רדיקלים חופשיים בביולוגיה כימית: מהתנהגות כימית לפיתוח סמנים ביולוגיים

Summary

כימית biomimetic הרדיקלי מבוססת הוחלה ספריות בניין עד נחוצות לפיתוח סמן ביולוגי.

Abstract

מעורבותם של רדיקלים חופשיים בתחום מדעי החיים גדלה באופן קבוע עם זמן וכבר מחוברת למספר תהליכים פיסיולוגיים ופתולוגיים. נושא זה חובק תחומים מדעיים מגוונים, המשתרע מכימיה פיסיקלית, ביולוגית וביו לביולוגיה ורפואה, עם יישומים לשיפור של איכות חיים, בריאות והזדקנות. מיומנויות רבות תחומיות הנדרשות לחקירה המלאה של היבטים הרבים של תהליכים קיצוניים בסביבה הכימית והביולוגית ידע ממלא תפקיד מכריע בחשיפת תהליכים ומנגנונים בסיסיים. פתחנו גישת ביולוגיה כימית מסוגלת להתחבר תגובה הכימית של רדיקלים חופשיה בתהליכים ביולוגיים, המספק מידע על המסלולים ומוצרים מכניסטית. הליבה של גישה זו היא העיצוב של דגמי biomimetic כדי ללמוד את התנהגות biomolecule (שומנים, חומצות גרעין וחלבונים) במערכות מימיות, קבלת תובנה של התגובה, כמו גם מסלוליםשל בניית ספריות מולקולריות של תוצרי התגובה של רדיקלים החופשיים. קשר זה יכול לשמש בהצלחה לגילוי סמן ביולוגי ודוגמאות מסופקות עם שני סוגים של תרכובות: איזומרים מונה טרנס של אסטרים cholesteryl, המסונתזים ומשמשים כהפניות לגילוי בפלזמה אנושית, וpurine 5 ',8-סקל-2 '-Deoxyribonucleosides, הכין ומשמש כהתייחסות בפרוטוקול לגילוי של נגעים כאלה בדגימות DNA, לאחר קרינה מייננת או מתקבלים ממצבים בריאותיים שונים.

Introduction

תגובתיות של רדיקלים חופשיים גילתה החשיבות העצומה שלה לאירועים ביולוגיים רבים, כולל הזדקנות ודלקת. כיום, יותר ויותר ברורים שהבירור של כל שלב כימי המעורבים בתגובתיות זו נדרשת, כדי להבין את המנגנונים ואסטרטגיות לדמיין יעילות לשליטתם של רדיקלים ותיקון של הניזק חינם. התרומה ממחקרים כימיים היא בסיסית, אבל המחקר הישיר בסביבה הביולוגית יכול להיות קשה, שכן החפיפה של תהליכים שונים ומסבכת perturbs בחינת התוצאות והמסקנות בנושא. לכן, האסטרטגיה של דוגמנות תגובות רדיקלים חופשיות הקשורים בתנאים ביולוגיים הפכה צעד מהותי במחקר של מנגנונים כימיים בביולוגיה.

בעשור האחרון הקבוצה שלנו פתחה מודלים של תהליכי רדיקלים חופשיים בתנאי biomimetic. בפרט אנו envisaged תמורות ביולוגיות רלוונטיות של חומצות שומן בלתי רוויות, נוקלאוזידים, וחומצות אמינו המכיל גופרית ולשים אותם במסלול כדי להיות מוערך ומאומתים כסמנים ביולוגיים של מצב בריאות. ^1-4

הגישה הכללית שלנו מורכבת משלושה מודולים:

• סינתזה אורגנית, המספקת גישה לביומולקולות שונתה בהתאם. התכנית הסינטתית ניתן גם נועדה על מנת לדמות את התהליכים המתרחשים רדיקלים החופשיים בסביבה הביולוגית, ובכך להחיל תנאים מסוגלים לדמות את התהליך הביולוגי של עניין, שהיא יסוד לכימיה רדיקלית biomimetic. בדגמי biomimetic הבינונית התגובה הוא מים או בינוני הטרוגנית בשל הקיום של תאים הידרופילי והידרופובי. היתרון לעבודה עם מודלי biomimetic הוא שיש סביבה פשוטה עם שותפי תגובה ידועה, שבו ניתן לבחון תגובתיות ומוצרים בפרטים נוספים, אולי גילוימסלולים כימיים חדשניים. משלב זה מידע מכניסטי והקינטית יכול להיות שנאסף;
• טיהור, ניתוח ואפיון של מוצרים, ומספק מידע מבני וכימי של ביומולקולות שונתה על מנת לארגן ספריות מולקולריות ולהקל recognition.in הסביבה הביולוגית המורכבת יותר. פרוטוקולים מבוססים גם על רקע פתרון תערובות מורכבות של תרכובות כגון אלה נגזרים מדגימות ביולוגיות;
• פיתוח סמן ביולוגי באמצעות דגימות ביולוגיות, שנגזרו גם על ידי בניסויים במבחנה באמצעות תרביות תאים, במחקרי vivo מחיות ובני אדם. הפרוטוקולים שפותחו במודלי biomimetic מוחלים על הניתוח המורכב של דגימות, לדמיין את התמורות הרדיקליות החופשיות בתנאים שונים. ספריות מולקולריות פותחו על ידי סינתזה הן לעזר עצום לתגליות בתחום מדעי חיים. המידע שנאסף על תמורות גבעת רדיקלים החופשיותדואר ההזדמנות לגלות את אסטרטגיות תיקון ומניעה. מאגרי מידע של התוצאות יכולים לשמש להערכה זהירה על ידי ניתוח רב משתנה של משמעות הסמן הביולוגי, כמו גם גורמים הקשורים אפשרי.

אנחנו בחרנו בשני סוגים של סמנים ביולוגיים רלוונטיים להסמכת גישה זו: אסתרים purine 5 ',8-סקל-2-deoxyribonucleosides cholesteryl'.

Protocol

1. סינתזה של איזומרים מונה טרנס של אסטרים cholesteryl

1. ממס אסטרים cholesteryl (linoleate או arachidonate cholesteryl אסתר) ב2-propanol (15 מ"מ). לsolubilization טוב יותר, דגימות sonicated במשך 15 דקות תחת ארגון.
2. להעביר את הפתרון לכור פוטו קוורץ, להוסיף 2-2-mercaptoethanol בpropanol (כדי להגיע לריכוז mM 7, מפתרון מנייה 2 מ 'של thiol). לשטוף את תערובת התגובה עם ארגון במשך 20 דקות כדי לחסל את נוכחותו של חמצן בפתרון.
3. להקרין תערובת התגובה על ידי אור UV באמצעות מנורת כספית בלחץ נמוך 5.5W ב22 ± 2 מעלות צלזיוס במשך 4 דקות. צג על ידי אנליטית Ag-TLC (כרומטוגרפיה שכבת כסף דקה) לראיות ההיווצרות של אסטרים cholesteryl מונה טרנס (ראה איור 1 לנוסחות הכימיות). מכתים TLC מתבצע על ידי שפיכת הצלחת באמוניום פתרון cerium molibdate (רמ"א), והכתמים מופיעים על חימוםהצלחת. להרוות את התגובה בשלב מוקדם, על מנת לשחזר את החומר המוצא, שניתן לעשות שימוש חוזרים לבצע סיבובים אחרים של isomerization, השיגו גידול של התשואה הכוללת.
4. אסוף את תערובת התגובה בבקבוק עגול בתחתית, שוטף את המנגנון עם כמה מ"ל של 2-propanol. הסר ממס ולטהר את איזומרים מונה טרנס של אסטרים cholesteryl ידי Ag-TLC כפי שתוארו בספרות. ⁵ שימוש אתר הקסאן-diethyl (09:01 v / v) eluent למונה טרנס cholesteryl linoleate איזומרים, ואילו שימוש בקסאן -Diethyl חומצה אצטית-אתר (9:1:0,1 V / V) לאיזומרים arachidonate cholesteryl מונה טרנס.

2. בידודו של בר אסטרים cholesteryl מסרום אדם

1. למהול 1 מ"ל של נסיוב אדם (מתקבל על ידי צנטריפוגה דם) עם 1 מ"ל של מי מלח ויוצק את התמיסה לתוך משפך separatory תחת זרם של ארגון על מנת להימנע מחפצים (למשל adducts חמצון). הוסף 10 מיליליטר כלורופורם מתנול (2: V 1 / V) שלוש פעמים. נער את משפך separatory לאט מאוד, במטרה לצמצם את ההיווצרות של אמולסיה בשל הנוכחות של אלבומין.
2. שטוף את השכבות האורגניות פעם אחת עם מי מלח (10 מ"ל), ואז לאסוף בבקבוק Erlenmeyer תחת זרימת ארגון, יבש מעל גופרת נתרן נטולת מים. הסר נדיפים ידי מאייד סיבובי כדי להרשות לעצמו שמן צהוב (סך שבריר שומני פלזמה).
3. קח את הגולמי עם 1 מ"ל של כלורופורם מתנול (2:1 v / v), עומס על preparative TLC תחת זרם של ארגון ולהשתמש בתערובת של אתר הקסאן-diethyl (09:01 v / v) eluent . לגרד את החלק המכיל סיליקה שבריר אסתר cholesteryl ולשפוך לתוך בקבוקון. ואז, לחלץ סיליקה (3 × 5 מ"ל) עם כלורופורם מתנול (2:1 v / v), לאסוף את השכבות האורגניות ולהסיר ממס לאחר האידוי להרשות לעצמו את החלק היחסי הטהור של אסטרים cholesteryl (~ 1.5 מ"ג בדרך כלל).
4. שמור אסטרים cholesteryl בבקבוקון כהה המכוסים ברדיד אלומיניום מתחת לארגון ולאחסן ב -20 ° C. Cholesteryl דוארsters רגיש לאור ולחמצן.

3. אפיון של אסטרים cholesteryl מונה על ידי טרנס ראמאן ספקטרוסקופיה

1. חלץ אסטרים cholesteryl מסרום אדם (≥ 0.7 מ"ג) כמפורט בסעיף 2, מתמוסס בכמות קטנה של פחמן טטרא (≤ 10 μl) ומקום בבקבוקון. CCl ₄ נבחר כממס משום אות ראמאן אינה חופפת עם האזור של עניין של ניתוח אסתר cholesteryl.
2. להעביר את הפתרון לבעל המדגם באמצעות כוס טפטפה פנויה, ואז להסיר ממס בקפידה על ידי זרם איטי של ארגון. ברגע שסרט שמנוני אחיד נוצר על הקיר הפנימי של בעל המדגם, הנח את האחרונים למכשיר למדידה.
3. פורה שינה ספקטרום ראמאן של אסטרים cholesteryl מתקבל ישירות על תמציות שומנים ללא תגובת derivatization. כוח הליזר על המדגם הוא <100 mW, כדי למנוע ניזק לדוגמה. המספר הכולל של סריקותעבור כל קשת הוא ≥ 800 כדי למזער את רעשי רקע.
4. מגוון ^-1 הסנטימטר 1,700-1,630 של ספקטרום ראמאן מנותח שכן הוא משקף את תרומתו של C = C אג"ח הנוכחי במולקולה (C = C מצב מתיחה) הכפול. ניתוח מתאים עקום מתבצע על אזור זה, ובכך מאפשר לייחד את התרומה גבי מציס וטראנס קשרים כפולים בשרשרת אלקיל השומנית וקשר כפול בטבעת B של כולסטרול (ראה איור 2).
5. כדי להתאים כראוי את להקות רטט, כמה פרמטרים צריכים להיות קבועים או מוגבל בגבולות סבירים. פרופילי שיא המרכיבים מתוארים כקומבינציה ליניארית של פונקציות גאוסיים הלורנצי ו, בעוד שרוחב הפס בחץ הגובה נקבעים על ידי מיטב שגרת אופטימיזציה המחשב. המספר והמיקום של פסגות הרכיבים מתקבלים על ידי שימוש בספקטרום הנגזר הרביעי, שיאפשר לזהות כמה להקות רכיב חלשות גם. מאז האותיחס רעש שמתדרדר על התמיינות של האות יכול למנוע את השימוש בנגזרת הרביעית, החליק נגזרי 4 עם פונקציה 13 נקודתי סביצקי-Golay, הוא יתרון, ולכן פשרה נכונה בין רזולוציה ויחס אות לרעש מתקבלת . הולם עקומה הטוב ביותר מתקבלים ^ב2 ערכי c הנמוכים ביותר האפשריים.
6. הנוכחות של טרנס איזומרים מתגלה על ידי הרכיב ב1671 ± 1 ^-1 סנטימטר, בנוסף, לפחות, שני המרכיבים, זז מעט לכיוון תדרים נמוכים, בשל שרשרת חומצת השומן וכולסטרול C = C קשרים כפולים. ספקטרום ראמאן נציג הפלזמה cholesteryl אסתר מוצג באיור 9. בהבלעת ההשוואה של אזור מסוים עם cholesteryl linoleate ומונה טרנס חומצה לינולאית איזומרים cholesteryl מוצגת.

4. Derivatization לאסטרים של חומצות שומן מתיל (FAME) וניתוח על ידי גז כרומטוגרפיה

1. להמסאסטרים cholesteryl (~ 1.5 מ"ג) עם 0.5 מ"ל של פתרון 1 ז של נתרן הידרוקסידי בבנזן-מתנול (02:03 v / v) ומקום בבקבוקון כהה המכוסים ברדיד אלומיניום מתחת לארגון.
2. השאר את התערובת תוך ערבוב בטמפרטורת חדר וצג על ידי TLC באמצעות תערובת של אתר הקסאן-diethyl (09:01 v / v) eluent. זמן תגובה הוא בדרך כלל 30 דקות, אבל ניטור תגובה זהירה נדרש. למעשה, ברגע אסטרים התיל המקבילים נוצרים, התגובה חייבת להיות quenched כדי למנוע ההיווצרות של מוצרים פגומים וצד. TLC הראה היווצרות כמותית של אסטרים מתיל.
3. להרוות את תערובת התגובה על ידי הוספת 1 מ"ל של מי מלח ולחלץ מתיל אסטרים עם n-הקסאן (3 × 2 מ"ל). לאסוף את השכבות האורגניות לתוך בקבוקון ולהסיר ממס על ידי אידוי סיבובי כדי להרשות שבריר מתיל אסטר, אשר לאחר מכן משמש לניתוח GC ללא טיהור נוספת.
4. ממס את אסטרים מהתיל בכמות המינימאלית של n-הקסאן (בדרך כלל 1 מ"ג ב 50 μl) ולהזריק בGC מצויד ב60 מ '× 0.25 מ"מ × 0.25 מיקרומטר (50% cyanopropyl)-methylpolysiloxane עמודות. השתמש בגלאי יינון להבה (FID) עם תכנית התנור הבאה: התחלה בטמפרטורת 165 מעלות צלזיוס, להחזיק 3 דקות, ואחרי העלייה של 1 ° C / דקות עד 195 מעלות צלזיוס, להחזיק 40 דקות, ואחרי 2 גידול של 10 מעלות צלזיוס / דקות עד 240 מעלות צלזיוס, ולהחזיק למשך 10 דקות. מצב לחץ מתמיד (29 psi) נבחר. ניתן להשתמש בהליום או מימן כגז המוביל. אסטרים תיל מזוהים על ידי השוואה עם זמן השמירה של דגימות אותנטיות. איור 10 מציג ניתוח GC נציג FAME מתקבל מאסטרים פלזמת cholesteryl.

5. סינתזה של (5'R) - ו (5'S) -5 ',8-סקל-2'-deoxyadenosine

1. להמס 33 מ"ג של 8-2'-deoxyadenosine bromo (8-BR-דדה) באצטוניטריל (100 מ"ל) כדי להגיע לריכוז 1 מ"מ. לווסת את זרימת גז (Ar או N2) בphotoreactor ולמלא את אפהratus עם הפתרון של 8-BR-דדה.
2. הכן את המחיצה עם הגודל המתאים לקלט של photoreactor ולהעביר מחט מחוברת לקו גז אינרטי דרך המרכז שלו. סגור את המערכה עם המחיצה. לשטוף גז אינרטי למשך 30 דקות.
3. להקרין על ידי אור UV באמצעות מנורת כספית 125W בינוני לחץ בגיל 22 ± 2 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות, לאסוף את הפתרון לבקבוק 250 מ"ל עגול תחתי. שטוף photoreactor עם אצטוניטריל מ"ל 10 ולאסוף כביסות באותו הבקבוק.
4. להרוות את תגובת התערובת הגסה עם ₄ פתרון 1 ז NH OH ולהתאדות הממס במאייד הסיבובי.
5. הפעל ניתוח ביצועים גבוה נוזלי הכרומטוגרפיה (HPLC-UV) עם עמודת אנליטי (ראה סעיף מכשור) בתנאים ידועים, ולהשוות את הפרופיל עם תרכובות התייחסות.
6. הפעל ניתוח ביצועים גבוה נוזלי הכרומטוגרפיה (HPLC-UV) עם עמודת אנליטי (ראה סעיף מכשור) באמצעות הסול הבאפתחים ומעברים: 2 formate אמוניום mM כממס וממס אצטוניטריל כמו ב 'הגדר את קצב הזרימה ל1 מ"ל / דקה והשיפוע B ממס 0% עד 0.3% ב ממס שהגיע ב2.2 דקות. אז 0.8% ב ממס ב4.0 דקות אז B, 1% ממס ב4.8 דקות. תישאר בB ממס 1% ל 9 דקות ואז ללכת ל-B ממס 8% ב6 דקות. לאחר ללכת ל-B ממס של 10% ב4 דקות ול-B ממס של 30% ב5 דקות ולהישאר בב 30% ממס למשך 5 דקות אחרות. אסוף את השיאים המתאימים לשני מוצרי diastereomeric בשני בקבוקונים שונים chromatographic.
7. מדוד את הספיגה של שני שברים שנאספו בספקטרופוטומטר UV ולחשב את הריכוז המדויק המבוסס על חוק Lamber באר (= εlC, שבו היא ספיגת ε מקדם ההכחדה ואני אורך של התא). השתמש ε מקדמים ההכחדה של 2'-deoxyadenosine (דדה) (15,400 ^-1 סנטימטר M ^-1 ב260 ננומטר).

6. סינתזה של (5'R) -ד (5'S) -5 ',8-סקל-2'-deoxyguanosine

1. להמס 35 מ"ג-2'-deoxyguanosine 8 bromo (8-BR-dGuo) ו 30 מ"ג של יודיד הנתרן (Nai) במים מזוקקים (100 מ"ל) כדי להגיע לריכוז 1mm ו2 מ"מ, בהתאמה. לווסת את זרימת הגז אינרטי (Ar או N ₂₎ מחוברת לphotoreactor ולמלא photoreactor עם פתרון התגובה.
2. Degass תערובת התגובה, כמתואר בהליך 5 (שלב ב).
3. להקרין על ידי אור UV באמצעות מנורת כספית 125W בינוני לחץ בגיל 22 ± 2 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, לאסוף את הפתרון לבקבוק 250 מ"ל עגול תחתי. שטוף photoreactor עם 10 מ"ל של מים ולאסוף כביסות באותו הבקבוק.
4. להרוות את תגובת התערובת הגסה עם ₄ פתרון 1 ז NH OH ולהתאדות הממס תחת ואקום.
5. ביצוע ניתוח כמתואר בנוהל 5 (שלבי ה 'לז). השתמש ε מקדמים ההכחדה של 2'-deoxyguanosine (dGuo) (11,700 ^-1 סנטימטר M ^-1 ב260 ננומטר).

7. סינתזה של purine תווית איזוטופי (5'R) - ו (5'S) -5 ',8-cyclonucleosides

1. הכן 2 מ"ל של תמיסה מימית 1mm (מים מזוקקים) מתוך ¹⁵ N האיזוטופי נוקלאוזידים purine הכותרת ([15N ^5] או דדה [15N ^5] dGuo) בבקבוקון זכוכית (4 מ"ל) עם כובע מחץ.
2. חבר את הבקבוקון עם מכסה המחיצה ולהתחבר לצינור הגז (N ₂ O לרוויה של הפתרון) באמצעות מחט במחיצה המגיעה לתחתית המכל. מחט קצרה נוספת בכובע מחץ עובדת כיציאת גז.
3. שטוף את הפתרון עם N ₂ O למשך 30 דקות. זרימת הגז מוסדרת להיות נמוכים מאוד.
4. מחט היציאה נלקחת ראשונה יצאה ואחרי 1 'אחד הארוך בא, על מנת שיהיה לחץ קטן בתוך הבקבוקון.
5. שים את הפתרון במנגנון של radiolysis גמא ל8 (חישוב על בסיס מינון שיעור CA. 4.5 Gy / דקה) שעות.
6. לאחר תגובה להרוות הגולמית עם M NH 1 ₄ OH פתרון.
7. הפעל ניתוח ביצועים גבוה נוזלי הכרומטוגרפיה (HPLC-UV) בתנאים ידועים, ⁶ והשווה הכרומתוגרמה עם הפניות הסטנדרטיות.

8. Radiolysis גמא פתרוני DNA מימיים

1. הכן 1 מ"ל של פתרון מ"ל (מים מזוקקים) של ה-DNA התימוס העגל 0.5 מ"ג / ולשים בבקבוקון זכוכית (2 מ"ל) עם כובע מחץ.
2. Degass התגובה, כמתואר בנוהל 7 (צעדי BD).
3. שים את הפתרון במנגנון של radiolysis גמא למשך 30 דקות (חישוב על הבסיס של מינון / שיעור CA. 4.5 Gy / דקה).

9. עיכול אנזימתי של ה-DNA

1. לצינור המכיל 80 מיקרוגרם אפנדורף של ה-DNA, להוסיף 8 U של nuclease P1, 0.01 U של phosphodiesterase השני, 20 ננומול של EHNA ב20 μl יצטט 300 מ"מ נתרן (pH 5.6) וכלוריד אבץ 10 מ"מימ. דגירה את התערובת על 37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות.
2. הבא להוסיף תערובת של U 8 של phosphatase אלקליין, 0.02 U של phosphodiesterasדוארי, בגיל 40 μl של 0.5 מ 'טריס-HCl חיץ (pH 8.9) לעיכול תערובת. מדגם הודגרו ב 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות.
3. התערובת מנוטרלת על ידי תוספת של חומצה פורמית 10%.
4. להעביר את הדגימה למכשיר Amicon Ultra-0.5 צנטריפוגלי מסנן (3 kDa הגזור), להוסיף 200 μl של tridistilled H ₂ O. הנח את Ultra-מסנן לתוך הרוטור בצנטריפוגה XG 14000 במשך 15 דקות. ואז להפריד את מכשיר מסנן אולטרה מצינור microcentrifuge. Lyophilize פתרון אנזימים החופשיים בצינור microcentrifuge.

10. התפלת דגימת DNA לפני הניתוח

1. הפעל ניתוח ביצועים גבוה נוזלי הכרומטוגרפיה (HPLC-UV) עם עמודת אנליטי (ראה סעיף מכשור) בעקבות תנאים ידועים. ⁶
2. ממס את ה-DNA מתעכל lyophilized ב20 μl של H ₂ O ולהזריק בHPLC-UV.
3. איסוף הדגימה בבקבוקון לאחר elution המלח (דקות ראשונות) וממש לפני elution timדואר של nucleoside הראשון (5'R-cdGuo), עד לסיום תכנית הכרומטוגרפיה.
4. מדגם lyophilized וresolubilized במי μl 20.

11. ניתוח כמותי LC-MS/MS

1. הכן את HPLC-MS/MS (quadrupole המשולש) לפני שמתחיל את הניתוח על ידי טעינת השיטה אנליטית והשיטה לגלאי MS (ESI). ⁶
2. הוסף μl 1 מתוך תערובת תרכובות המסומנות האיזוטופי במדגם שהוכן בנוהל 7.
3. הזרק 20 μl של פתרון ה-DNA הממוסמר מתעכל במים מזוקקים.
4. הנתונים המתקבלים chromatographic מעובד על בסיס כיול הקודם עם תרכובות התייחסות. נציג HPLC להפעיל מכיל אדנוזין וguanosine 2'-deoxyribonucleosides והחמצון שלהם והנגזרים סקלו מוצג באיור 11.

תוצאות

תהליך isomerization תואר במיוחד עבור אסטרים cholesteryl העניקו לאיזומרים מונה טרנס של ינולאית והחומצות הארכידונית שמוצגים באיור 1 כמוצרים הראשונים של התקפה זו, שיכולה להתרחש בתנאים של לחץ של רדיקלים חופשיים בסביבה הביולוגית. ⁵

באיור 3 המנגנון הכימי המעורבים בisomerization הקשר הכפול ציס טרנס מוצג. המקור הקיצוני מצוין בדרך הגנרית להרשות רדיקלים S ממוקדים. בפרוטוקולים שתוארו המקור הקיצוני הוא אור UV כי הוא מסוגל לשבור את הקשר הנוכחי SH בRSH המולקולה thiol homolitically.

איור 4 מסכם 3 פרוטוקול צעדים לסינתזה של המעמד השונים שומנים וזיהוי שלהם בפלזמה אנושית: הסינתזה מייצגת תהליך של רדיקלים חופשי biomimetic וגם מספקת כניסה נוחה אחד בסיר לgeometאיזומרים rical, ללא כל זיהום על ידי איזומרים positional אחרי פרוטוקולי טיהור ובידוד.

מתודולוגיות אנליטיות כמה ניתן ליישם לגילוי רגישות גבוה של תוכן טרנס האיזומר והאפיון של ספריית אסתר cholesteryl מונה טראנס. בפרט, ספקטרוסקופיית ראמאן יכולה להתבצע ישירות על שבריר אסתר cholesteryl ללא derivatization (ראה איור 2 ואיור 9).

Purine 2 דוגמא החששות 5 ',8-סקל-2-deoxyribonucleosides', אשר הם נגעי DNA שנוצרו על ידי ההתקפה של רדיקלים חופשיים לעמדת C5 'של מחצית הסוכר וההיווצרות הבאה של קשר קוולנטי בין הסוכר והבסיס moieties. ארבעה מבנים יכולים להיות מיוצר, כלומר, 5 ',8-סקל-2'-deoxyadenosine ו5 ',8-סקל-2'-deoxyguanosine, שניהם קיימים ב5'R ו5'S צורות diastereomeric (איור 5). באיור 6 tהוא מנגנון תגובה מוצג שכרוך photolysis של נגזרים 8-bromopurine 5 לתת לC8 המקביל 6 רדיקליים, הintramolecularly תקצירי אטום מימן מהעמדה 'C5 סלקטיבי ונותן 7 הרדיקליים 2'-deoxyadenosin-5'-י.ל.. 7 רדיקליים עובר cyclization עם קצב קבוע בטווח 10 ⁵ -10 ⁶ של ^{-1, 2} ואחרי החמצון של 8 הרדיקליים heteroaromatic לתת את המוצרים הסופיים ^9. התגובה של רדיקלים הידרוקסיל, שנוצרה על ידי radiolysis של מים, עם 2'-deoxyadenosine ו2'-deoxyguanosine (10) נמצאה להתרחש CA. 10% על ידי הפשטת מימן מעמדת C5. ⁷

הגישה שלנו לביולוגיה הכימית הספריות של purine 5 ',8-סקל-2-deoxyribonucleosides' (כולל תרכובות כותרת) מודגמת באיור 7, עם זיהוי של נגעים אלה בoligonucleotides כמו גם בדגימות DNA שהתקבלו מva מקורות rious כמו, למשל, טופלו בתנאי קרינה מייננת, כמו לחקות מצבי לחץ קיצוניים.

באיור 8 ציוד photoreactor טיפוסי מוצג. המכשיר מאפשר להקרנה של תרכובות המומסות בממס מתאים. הוא מורכב מ: i) תגובת החדר מצויד בכניסה לגז אינרטי (בתחתית) ושני פתחי כניסה ליציאת גז ובנוסף ריאגנטים; השני) תא פנימי המכיל את מנורת הכספית המתאימה מחובר למערכת קירור וחשמל, אשר מוכנס לתוך תגובת החדר באמצעות משותף זכוכית.

איור 1. איזומרים מונה טרנס של linoleate וarachidonate cholesteryl.

r.within עמודים = "תמיד">
איור 2. אסטרים cholesteryl בניתוח סרום והישיר של אדם לאיזומרים טראנס מונה על ידי ספקטרוסקופיית ראמאן.

איור 3. התהליך בנוסף, החיסול שמוביל לisomerization ציס טרנס של קשרים כפולים על ידי רדיקלים thiyl.

איור 4. שלושה שלבים לפיתוח פרוטוקול של אסטרים מונה טרנס cholesteryl כסמן ללחץ של רדיקלים חופשיים.

איור 5. 4 purine 5 ',8-סקל-2' diastereoisomers-deoxyribonucleoside. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

איור 6. דור של C5 'רדיקלים, או על ידי photolysis של 5 או מתגובה של 10 עם HO רדיקלים •, והמנגנון של purine 5' ,8-סקל-2 'היווצרות deoxyribonucleoside. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

איור 7. פרוטוקול ואו זיהוי של כמה נגעי DNA הרדיקליים מבוססים; mtDNA: הדנ"א המיטוכונדרי, nDNA: DNA הגרעיני.

איור 8. כור פוטו.

איור 9. ספקטרום ראמאן נציג של פלזמת cholesteryl אסתר. בהבלעת ההשוואה של אזור מסוים עם cholesteryl linoleate וcholesteryl איזומרים חומצה לינולאית מונה טרנס.

איור 10. ניתוח נציג GC תהילה מתקבל מאסטרים פלזמת cholesteryl.

<חזק> איור 11. הנציג HPLC להפעיל מכיל 2'-deoxyadenosine ו2'deoxyguanosine יחד עם החמצונים וpurine 5 ',8-סקל-2' נוקלאוזידים-deoxyribo. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

Discussion

המרה מתרחשת באופן טבעי חומצות שומן בלתי רוויות גיאומטריים ציס לטראנס איזומרים היא שינוי הקשור בייצור של לחץ קיצוני בסביבה הביולוגית. שומני קרום תא, המכילים חומצות שומן, הם מטרה ביולוגית רלוונטית ללחץ קיצוני ואנחנו הראשונים למדנו isomerization פוספוליפידים ציס טרנס אנדוגני בתרביות תאים, בעלי חיים ובני אדם המעריכים פרוטוקולים אנליטיים בכל מקרה ומקרה. ^8-10 הוכחנו כי השינוי הזה יכול להתרחש על ידי מגוון רחב של תרכובות המכילות S, כולל thiols, thioethers וdisulfides, שתחת תנאי לחץ קיצוניים שונים מסוגלים לייצר רדיקלים thiyl, כלומר סוכן isomerizing (איור 3). הדוגמא שהוצגה במאמר זה מתמקד בכיתה של אסטרים cholesteryl, אשר מייצגים חלק ידוע של שומנים בפלזמה, מעורבים לחלוטין במטבוליזם שומנים בדם. הצמדת אסתר בין חומצות שומן וcholesterol הוא biosynthesized ידי ההעברה של חומצות שומן מהעמדה 2 למחצית גליצרול של phosphatidylcholine לכולסטרול, צעד מזורז על ידי אנזים acyl ציטין כולסטרול transferase (LCAT). לכן, אסטרים פלזמת cholesteryl מחוברים לחלוטין עם מחזור שומני קרום, ומכילים פרופורציות גבוהות יחסית של חומצות השומן הרבות בלתי רוויות (PUFA) בדרך כלל בהווה בphosphatidylcholines, כלומר לינולאית והחומצות הארכידונית. היווצרות ליפופרוטאין מעורבת במחל לב וכלי דם וחילוף חומרים. תגובתיות של אסטרים cholesteryl הטבעיים עם רדיקלים חופשיים יכולה להתרחש בקשרים הכפולים של linoleate ושאריות arachidonate, שיכול להיות באיזומרים הגיאומטריים טרנס המקבילים (ראה איור 1 עבור מבנים). אפיון תוכן אסתר cholesteryl טרנס בדגימות ביולוגיות מעניין לפיתוח סמן ביולוגי. המתודולוגיה עקיפה כוללת את הפיכתו של cholesteryאסטרים l מבודד מפלזמה לאסטרים המתאימים חומצות השומן מהתיל (FAME) והפרדה על ידי פרוטוקולי chromatographic גז. במקרה זה, הכיול של את ההפניות הסטנדרטיות של ציס ואסטרים מתיל טרנס חומצת שומן מתבצע, על מנת לאפשר לכמת את תוכן טרנס בדגימות. בהתבסס על המחקרים אנליטיים שבוצעו בספריית אסתר cholesteryl, אנחנו מוצעים להחיל שיטה המבוססת על ספקטרוסקופיית ראמאן, שיכול להתבצע ישירות על שבריר אסתר cholesteryl המבודד מהפלזמה גם ללא derivatization נוסף לתהילה המקבילה (ראה איורים 2 ו 9). ראוי לציין כי עד עכשיו אף אחת משיטות מוצלחות תארה לציס הנפרד ואיזומרים של חומצות שומן טרנס המכילים שומנים על ידי HPLC, כפי שתואר על ידי hydroperoxides במקום אסתר cholesteryl. עד כה, שיטת הכרומטוגרפיה הגז העקיפה היא עדיין השיטה הטובה ביותר הזמינה עד כה. לפי שיטה זו הראשון כמותית evaluation של התוכן מונה טרנס נגזר מאסטרים cholesteryl בודדו מפלזמה של נבדקים בריאים נמסר. באמצעות גלאי יינון להבה (FID) מגבלת קליטה, הן משביעת רצון (ppb) וכמויות nanomolar של התרכובות שזוהו. ^5. עם מערכות גילוי שונות ממגבלה זו ניתן אפילו הורידה. ההשפעה של קרינה מייננת על אסטרים cholesteryl היא עניין של מחקרים נוספים, בין אם בתגובה ליניארי מתקבלת ביחס למינון המוחל.

כדוגמה שנייה, בחר נוקלאוזידים שונה אשר יכול להיות מיוצר על ידי ניזק של רדיקלים חופשי של DNA. רדיקלים הידרוקסיל (• HO) ידועים כמזיקים ביותר למיני Reactive Oxygen (ROS) ליכולתם לגרום לשינויים כימיים ל-DNA. נגעים בודדים או מרובים עלולים להתרחש על ה-DNA, כי בתאים האיקריוטים ממוקם בגרעין ומיטוכונדריה. זיהוי ומדידה של הסוגים העיקריים של ניזקים שנוצרו חמצונים ל DNA דורשים appropriate ספריות מולקולריות על מנת להגדיר את הפרוטוקולים אנליטיים. אנחנו ממוקדים האינטרס שלנו על הנגעים הקטנים טנדם, שהם purine של 5 ,8-סקל-2-deoxyribonucleosides ', שיש קשר קוולנטי נוסף בין הבסיס ואת moieties הסוכר שנוצר על ידי התקפה של רדיקלים החופשית. התרכובות הן 5 ',8-סקל-2'-deoxyadenosine ו5 ',8-סקל-2'-deoxyguanosine הקיים ב5'R ו5'S צורות diastereomeric (איור 5). הפוטנציאל שלהם להפוך לסמן לחץ רדיקלים חופשי הוא עניין של מחקר בסיסי. ² ואכן, כאשר ה-DNA חשופה למימן HO • הפשטה קיצונית מעמדת 'C5 של הסוכר היא האחד האירועים האפשריים שיגרום להיווצרות נגעי טנדם אלה. Purine 5 ',8-cyclonucleosides ניתן למדוד כסכום של diastereomers ידי HPLC-MS/MS בדגימות γ-DNA מוקרנות מתעכלות enzymatically המשתנה 1-12 נגעים / 10 ⁶ / נוקלאוזידים GY הולך צורת היעדר החמצן לרמה פיזיולוגית של חמצן אנירקמות n, יחס diastereomeric 5'R / 5 של יצור ~ 4 ו ~ 3 עבור 5 ',8-cdAdo ו5' ,8-cdGuo, בהתאמה (איור 11). ¹¹ ראוי לציין כי הקשר בין מינון קרינה ו 5 ',8-cdAdo ו5' נגעים ,8-cdAdo זוהו ב-DNA התאי הם רחוק מלהיות מובן. הניסוי היחיד המבוסס על קרינת 2kGy דיווח בניסוי אינו יכולים להיחשב חד משמעי. ניסויים נוספים מסוג זה ¹¹ ולכמת אנליטי של הארבעה הנגעים הם הכרחיים להגדרת מערכת יחסים כזו. הגילוי של נגעים אלה ואת תמורות חמצונים הפופולריות יותר (כגון 8-אוקסו-2'-deoxyguanosine, 8-oxodGuo) הוא עניין של חקירות אינטנסיביות, המעיד על החשיבות של שני הנגעים במטבוליזם חמצונים. ^6,13 שימוש HPLC -MS/MS (המשולש quadrupole) יש מגבלה קרובה ל30fmol זיהוי לכל ארבעת הנגעים. השיפורים אחרונים הם טענו שיגיעו מגבלות זיהוי של רמות attomol ידי produ המכשירcers. על סמך הספרות האחרונה מאוד, ⁶ נהלים אנליטיים יש לכלול ניקוי הנכון של המדגם וההעשרה על מנת לעמוד במגבלות זיהוי של MS / MS / MS (מלכודת יונים) או של MS / MS (המשולש quadrupole) משמש במקרה שלנו.

נהלים סינטטיים ביו השראה של תרכובות 1-4 פותחו החל מנגזרי 8-bromopurine מתחת או photolysis. ^7,12 הליכים אלה כרוכים בתגובה קיצונית מפל המחקה את מנגנון הניזק לדנ"א של היווצרות של 5 ',8-cdAdo ו5' נגעים ,8-cdGuo. מנקודת מבט ביולוגי, נמצאו כי נגעים אלו מצטברים עם ההזדקנות באופן ספציפי לרקמות (כבד> כליה> מוח), המספקים ראיות לכך שמנגנוני תיקון DNA אינם מספיקים כדי לשמור על החומר גנטי מנגעים אלה. ¹³ ואכן, תיקון הכריתה נוקלאוטיד (נר) הוא המסלול רק זיהה כרגע לתיקון של נגעים אלה. ²

2 הכיתהes של תרכובות מוצג באיורי 1 ו 5 אינם זמין מסחרי באותו הרגע, אך על ידי האסטרטגיות הסינתטיות שתוארו בספרות זה לא יהיה קשה להכין תרכובות אלה לשימוש מסחרי.

הגישה הרבה התחומית הניתנת על ידי מחקרים בביולוגיה כימית יש לא רק ערך עצום בזיהוי מנגנוני רומן המתרחשים בסביבה הביולוגית, אלא גם נותנת תרומה מהותית לגילוי סמן ביולוגי אבחון וסופו של דבר להביא חידוש בתחום בריאות ואסטרטגיות מניעה ^14. תרומה כימית נחוצה לפיתוח מוצלח של רפואה המולקולרית, יצירת פלטפורמות משולבות ופנלים ליצירת פרופילים מטבולים, שצפוי לאפשר לרציונליזציה אופטימלית של עיצוב התערבות, או טיפולית ותזונתית, הקטנה אי ודאות וכישלונות כאשר הם יכולים להיות צפויים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MATERIALS
Cholesteryl linoleate ≥98%	Sigma-Aldrich	C0289-100 mg
Cholesteryl arachidonate≥95%	Sigma-Aldrich	C8753-25mg
2-mercapt–thanol	Sigma-Aldrich	M6250-100 ml
2-propanol	Sigma-Aldrich	34965-1L
Methanol 215 SpS	Romil	H409-2,5 L
Ethanol	Sigma-Aldrich	02860-2.5L
Chloroform SpS	Romil	H135 2,5 L
n-Hexane 95% SpS	Romil	H389 2,5 L
Acetonitrile 230 SpS	Romil	H047 2,5 L
Dichloromethane SpS	Romil	H2022,5 L
Carbon tetrachloride	Sigma-Aldrich	107344-1L
Sodium iodide	Sigma-Aldrich	383112-100G
Sodium hydrogen carbonate	Carlo Erba	478536-500 g
Diethyl ether	Sigma-Aldrich	309966-1L
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653-5KG
NaOH solid	Sigma-Aldrich	221465-25G
NH4OH sol. 28%-30%	Sigma-Aldrich	221228-1L-A
Acetic acid	Sigma-Aldrich	320099-500ML
Ammonium Cerium(IV)sulfate dihydride	Sigma-Aldrich	221759-100G
Ammonium Molybdate tetrahydrate	Sigma-Aldrich	A7302-100G
Sulfuric Acid 95%-98%	Sigma-Aldrich	320501-1L
Silver Nitrate	Sigma-Aldrich	209139-25G
Sodium sulfate anhydrous	Sigma-Aldrich	238597-500G
Nuclease P-I from penicillium citrinum	Sigma-Aldrich	N8630-1VL
Phosphodiesterase II type I-sa	Sigma-Aldrich	P9041-10UN
Erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl)adenine, hc	Sigma-Aldrich	E114-25MG
Phosphatase alkaline type VII-t from*bov	Sigma-Aldrich	P6774-1KU
Phosphodiesterase I type VI	Sigma-Aldrich	P3134-100MG
Deoxyribonuclease II type IV from*porcin	Sigma-Aldrich	D4138-20KU
Trizma(r) base, biotechnology performanc ce	Sigma-Aldrich	T6066-100G
EDTA	Sigma-Aldrich	E1644-100G
Succinic acid bioxtra	Sigma-Aldrich	S3674-250G
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C5670-100G
Formic acid, 98 %	Sigma-Aldrich	06440-100ML
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-3 membrane	Millipore	UFC500324
8-Bromo-2'-deoxyguanosine	Berry Associates	PR3290-1 g
8-Bromo-2'-deoxyadenosine	Berry Associates	PR3300-1 g
Sodium iodide	Sigma-Aldrich	383112-100G
Sodium hydrogen carbonate	Carlo Erba	478536-500 g
2'-deoxyguanosine:H2O (U-15N5, 96-98%)	Cambridge Isotope Laboratories, Inc	CILNLM-3899-CA-0.1
2'-deoxyadenosine (U-15N5, 98%) 95%+ CHEMICAL PURITY	Cambridge Isotope Laboratories, Inc	CILNLM-3895-0.1
Nitrous oxide (N2O)	Air Liquide
Deoxyribonucleic acid from calf thymus	Sigma Aldrich	D4522-5MG
EQUIPMENT
60Co-Gammacell	AECL- Canada	220
Immersion well reaction medium pressure 125 watts	Photochemical reactors ltd	Model 3010
Evaporating flask 250 ml	Heidolph	P/N NS 29/32 514-72000-00
Luna 5 μm C18(2) 100 Å, LC Column 250 x 4.6 mm	Phenomenex	00A-4252-E0
Alltima C8 Column 250 x 10 mm 5 μm	Grace	88081	Semipreparative
SecurityGuard Kit	Phenomenex	KJ0-4282	Analytical holder kit and accessories
Holder for 10.0 mm ID cartridges	Phenomenex	AJ0-7220	Semipreparative holder
10.0 mm ID cartridges	Phenomenex	AJ0-7221
High-performance liquid chromatography (HPLC)	Agilent	1100
LC/MS/MS	Applied Biosystems	4000QTRAP System
Tandem mass ESI spectrometer	(Bruker Daltonics)	Esquire 3000 plus
Vial 2-4 ml	SUPELCO	Cod 27516
Vial 4 ml	SUPELCO	Cod 27517