שיטה לבידוד עכבר הלבלב איילט וקביעת תאית cAMP

Summary

מנסה לאמוד בתפקוד β-תאי מבחנה באמצעות עכבר איים מבודדים לנגרהנס הוא מרכיב חשוב במחקר של הפתופיזיולוגיה סוכרת ותרופות. בעוד רבים יישומים במורד הזרם זמינים, פרוטוקול זה מתאר במפורש המדידה של monophosphate אדנוזין המחזורי תאיים (cAMP) כפרמטר חיוני קביעת פונקצית β-תאים.

Abstract

הגלוקוז לא מבוקר הוא סימן היכר של סוכרת ומקדם נלוות כמו נוירופתיה, נפרופתיה ורטינופתיה. עם השכיחות הגוברת של סוכרת, הן סוג החיסון בתיווך 1 וסוג 2 צמוד להשמנת יתר, מחקרים שמטרתם מגדירים הפתופיזיולוגיה סוכרת ומנגנונים טיפוליים הם בעלי חשיבות קריטית. Β-התאים של איי הלבלב לנגרהנס אחראים כראוי מפרישי אינסולין בתגובה לריכוז הגלוקוז בדם גבוה. בנוסף לגלוקוז וחומרים מזינים אחרים, β-התאים גם מגורה על ידי הורמונים מסוימים, כינה incretins, אשר מופרשים מהבטן בתגובה לארוחה ולפעול על קולטני β-תאים המגבירים את הייצור של monophosphate אדנוזין המחזורי תאיים ( cAMP). ירידה בתפקוד β-תא, מסה, ואת היענות אינקרטין הם הבינו היטב לתרום לפתופיזיולוגיה של סוכרת מסוג 2, וגם להיות מקושר יותר ויותר wiה סוכרת מסוג 1. הבידוד הנוכחי עכבר איון ופרוטוקול נחישות cAMP יכולים להיות כלי כדי לעזור להתוות מנגנוני קידום התקדמות מחלה והתערבויות טיפוליות, בעיקר אלה שמתווכים על ידי קולטנים אינקרטין או קשור קולטנים הפועלים באמצעות אפנון של ייצור cAMP תוך תאי. בעוד מדידות cAMP רק תתואר, פרוטוקול בידוד איון תאר יוצר הכנה נקייה שמאפשרת גם ליישומים רבים במורד הזרם אחרים, כוללים גלוקוז מגורה הפרשת אינסולין, [3 ^{H]-תימידין} התאגדות, שפע חלבון, וביטוי mRNA.

Introduction

התחזוקה הקפדנית של euglycemia היא הכרחית כדי למנוע נלוות כגון נוירופתיה, נפרופתיה ורטינופתיה, שהם כולם סימני ההיכר של פתולוגיה מסוג בלתי מבוקר 1 ו 2 סוכרת ^1. פונקציה מופחתת β-תאים ומסה בשני מהסוג 1 וסוכרת 2 להפריע ריכוז הגלוקוז בדם ^2. ואילו סוג החיסון בתיווך תוצאות 1 סוכרת מאובדן הרסני של β-תאים מייצרי אינסולין, הפרשה לקויה β-תאים לאינסולין ואינסולין איתות היקפית בסוכרת מסוג 2 יחד לקדם היפרגליקמיה, דיסליפידמיה, וייצור הגלוקוז בכבד מוגבר, שסופו של דבר תוצאה הוא גם אובדן מסת β-תא והפרשת אינסולין מקיבולת β-תאים בודדים ^3. הבנת מנגנוני β-תאי הבסיס בהתקדמות מסוג 1 וסוכרת 2 יהיה בתקווה להצמיח טיפולים חדשניים למניעה וטיפול במחלות אלה.

בti המבחנהמודלים תרבות ssue, כגון INS-1 וMIN6 הונצחו קווי β-תאים, יכולים להיות כלי שימושי להבנת פונקציות β-תאים ספציפיים. עם זאת, אינטראקציות בין סוגי התאים השונים בתוך איון עשויים עצמם מווסתים את תפקוד β-תאים. לדוגמא, ההשפעה אוטוקריני של גלוקגון (שוחררה מα-תאים) וסומטוסטטין (שוחרר מδ-תאים) בהגדלת והקטנת הפרשת אינסולין, בהתאמה, מדגים את החשיבות של תא תא קירבה בתגובה האנדוקרינית ^4. יתר על כן, צמתים פער בין β-תאים להגביר את שחרור אינסולין ^5. יתר על כן, למרות שצעדים שנעשו ביצירת קווי insulinoma שיותר טוב לשכפל את התגובה הפיזיולוגית של איים מבודדים לגלוקוז (לדוגמא, INS-1 נגזר 832/13 ו832/3 שורות תאים), היענות הגלוקוז שלהם עדיין שונה מעכברים רגילים האיונים ^6,7. יתר על כן, התגובה של שורות תאים אלה משובטים insulinomaלאגוניסטים כמו גלוקגון פפטיד -1 (GLP-1) יכולה להיות שונה באופן דרמטי מזה, כמו גם מאיונים רגילים ^6. לכן, שורות תאים הונצחו לא יכולות לייצג את המודל הטוב ביותר למנסה לאמוד סוכנים המשפיעים על ייצור cAMP.

בניגוד לשורות תאי שמקורם בinsulinoma, לומד פונקצית β-תאים אך ורק במודלים של בעלי החיים כולו מציע סדרה של סיבוכים משלו. אחד האתגרים הגדולים ביותר בעבודה עם רקמה האנדוקרינית מודד את הריכוז המדויק של הורמון שפורסם. באופן ספציפי, הכבד ממלא תפקיד מרכזי בחילוף חומרים של אינסולין, וזרימת דם הלבלב הולכת ישירות אל הכבד. לפיכך, מדידת אינסולין בפלזמה לא יכולה לתאר במדויק את כמויות אינסולין שמופרשות מהלבלב עצמו או את ההשפעה של טיפולים שונים על שיעור הפרשת אינסולין ^8. יתר על כן, חילוף חומרים של כליות של גלוקגון עלול להגביל את מהימנות פלט גלוקגון מהאיון α-תאים ⁹. לכן, בידוד איונים עכבר עיקריים לניסויים במבחנה מספק הבנה מדויקת יותר של אופן שבו איון מגיב לגירויים ספציפיים כדי להשלים את המדידות שנעשו בגוף חי.

הפרוטוקול הנוכחי לבידוד של איי עכבר הוא פרוטוקול מבוסס היטב בשימוש על ידי מספר הקבוצות (עם שינויים קלים שעשויות לעזור כדי להגדיל את ההצלחה) ^10,11. בנוסף, קביעת ייצור cAMP מאפשרת קריאה מתוך ישירה של היענות אינקרטין של β-התאים. בשילוב עם מדידת cAMP, תכולת חלבון והפרשת אינסולין גם ניתן לכמת מאותו מכין מדגם cAMP, עוזר לקבוע אם פגם בתפקודו β-תאים טמון פרוקסימלי או דיסטלי למחנה ^10. התוכן הסופי cAMP ויישום הפרשת אינסולין בפרוטוקול זה יכול להיות כלי רב עוצמה להבנת ההשפעה של מרכיבי תרופות ומזון, בין השארים, על מחנה והפרשת אינסולין. בנוסף לגירוי מגלוקוז לבד, יכולה להיות בשימוש תרכובות אחרות כדי למדוד שינויים במחנה והפרשת אינסולין ^10,11.

לבסוף, למרות שהאינסולין הוא ההורמון העיקרי שאנחנו assay מאיים מבודדים, הורמונים אחרים, כגון גלוקגון וסומטוסטטין, כמו גם ציטוקינים, eicosanoids, וmonophosphate אדנוזין המחזורי, ניתן גם למדוד, או על ידי assay גירוי חולף או על ידי כימות הרמות שלהם במדיום תרבות ^12. לבסוף, למרות שמחוץ לתחום של כתב היד הזה, בידוד איון עם שיטת בידוד collagenase תאר מאפשר לשימור איון, כך שיישומים רבים אחרים במורד הזרם עשויים להיות נרדפים, כגון השתלת איון, בידוד RNA בזמן אמת PCR כמוני או microarray מנתח, חלבון בידוד מערבי סופג, הטבעת איון וההדמיה immunofluorescent, ושילוב [3H]-תימידין כמדד לrepli תא איוןקטיון, שחלקם כבר תאר במאמרי יופיטר הקודמים ^13-16. בסך הכל, בעקבות הליך בידוד איון שתואר בפרוטוקול עשוי לספק חוקר עם מידע חשוב ושימושי לפיתוח טיפולים וקידום גילוי תרופות שמטרתן שיפור תפקוד β-תאים.

Protocol

כל הניסויים בבעלי החיים בוצעו בהתאם לכל הנחיות הרלוונטיות, תקנות ורשויות רגולטוריות. הפרוטוקול שמפגינים בוצע תחת הדרכתו ואישור הוועדה המוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) מאוניברסיטת ויסקונסין במדיסון.

1. הכנת פתרונות

1. השיטה של ​​המתת חסד בפרוטוקול זה היא exsanguination תחת ההרדמה Avertin (לסקירה של חלופות, ראה דיון). כדי להפוך Avertin, להוסיף 0.625 g (1.25% או 44.2 מ"מ) של tribromoethanol 2-2-2 ל1.25 מיליליטר של 2-methyl-2-butanol בצינור חרוטי 15 מיליליטר וחום ב37 מעלות צלזיוס למשך 20-30 דקות. מערבולת פתרון גבוה עבור 10-15 שניות בכל פעם כדי לפזר את tribromoethanol 2-2-2 באופן מלא. ברגע שנמס לגמרי, מוסיף את הפתרון ל48.75 מיליליטר של H ₂ O מזוקק פעמיים, לסנן דרך פילטר 0.45 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר חדש, לעטוף 50 מיליליטר חרוטיצינור אל ברדיד אלומיניום ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד חודש. תביא את הצינור לRT לפני הזרקת עכברים.
2. כדי להפוך את תמיסת מלח מאוזנת "הנקס (HBSS), לפצות 1 L 1x HBSS ממניות 10x (Gibco, טכנולוגיות חיים, קרלסבד, קליפורניה) בH מזוקק פעמיים ₂ O, להוסיף 0.35 g (4.2 מ"מ) נאצ'ו _3, וחנות ב-C ° 4 עד 1 חודש. לכל עכבר, 105 מיליליטר של פתרון זה (בתוספת 5-10 מיליליטר נוסף עבור pipetting שגיאה) יידרש לבידוד איון.
3. האיים הם מאוד רגישים לנזקי חוסר חמצן; לכן, HBSS הוא מבעבע עם 95% O _2/5% CO ₂ לחקות את הריכוזים של O ₂ בדם. תערובות גזים מיוחדות ניתן לרכוש ותחנה מבעבעת להגדיר עם פיפטה פסטר המצורפת לצינורות גמישים. לאחר מבעבע את הכמות הנדרשת של HBSS עם 95% O _2/5% CO ₂ למשך 15 דקות, להוסיף 0.02% BSA הכיתה RIA (אלבומין בסרום שור) לפי נפח ולשמור על קרח לremainder של בידוד איון.
4. להכנת Ficoll, לשקול את 32.5 גרם של Ficoll בכוס 400 מיליליטר, להוסיף 80 מיליליטר של HBSS, ומערבבים ב500-700 סל"ד במשך 30 דקות. , התמוסס ברגע ששופך את פתרון Ficoll ל250 מיליליטר סיים גליל ולהוסיף HBSS לסימן 130 מיליליטר בגליל סיים כדי ליצור פתרון Ficoll 25%. מכסה את החלק העליון של הגליל סיים עם שתי מנות של Parafilm ® M (חברת אריזת פלסטיק פצ'יני, שיקגו, אילינוי) ולנער במרץ כמה פעמים.
5. ל23%, 20.5%, ו11% פתרון Ficoll, להוסיף 27.6, 24.6, ו13.2 מיליליטר של 25% Ficoll, בהתאמה, ל50 מיליליטר צינורות חרוטי. לאחר מכן, תביא כל פתרון עד לסך של 30 מיליליטר עם HBSS ולנער היטב כדי לערבב. יש לאחסן את כל ארבעה פתרונות Ficoll על 4 מעלות צלזיוס והם טובים לעד 2 שבועות.
6. פתרון Collagenase כי הוא מתאים לבידוד איים פעילים הוכן מcollagenase מבודד מClostridium histolyticאממ (טבלת חומרים). כל מגרש צריך להיבדק לשימוש יעילות באנזים. בדרך כלל, collagenase משמש ב0.3-0.5 מ"ג לכל מיליליטר של HBSS. ניצול ריכוזי אנזים בטווח זה (בדרך כלל 3 ריכוזים שונים), לקבוע את האיכות וכמות של איים מבודדים מעכברי גיל בהתאמה או להמלטה כדי לקבוע את ריכוז אנזים עבודה.
7. ברגע שהריכוז הנכון נקבע, כל עכבר דורש 35 מיליליטר של collagenase בHBSS לפרוטוקול כל הבידוד. לערבל את collagenase בHBSS לפזר. בסמוך למועד הניתוח, טרום לטעון מזרק 5 מיליליטר עם פתרון collagenase, הנח את הצינורית ובלהסיר בועות אוויר, ולהשאיר על קרח עד צורך.
8. התקשורת ותרבות איון לדגירת O / N היא תקשורת בתוספת RPMI 1640. לפתרון המניות, לפזר אחת מנות RPMI 1640 (Gibco, ניו יורק) ב1 ליטר של H ₂ O מזוקק פעמיים ולהוסיף 1.19 גרם HEPES (5 מ"מ) ו2 גרם נאצ'ו ₃ (24 מ"מ). התאם את ה-pH 7.4,סנן לעקר ולאחסן ב 4 ° C בחושך.
9. לתקשורת בתוספת, להוסיף 10% FBS ו100 IU/100 פניצילין מיקרוגרם / מיליליטר / סטרפטומיצין, בהתאמה, למניות RPMI 1640 התקשורת. אם ריכוז הגלוקוז שונה הוא רצוי, ניתן להשתמש בתקשורת RPMI 1640 נטול גלוקוז וריכוז מסוים של גלוקוז ניתן להוסיף.
10. למנייה קרבס רינגר יקרבונט חוצץ (קרבס), מוסיף את המרכיבים הבאים להכפיל מים מזוקקים בריכוזים הבאים: NaCl (118.41 מ"מ), KCl (4.69 מ"מ), MgSO ₄ (1.18 מ"מ), KH ₂ PO ₄ (1.18 מ"מ ), נאצ'ו ₃ (25 מ"מ), HEPES (5 מ"מ), וCaCl ₂ (2.52 מ"מ) ב-pH 7.4. יש להוסיף CaCl ₂ אחרון והפתרון הזה יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך עד 2 שבועות.
11. כדי להפוך את מניית עבודה של קרבס, גז ראשון עם 95% O _2/182 5% CO ₂ למשך דקות 10-15 עם פיפטה פסטר על 37 מעלות צלזיוס ואחריו התוספת של הכיתה RIA 0.5% BSAלפי נפח. בשלב הבא, גלוקוז מתווסף לריכוז הרצוי עבור assay במבחנה.

2. הכנת כלים

1. מעט להקהות את קצות 30 - ומחטים 27-G באמצעות אבן השחזה לעגל נקודה החדה כבויים. שים עיקול 45 תואר במחט על ¼ מסנטימטר מהקצה באמצעות צבת. היזהר שלא ללחוץ חזק מדי, שיסגור את הקוטר הפנימי של המחט.
2. חותכים את חוט 3/0 תפר משי לכ אורכי 4 אינץ', אחד לכל עכבר.
3. מכסה את בסיס מיקרוסקופ לנתח בניילון הנצמד וקלטת למטה.
4. חותכים כמה חתיכות של נייר סופג ספסל, סנטימטרים כ 3 X 5 בגודל, לפחות 2 לכל עכבר.

3. הכנת העכבר

1. ממלאי מזרק 1 מיליליטר עם 1 מיליליטר Avertin.
2. להזריק את פתרון Avertin intraperitoneally בכ -40 μl / גרם של משקל גוף.
3. אחרי העכבר לא lאונגר מגיב לזנב או צובט רגל האחורי, להעביר אותו בזהירות לתחנת עבודת מיקרוסקופ לנתח.
4. עם העכבר במצב שכיבה והראש שלה מול distally, לרסס את העכבר עם 70% אתנול מימיים. הקפד להשתמש בכמות מספקת של 70% אתנול להגביל את כמות הפרווה בחלל בית החזה החשוף.

4. פתיחת חלל בית החזה

1. צבוט את הפרווה ועור של העכבר בין שתי רגליו האחוריות ולעשות חתך ראשוני ועד לאפידרמיס, דרמיס וקרום בסיסי.
2. אמנם עדיין צובט את העור ואת הקרום בסיסי, לחתוך לכיוון הגפיים הקדמיים בשני הצדדים של לקיחת עכבר זהירות כדי למנוע חיתוך כל איברים פנימיים.
3. מקפלים את העור ודש קרום מעל בית החזה ולהסיר את תהליך xiphoid כדי לאפשר גישה קלה יותר ללבלב לאינפלציה.
4. כיוון מחדש את העכבר עם הראש מול proximally ולהזיז את האיברים הפנימיים לכיוון צד ימין של העבודה station כדי לחשוף את אב העורקים היורדים.
5. אלא אם כן רקמת דם היא להיות שנאסף, אב העורקים היורד ניתן לחתוך כדי להשלים euthanization. לספוג את הדם העודף עם נייר ספסל או Kimwipe עבור גישה קלה יותר לצינור המרה המשותף.

5. גידול מלאכותי הלבלב

1. עם מיקרוסקופ לנתח, למקם מחדש את המעי הדק, כך צינור המרה המשותף יוצר קו מאונך עם ראש העכבר.
2. קח את מלקחיים ולתפוס את המעי הדק ולמצוא את הסוגר של Oddi (סוגר של ampulla) בסופו של צינור המרה המשותף, הפורש על המעי דק מצינור המרה, ויצר משולש לבן במעי ורודה. ברגע שהסוגר של Oddi כבר נמצא, לקחת # 5 מלקחיים דומון והחלק את הקצה מתחת לצינור הקרוב למעי הדק ככל האפשר הנפוץ מרה, נזהר שלא לנקב את הצינור.
3. לאחר הפירסינג במעי הדק ורקמת חיבור, השתמשהטיפ של דומון מלקחיים כדי לתפוס את התפר ולמשוך אותו מתחת לצינור המרה המשותף. לקשור את הצינור הכי קרוב לסוגר של Oddi ככל האפשר הנפוץ מרה, כדי לוודא את הקשר מתוח כדי למנוע דליפה.
4. לתפוס את שני הקצוות של התפר ולמשוך לכיוון הזנב לשים קצת מתח בצינור המרה המשותף. שימוש ביד חופשית, לעשות חתך קטן עם המספריים מיקרו בצינור המרה המשותף בדיוק מעל הסתעפות האחרונה לתוך הכבד. שים לב: חשוב שלא לחתוך קרוב מדי לסוגר של Oddi כמו זה יכול לגרום לאינפלציה חלקית של הלבלב ולהימנע מחיתוך דרך צינור המרה המשותף כפי שהוא יהיה גם לגרום לאינפלציה לעניים.
5. בעוד מחזיק את שני קצוות של מחרוזת עם צינור המרה המשותפת מתוח, להסיר את המזרק / הצינורית שכבר טעון מראש עם 5 פתרון collagenase מיליליטר מדלי הקרח, הניחה את המזרק, ולהכניס את מחט 30 G הקהתה לקיצוץ צינור מרה משותף, נזהר שלא לנקב דרך wall של הצינור. אם מחט 30 G היא לא רחב מספיק לצינור המרה כדי ליצור חותם בסביבה, להסיר אותו ולהחליף עם 27 מחט G הקהה.
6. בעוד מחזיק את המחט במקום, לשחרר את התפר ולהרים את מזרק 5 מיליליטר. לאט לאט לוחץ על המתג של המזרק. הערה: אם המחט הוכנסה בהצלחה לתוך צינור המרה המשותף, זה יהיה להרחיב.
7. תמשיך לוחץ על המתג באיטיות ולתת את באופנת pulsatile עד החלק הראשון של הלבלב מתנפח, ואחריו לחץ מתמיד עדין, עד לבלב התנפחות כבר לא. הערה: רוב הלבלב להחזיק 3-5 מיליליטר לפני שמתחיל לדלוף. כמו כן, אינפלציה מוצלחת תהיה חלוקה שווה של רקמה אקסוקרינית והחלק מהלבלב בחלק העליון של הקיבה יהיה מנופח.
8. הסר את המחט מצינור המרה המשותפת ויצא לדרך לצד.

6. הסרת לבלב

1. קח את מלקחיים ביד אחת ומספריים מעוגלים בהאחר. באמצעות המלקחיים, לתפוס את המעי הדק בסוגר של Oddi. עם המספריים סגורים, להשתמש בטיפ לחלק נפרד של הלבלב מהמעי הדק.
2. מורחים את המספריים בנפרד כדי להרחיב את הפער בין המעי הדק והלבלב.
3. מניחים את "V" של המספריים שבו המעי הדק והלבלב לצרף אחד את השני בצד ימין של הפער שיצר זה עתה. שימוש במלקחיים משוך בעדינות את המעי דק עבר המספריים כדי להסיר את הלבלב.
4. להמשיך לעבוד במורד המעי הדק לרקמת חיבור ורודה. בשלב זה, להרים את המעי הדק ליד מקום שבו מתחבר לקיבה ולגזור משם משאר המעי הדק הלבלב. שים לב: יש להיזהר שלא לגזור הלבלב מכיוון שהוא עלול להתחיל להוציא את האוויר.
5. בעדינות לתפוס את החלק של הלבלב המחובר לקיבה עם מלקחיים (מלקחיים שטוחים יעבדו הכי טובים). תוך משיכת בעדינות על הלבלב, השתמש בעקומההמספריים ד ללגזור ממנו על הקשרים בין הלבלב והקיבה.
6. אתר את הטחול ולהחזיק אותו עם המלקחיים מעל הלבלב. קח מספריים מעוגלים וחתכת את הקשרים בין הטחול והלבלב.
7. מצא בו הלבלב מחובר למעי הגס. להרים את המעי הגס עם מלקחיים ולהשתמש בקצה של המספריים לחדור מבעדם. מורחים את המספריים לגזרים כמו קודם כדי ליצור פער בין המעי גס והלבלב.
8. להחזיק את המעי גס עם מלקחיים: זה יביא בלבלב נופל משם, חושף את קשריו המדויקים למעי הגס. לגזור משם קשרים שנותרו.
9. מצא את רקמת חיבור הוורודה מחוברת ללבלב והמעי הדק וחותך קרוב ללבלב ככל האפשר. הערה: אם פירסינג הלבלב הוא דאגה, מומלץ לחתוך קרוב יותר למעי הדק כרקמת חיבור תהיה מסוננת בשלבים מאוחר יותר.
10. סולראב כמה שיותר מהלבלב ככל האפשר ולהרים אותו בעדינות. עם מספריים מעוגלים, לחתוך את הקשרים שנותרו בין הלבלב וחלל בית החזה כדי להסיר את הלבלב במלואו. הערה: עדיין צריך להיות מנופח הלבלב אם הוסר בצורה נכונה.
11. אחסן את הלבלב הוסר ב~ 2.5 מיליליטר של תמיסת collagenase בצינור חרוטי 50 מיליליטר על קרח עד שכל הלבלב האחר כבר ניפח והוציא לצורך הניסוי.

7. כביסה

1. קח את כל הלבלב מבודד ולהעביר אותם כדי להפריד 50 צינורות חרוטי מיליליטר כל אחת מכיל 25 מיליליטר של תמיסת collagenase טרי
2. מניחים את צינורות חרוטי מיליליטר 50 זקופים ב37 ° C רועדים אמבט מים מסוגל נדנוד ב220-250 סל"ד, עם שייקר כבוי.
3. גז כל צינור חרוטי 50 מיליליטר עם 95% O _2/5% CO ₂ למשך 5 דקות עם פיפטה פסטר.
4. לסכם כל צינור בחוזקה ומניח הצידה במים רועדיםאמבטיה מתחת לפני השטח של המים. לנער ב220-250 סל"ד 20 שניות, בכל דקה אחרת, עד 16 דקות החל משעת 6 דקות. (לנער בבית 6, 8, 10, 12, 14, ו16 דקות)
5. מייד להעביר את הצינורות לצנטריפוגות בטמפרטורת חדר לסיבוב מהיר. להביא צנטריפוגות עד 1,500 סל"ד (400-500 גר ') ולכבות באופן מיידי.
6. באמצעות מלכודת אבק, לשאוב כ 22.5 מיליליטר של תמיסת collagenase מבלי להפריע גלולה. לשטוף עם 10 מיליליטר HBSS ומערבולת בעדינות כדי לשבור את גלולה.
7. לבצע עוד סיבוב מהיר בטמפרטורת חדר עד ל -1,500 סל"ד (400-500 גר ').
8. לשאוב כ -10 מיליליטר של הפתרון, שוב מבלי להפריע גלולה.
9. לשטוף עם עוד 10 מיליליטר של קרח הקר HBSS ומערבולת בעדינות כדי להיפרד שוב גלולה. חזור על הספין ולשאוב 10 מיליליטר מהיר של הפתרון.
10. בעדינות מערבולת גלולה ב2.5 מיליליטר הנותר של פתרון HBSS. יוצקים פתרון באמצעות1,000 מיקרומטר רשת לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר חדש. פעולה זו תסיר את פסולת רקמה הגדולה אינו מתעכל על ידי collagenase.
11. יש לשטוף את צינור חרוטי 50 מיליליטר הישן עם 2.5 מיליליטר של HBSS הקר כקרח. השתמש פיפטה פסטר לשטוף את הצדדים של הצינור ביסודיות לפני העברת 2.5 מיליליטר של HBSS דרך הרשת לתוך 50 מיליליטר החדש צינור חרוטי.
12. לבצע עוד סיבוב מהיר בטמפרטורת החדר ב1,500 סל"ד (400-500 גר ') לגלולת הרקמות.
13. לשאוב את כל HBSS על ידי הטיית הצינור לכיוון מלכודת הוואקום. הערה: חשוב מאוד לא להפריע גלולה כמו זו תגרום לאובדן של איים. אם גלולה היא רופפת או מתחילה לנוע לכיוון מלכודת הוואקום, להפסיק aspirating הפתרון מחדש גלולה הרקמה ולאחר מכן תמשיך לשאוב את הפתרון הנותר.
14. ברגע שכל HBSS הוסר, להוסיף 4.8 מיליליטר של 25% פתרון Ficoll ומערבולת כדי לשבור את גלולה.
15. שכבת זהירות 2.4 מיליליטר של 23% פתרון Ficoll על גבי 25% פתרון Ficoll ידי הוספת 23% פתרון Ficoll לצד השני של צינור חרוטי 50 מיליליטר. כדי להבטיח גם שכבות, לסובב את צינור חרוטי 50 מיליליטר בעת הוספת פתרון Ficoll.
16. חזור על התהליך עבור שכבות 20.5% ולאחר מכן פתרונות Ficoll 11%. הערה: אם 4 שכבות נפרדות אינן נוכחים, להוסיף HBSS עד כדי לסמן את 50 מיליליטר ולהפוך את הצינור 4-6 פעמים או עד שיפוע Ficoll אינו קיים עוד. -גלולה מחדש את הרקמה ונסה שוב צעדים 7.14-7.16.
17. ספין צינור חרוטי 50 מיליליטר ב RT ב1,820 סל"ד (800 ז) ל15 דקות.
18. יוצקים את כל Ficoll לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר טרי, מקפיד להשאיר את גלולה של רקמה אקסוקרינית מאחור. הוספת HBSS הקר כקרח עד כדי לסמן את 50 מיליליטר ולהפוך את הצינור 4-6 פעמים כדי לערבב Ficoll וHBSS יחד.
19. ספין צינור חרוטי 50 מיליליטר ב RT ב1,820 סל"ד (800 ז) למשך 5 דקות.
20. לשאוב את רוב תערובת HBSS / Ficoll בזהירות באמצעות טרה ואקוםp. נא לא להפריע גלולה כפי שהוא משוחרר ויכולים להישאף בקלות.
21. קח פיפטה פסטר ולהעביר את הכדור לצינור תרבות חד פעמי.

8. בחירת איים

1. הוסף 5 מיליליטר של תקשורת קטיף (RPMI כלומר. תוספת 1640 או קרבס רינגר יקרבונט הצפת) לצינור התרבות חד פעמי. הערה: התקשורת לקטוף תשתנה בהתאם ליישומים במורד הזרם.
2. בואו האיונים ליישב לתחתית של תחתית התרבות למשך 5 דקות. העבר אותם באמצעות פיפטה פסטר ל15 מ"מ על 60 מ"מ צלחת פטרי פוליסטירן. הערה: חשוב להשתמש בצלחת פטרי כאינם מטופלים אלה וימנעו את האיים מהקפדה על הצלחת.
3. במ"מ 15 נפרד על ידי 60 צלחת פטרי קלקר מ"מ, להוסיף 5 מיליליטר של תקשורת בתרבות איון עכבר (100 מיליליטר RPMI 1640 מלאי מדיה, 10 מיליליטר החום המומת FBS, 1 מיליליטר פן / סטרפטוקוקוס; מסנן מעוקר).
4. בסיוע מיקרוסקופ לנתח עם backligיכולת ht, השתמש 20-P פיפטה להרים האיונים לתוך צלחת פטרי המכילה תקשורת ותרבות איון, לטפל כדי למנוע העברת פסולת רקמת acinar. כאשר תאורה אחורית, איים יופיעו חום, זהב והקרום החיצוני שלהם עשוי מנצנץ, ואילו רקמות acinar יופיעו אפורות ומשעממת אור. אם הכנת איון מכילה כמות גדולה של פסולת, רצוי לבחור ידניים איונים פעמיים למדיום חדש. צמצום זיהום פסולת יגביל clumping איון לאחר דגירה לילה. הוספת DNAse (3,000 U / ml) למאגר העיכול עשויה גם לעזור להגביל clumping איון (JWJ, תצפית אישית). הערה: חשוב לספור את מספר איים מבודד כדי לתכנן ניסויים במורד הזרם.
5. דגירה האיונים O / N בחממה מוגדרת 37 ° C עם 5% CO _2.

9. Assay cAMP

1. תווית 1.7 מיליליטר צינורות microfuge, אחד עבור כל לשכפל של assay. הערה: מבחני cAMP צריכים לפחות duplicates לכל מצב טיפול, אבל יותר חזרות בכל טיפול עדיפים.
2. לאחר בגז קרבס רינגר יקרבונט הצפת ל15 דקות עם 95% O _2/5% CO ₂ עם פיפטה פסטר, להוסיף 0.5% BSA הכיתה RIA וריכוז סוכר סופי של 1.7 מ"מ (פתרון preincubation). לאחר מכן, להוסיף 1 מיליליטר של קרבס הטרי הומתו בגז על צינור אחד microfuge. שני מיליליטר של קרבס נדרש לכל צינור לנקודות מראש דגירה וזמן טיפול; עם זאת, מומלץ להכין לפחות 5-10 מיליליטר נוסף.
3. לערבל את האיים לאמצע צלחת פטרי, ובאמצעות 20-P פיפטה, יד לקטוף את האיונים ל15 מ"מ חדש על ידי 60 קלקר מ"מ צלחת פטרי המכילה 5 מיליליטר של פתרון preincubation לשטוף את מדיום התרבות המכיל גלוקוז מהאיים.
4. ערכת assay cAMP משמשת היא GE Healthcare cAMP ישיר BioTrak EIA. Prococol משמש הוא שינוי של זה שתואר על "מדידת cAMP תאיתurement באמצעות הליך EIA acetylation שאינו עם ריאגנטים תמוגה רומן, "וכבר מותאם לשימוש עם המספר המינימאלי של איונים לכל צינור, המאפשר למספרים מוגברים של תנאי טיפול וטכני משכפל. שימוש 20-P פיפטה, העברה לפחות 13 איונים לתוך צינור אחד מצעד 9.2, שמירה על עקביות איון גודל בין צינורות, עם 1 מיליליטר חיץ מראש דגירה. הערה: הגדלת מספר החזרות מועילה יותר מאשר מספר איים לכל צינור. עם זאת, אם יש מספיק איים כדי להגדיל את מספר איים באופן שווה לכל צינור, רצוי לעשות זאת, עד 25-50 איונים לכל צינור.
5. עם כובעי צינור microfuge פתוחים, להעביר לחממת 37 מעלות צלזיוס נקבעה על 5% CO ₂ ו דגירה דקות 45 לנרמל את הפרשת האינסולין של כל האיונים לרמת בסיס.
6. בעוד הדגימות דוגרים, להכין את הטיפולים (כלומר 8 מ"מ, 11.1 מ"מ, 16.7 גלוקוז מ"מ, וכו ') בfr קרבס בגזאום צעד 9.2. ב15 צינורות חרוטי מיליליטר, עם 1 מיליליטר נוסף לדין וחשבון על כל שגיאת pipetting. הוסף 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) לריכוז סופי של 200 מיקרומטר. IBMX הוא מעכב phosphodiesterase כללי שחוסם את הפירוק של cAMP, המאפשר cAMP להצטבר בתא כפי שהוא מיוצר. (הערה:.. זה assay ייצור cAMP אמיתי ראה סעיף הדיון למקרים שבם ייצור cAMP מדידה לא יכול להיות רצוי אם IBMX נשאר בחוץ של assay, יותר איים יידרשו לכל צינור על מנת לקבל נתונים מחנה ב הטווח ליניארי של העקומה סטנדרטית).
7. לאחר 45 דקות מראש הדגירה, להסיר את צינורות microfuge מן החממה, הכובע ודופק מערבולת כל מדגם (פחות מ 0.5 שניות). זה לערבב את שיפוע האינסולין שסביר להניח שנוצר כתוצאה מהאיונים להיות מרוכזים בחלק התחתון של הצינור. יש להקפיד שלא מערבולת בחומרה רבה מדי, שכן הדבר עלול להשפיע באופן שלילי על יציבות איון (הערה: כתריםצינורות עם איונים ניתן העיף בעדינות או הפוכים, אם זה לא אפשרי לדופק מערבולת בעדינות. אפשרויות אלה יוסיפו זמן assay, אשר יש לשקול בעת תכנון הניסוי).
8. העבר את כל צינור לצנטריפוגות בראש טבלה (RT) וספין עד שהאיים להגיע 10,000 סל"ד (7,000-7500 ז) ולאחר מכן לכבות באופן מיידי.
9. השתמש פיפטה P-1000 להסיר את רוב קרבס בצינור אחד microfuge, ומשאירים כ 10-15 μl של קרבס בגלולת איון. השתמש פיפטה 20-P כדי להסיר את החלק הקרוב ביותר גלולה איון. אם גלולה מופרעת, פיפטה קרבס בחזרה לתוך הצינור ומחדש הספין.
   (הערה: אם הנסיין מוצא את זה קשה מדי כדי להסיר את כל קרבס מגלולת איון מבלי להפריע אותו, 10-15 μl האחרון ייתכן שנותר ובהיווה בנפח הכולל מאוחר יותר בפרוטוקול.
10. השג כמות מספקת של חנקן נוזלי במכל מבודד לצלם להקפיא את הדגימות לאחר דגירה.
11. קח דגימות מתוך האינקובטור, כובע, מערבולת במהירות (פחות מ 0.5 שניות) לסובב את צינורות microfuge בצנטריפוגה בראש הטבלה (RT) עד 10,000 סל"ד (7,000-7500 ז), ולאחר מכן לכבות באופן מיידי. אם אינסולין או המטבוליט אחר הוא יישום במורד הזרם רצוי, השתמש פיפטה P-1000 לאסוף aliquot של מדיום בצינור microfuge ולאחסן ב -20 ° C עד לניתוח נוסף. אם תקשורת גירוי לא נאספת, זה עשוי להיות מושלך.
    (הערה: IBMX הוא potentiator חזק של הפרשת אינסולין מגורה גלוקוז (GSIS) לפיכך, תוצאות המתקבלות מGSIS בינוני גירוי cAMP לא יכולות לייצג במדויק את ההשפעה האמיתית של טיפולים ספציפיים על GSIS, במיוחד אם תופעות אלה הן עדינות.).
12. חזור על שלב 9.9 להסיר כמה שיותר בינוני גירוי ככל האפשר מבלי להפריע גלולה איון. הצמד להקפיא את גלולה איון בחנקן נוזלי ברגע שיש פחות מ 10-15 μl של קרבס עזב בגלולת איון. ברגע שכלדגימות הצמד הוקפאו, לאחסן ב-80 ° C עד מדידת cAMP.
13. ביום של נחישות cAMP, להכין ריאגנטים תמוגה רומן על פי הפרוטוקול של היצרנים. הוסף 200 1B מגיב מיליליטר תמוגה על צינור אחד microfuge ומערבולת במהירות שיא ל30 שניות. בואו הצינורות לשבת על קרח דק 10, vortexing כל 2 דקות ל30 שניות. (הערה: הפרוטוקול ממליץ ביצוע ניתוח מיקרוסקופי עם trypan הכחול כדי להבטיח תמוגה תא, אבל זה לא מבוצע לאיים).
14. הכן את תקני העבודה והקמת את microplate EIA בדיוק כפי שתואר בפרוטוקול של היצרן. לאחר מצע האנזים כבר הודגרו עם microplate ל30 דקות, לבצע את צעד החומצה גופרתית האופציונלי 1.0 M, ולקבוע את הספיגה של בארות microplate ב450 ננומטר באמצעות קורא microplate.
15. תוצאות AMP מחזוריות תירשמנה כfmol / כן. זה צריך להיות מנורמל להיקף הכולל של המדגם המקורי (200 μl + כלקרבס שיורי השאיר על האיים מצעד 9.9). בשלב הבא, יכולות להיות מנורמלים תוצאות למספר הכולל של איים, נותנים cAMP fmol הופק / איון, או יכולות להיות נתונה דגימות lysate לחומצת bicinchoninic assay חלבון (BCA) לנרמל את התוצאות לחלבון כולל סלולארי (נותן חלבון fmol / מיקרוגרם) . זה האחרון מומלץ כאשר גדלי איון אינם עולים בקנה בין דגימות, והוא יכול להיות תחליף לגודל איון. ערכת assay חלבון BCA פירס כבר שימשה בהצלחה בפרוטוקול זה, ודורשת רק 25 מיליליטר של מדגם. צריכים להיות מוכנים הסטנדרטים BSA ב1B מגיב תמוגה מערכת assay cAMP.

תוצאות

כדי להבטיח תשואת איון גבוהה במהלך בידוד, צריכים להיות אחרי הטכניקות ניתוחיות המפורטים בפרוטוקול באופן הדוק. למרות הטכניקות שהוצגו כאן תהיה מותאמות לכל מעבדה, יש כמה שלבים קריטיים שיובילו לבידוד מוצלח. על מנת להפוך את צינור המרה המשותף נגיש בקלות, מומלץ שהאיברים להיו...

Discussion

עם השכיחות של הסוכרת צפויה להשפיע 7.7% מאוכלוסיית העולם, הדרישה של טכניקות מחקר רומן הכרחית לשניהם להבין ולטפל בסוכרת ^18. בידוד איון הנוכחי הוא פרוטוקול מבוסס היטב המשמש לניסויים במבחנה וכבר הוצג בעבר עם ^11,14,16 שינויים קלים. למרות שהפרשת אינסולין היא ייש...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagenase from Clostridium histolyticum suitable for isolating active islets	Sigma-Aldrich	C7657
Ficoll 400	Sigma-Aldrich	F9378
Hanks Balanced Salt Solution 10X	Invitrogen (Gibco)	14065-056
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
RPMI 1640 (powder)	Invitrogen (Gibco)	31800-022
Albumin from Bovine Serum (BSA)	Sigma-Aldrich	A7888
3/0 Silk Suture Thread	Fine Science Tools	18020-30
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-10
0.8 mm Forceps	Fine Science Tools	11050-10
Curved Scissors	Fine Science Tools	14061-10
Vannas-Tübingen Spring Scissors - Straight/Sharp/8.5 cm/5 mm Cutting Edge	Fine Science Tools	15003-08
Dissecting Scissors	Fine Science Tools	14002-14
5 ml BD Luer-Lok Syringe	BD	309646
1 ml BD syringe	BD	309628
30 G BD Needle 1/2" Length	BD	305106
27 G BD Needle 1/2" Length	BD	305109
Sharpening Stone	Fine Science Tools	29008-01
2-2-2-tribromoethanol	Sigma-Aldrich	T48402-25G
2-methyl-2-butanol	Sigma-Aldrich	240486-100mL
Sodium Chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S9888
Potassium Chloride	Sigma-Aldrich	P3911
Monopotassium Phosphate (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P0662
Sodium Bicarbonate (NaCHO3)	Sigma-Aldrich	S6014
CaCl2·2H2O	Sigma-Aldrich	C3881
MgSO4·7H2O	Sigma-Aldrich	M9397
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen (Gibco)	15140-122
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum (H.I. FBS)	Fisher Scientific	SH30088.03HI
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)	Sigma-Aldrich	5879-100MG