazole מ"מ). השתמש יחס בין החיץ וחרוזים של 1:1 v / נ (לדוגמא, אם אתה לקח 200 μl של חרוזים יבשים, תצטרך להוסיף 200 μl של P500). חזור על פעולה זו פעמיים ולשמור על כל שבריר eluted בנפרד (בשם elution 1 (E1), elution 2 (E2) וelution 3 (E3); איור 3B, נתיבי 5-7).

הערה: חרוזים הנותרים יכולים לשמש לניתוח יעילות elution (איור 3B, ליין 8). בדרך כלל, 60-80% מהחלבון eluted בסך הכל.

2. נתח את הכמות ואיכות של החלבון מטוהר על ידי טעינה כ 20-40 μl של כל חלק עם ריכוז BSA סטנדרטי על SDS-PAGE וכתם עם Coomassie כחול (איור 3 ב) או כתם חלבון SYPRO לשם ויזואליזציה.

תגובה: החלבון של עניין יכול גם להתגלות throughout הליך הטיהור באמצעות אנטי GST ונוגדנים נגדו (איור 3 ג).

8. אחסון של החלבון המטוהר

1. Dialyze החלבון מטוהר נגד חיץ אחסון מתאים (למשל 20 מ"מ טריס אצטט pH 8.0, 200 מ"מ כץ, 10% גליצרול, 1 mM EDTA, 0.5 מ"מ DTT) ב 4 ° C. חשוב לבדוק למשקעים של החלבונים המטוהרים במהלך הדיאליזה. בדרך כלל אנחנו dialyze 2x עבור שעה 1 על 4 מעלות צלזיוס תחת סיבוב תסיסה.
2. הפוך aliquots הקטנים של החלבונים המטוהרים (10-20 μl) ולהקפיא בקרח יבש ל30 דקות. אחסן את aliquots ב -80 מעלות צלזיוס ולמנוע הפשרה / הקפאת מחזורים רבים.

תוצאות

כדי להמחיש את היעילות של GST-פרוטוקול הטיהור, אנחנו מטוהרים Rec14, ס חלבון pombe של 32.9 kDa. Rec14 cDNA שובט בוקטור pFastBac1 שונה שלנו ומאפשר תוספות של GST-ו תגים בN-ו-C-Termini, בהתאמה (איור 1 א). baculovirus רקומביננטי הוכן לאחר מכן ונהג להדביק תאים נגועים SF9 לביטוי חלבון. Lysates התא ...

Discussion

GST-פרוטוקול הטיהור שהוצג כאן מתאים לטיהור של מגוון רחב של גדלים של חלבונים רקומביננטיים: אנחנו מטוהרים בהצלחה לי RAD51 (41kDa), piBRCA2 (120kDa), PALB2 (130kDa), וחלבון לא יציב משקל מולקולרי גבוה של infantum שושנת יריחו: Li-BRCA2 (125kDa) ^6,9. יתר על כן, החלבונים מטוהרים עם פרוטוקול זה ה?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
E.Coli DH10Bac (competent)	Invitrogen
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System	Invitrogen
Maxi Prep Kit	Qiagen	12163	Solution I and II
Ultra Pure Bluo-Gal	Gibco (Life)	15519028
IPTG	Gibco (Life)	15529019
Sf9 infected cells	ATCC	CRL-1711
PreScission enzyme	GE Healthcare	27084301
Grace's infected medium supplemented	Gibco (Life)	11605-094
Fetal Bovine Serum characterized	Hyclone	SH30396.03
P/S (Penicillin-Streptomycin)	Gibco (Life)	15070-063
Glutathione Sepharose resin	GE bioscience	17075605
Protease inhibitor cocktail	Roche	11873580001
Talon resin	Clontech	635504
Imidazole	BioShop	288324
Gentamicin	Gibco (Life)	15710064
Polyclonal GST-antibody	Production in house
Monoclonal 6X-His-antibody	Clontech	631212
EQUIPMENT
Dounce homogenizer (tight)	Wheaton	357546
Sonicator (Fisher dismembrator)	Fisher	Model 150
Dialysis bag (50 mm)	Fisher Scientific	2115217