JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

גישה חדשה המשלבת השתלת תוך עיני ומיקרוסקופיה confocal מאפשרת הדמית אורכית, לא פולשנית בזמן אמת עם רזולוצית תא בודד בתוך רקמות הושתלו In vivo. אנו מדגימים כיצד השתלת איי לבלב ללשכה הקדמית של עין העכבר.

Abstract

Intravital ההדמיה התפתחה ככלי הכרחי במחקר ביולוגי. בתהליך זה, רבות שיטות הדמיה פותחו כדי לחקור את התהליכים ביולוגיים שונים בבעלי החיים הלא פולשני. עם זאת, מגבלה טכנית עיקרית בשיטות הדמית intravital קיימות היא חוסר היכולת לשלב הדמיה בלתי פולשנית, אורכית עם יכולות רזולוצית תא בודד. והביאו כאן כמה השתלה ללשכה הקדמית של העין עוקפת מגבלה משמעותית כגון מציעה פלטפורמה ניסיונית תכליתית המאפשרת הדמיה לא פולשנית, אורכית עם רזולוציה סלולרית בגוף חי. אנחנו מדגימים את הליך ההשתלה בעכבר ולספק תוצאות תוך שימוש במודל מייצגות עם רלוונטיות קליניות, כלומר לבלב איון השתלה. בנוסף להפעלת הדמיה ישירה במגוון של רקמות הושתלו בלשכה הקדמית של העין, גישה זו מספקת פלטפורמה לחלוקיםתרופות n על ידי ביצוע מעקב ארוך טווח וניטור ברקמות היעד. בגלל הרבגוניות, השתלת הרקמה / תא שלה ללשכה הקדמית של הטבות לא רק טיפולי השתלת העין, הוא משתרע על השני ביישומי vivo כדי לחקור תהליכים פיסיולוגיים וpathophysiological כגון העברת אותות וסרטן או התפתחות מחלה אוטואימונית.

Introduction

התקדמות במיקרוסקופיה intravital חשפה תופעות פיסיולוגיות לא נחזו על ידי מחקרים במבחנה 1. זה מדגיש את האתגר בתרגום ממצאים שהושגו על ידי קונבנציונלי שיטות מבחנה לחי. בעשור האחרון, להדמיה של רקמות חי חיות השתפרה במידה ניכרת על ידי התקדמות טכנולוגית בשיטות הדמיה 2, 3, 4, 5, 6. זה דרבן את צורך בגישות הדמית vivo עם יישום אפשרי במודלים של בעלי חיים ניסיוניים כדי לאפשר הדמית אורך של רקמות היעד הלא פולשני.

שיטות הדמיה כגון הדמיה בתהודה מגנטית וטומוגרפיה של פליטת פוזיטרוני פליטת אור או אפשרו הדמיה לא פולשנית של איברים / רקמות עמוקים בתוך הגוף 7-8, 9. אבל שיטות אלה לא יכולים להשיג אחת ברזולוצית תא בשל אותות רקע גבוהים ורזולוציה מרחבית נמוכה, למרות השימוש of גבוהים חומרי ניגוד או 4 הארת רקמות ספציפיות. על כך אמר עם כניסתו של מיקרוסקופיה confocal פלואורסצנטי שני פוטונים 10. מיקרוסקופ שני פוטונים אפשר מחקרי ההדמיה intravital לדמיין ולכמת אירועים הסלולר עם פרטים חסרי תקדים 11, 12. העובדה זו הובילה לאפיון של תהליכים ביולוגיים מרכזיים בבריאות ומחלה 13, 14, 15, 16. בעוד שמחקרי ההדמיה intravital החלוציים שבעיקר "חיקו" בתנאי vivo ברקמה נכרתה (בלוטות הלימפה, לדוגמה), מחקרים אחרים השתמשו בגישות פולשניות לרקמות יעד תמונה שנחשפו באתרו 17, 18, ​​19, 20, 21. מחקרים אחרים אף נקטו "מודלים קאמריים חלון" כדי לעקוף מגבלות הקשורות לגישות פולשניות ורזולוצית הדמיה מוגבלת ב22 vivo, 23, 24, 25. במודל חדר החלון, חדר עם חלון שקוף הוא מושתל לתוך העור בdiffeמיקומי השכרה (עור הגבה או אוזן, כרית שומן חלב, כבד, וכו ') על בעלי החיים (עכבר, חולדה, ארנבון למשל). למרות שגישה זו באופן ברור מאפשרת רזולוציה גבוהה בתחום הדמית vivo, זה דורש ניתוח פולשני להשתיל הקאמרי וייתכן שלא יהיה מסוגל להכיל מחקרי הדמיה אורכיים, למשך מספר שבועות או חודשים 22.

הוא הוכיח לאחרונה כי שילוב מיקרוסקופיה confocal ברזולוציה גבוהה עם הליך פולשנית, כלומר השתלה ללשכה הקדמית של העין (ACE) מספק "חלון גוף טבעי" כחזק ומגוון בפלטפורמת vivo הדמית 26, 27. השתלה לתוך ACE כבר בשימוש בעשורים האחרונים כדי ללמוד היבטים ביולוגיים של מגוון רחב של רקמות 28, 29, 30; והשילוב האחרון שלה עם הדמיה ברזולוציה גבוהה אפשר ללמוד פיזיולוגיה של איי לבלב עם תא החלטה אחת שאינה פולשני ו longitudinally 26, 27. גישה זו הייתה בשימוש ללמוד תגובות אוטואימוניות בהתפתחות סוכרת מסוג 1 במודלים של בעלי חיים (נתונים שלא פורסמו). זה היה בשימוש גם ללמוד פיתוח לבלב, כמו גם, במחקרים של תפקוד כליות על ידי השתלה לתוך ניצני ACE הלבלב או כלית glomeruli הבודד, בהתאמה (נתונים שלא פורסמו). דו"ח אחרון שימוש בגישה זו, ממשיך להדגים היישום שלה כדי ללמוד את התגובה חיסונית לאחר השתלת לבלב איון 31. חשוב מכך, מחקר זה הראה כי השתלה ללשכה הקדמית של העין מספק חלון טבעי גוף לביצוע: (1) הדמית אורכית, לא פולשנית של רקמות מושתלות בגוף חי; in vivo (2) cytolabeling להעריך פנוטיפ וכדאיות סלולריים ב אתר; (3) מעקב בזמן אמת של חדירת תאי מערכת חיסון ברקמות המטרה, וב( 4) התערבות מקומית על ידי יישום מקומי או הזרקה תוך עיניים.

כאן, אנו iv שemonstrate כיצד לבצע את ההשתלה בלשכה הקדמית של העין באמצעות איי לבלב.

Protocol

ההליך הבא מבוצע בסטריאוסקופ ב 2 שלבים, השלב הראשון כרוך בטעינת האיונים לתוך הצינורית והשלב השני הוא השתלה בפועל לאייס. כל הניתוחים שבוצעו על בעלי חיים אושרו על ידי טיפול בבעלי החיים ועדה המוסדי שימוש (IACUC) מאוניברסיטת מיאמי.

1. איי טוען בקנייה להשתלה

  1. מרכז האיים במנת התרבות של ספינינג המנה בחוגים צרים.
  2. ניתק את הצינורית מ" המאגר "ולמקם את הצינורית וחיבור צינור על משטח נקי. המאגר יכול להתבצע מתוך קצה 300 μl פנוי פלסטיק פיפטה ללא סינון (האיור 1 א).
  3. שטוף את בועות אוויר מתוך המאגר על מנת להבטיח זרם רציף של איונים כאשר aspirating למאגר. פלאשינג המאגר נעשה על ידי נוסע קדימה מזרק הנהג ללא ידות הממונעות באמצעות דוושת הרגל(האיור 1b, ג). זה יהיה גם להפוך את החלל במזרק כדי לאפשר שאיפה של האיים למאגר (נטען מראש בתמיסה סטרילית כגון תקשורת המלוחה, PBS או תרבות).
  4. בעדינות לשאוב כמות רצויה של איונים למאגר. איונים נוטים מערבולת בה הם נכנסים למאגר ויישארו ביחד לכיוון התחתי. שאיפה נעשית על ידי נהיגת מזרק הנהג ממונע אחורה באמצעות דוושת הרגל.
  5. חבר מחדש את הצינורית למאגר דרך הצינור המקשר.
  6. הנח את קצה הצינורית שוב בצלחת התרבות ושטוף את האיים מתוך המאגר לצינורות ואז לתוך הצינורית. ודא שאיונים להישאר ביחד כמו שאתה גב למלא את הצינור / הצינורית ידי בעדינות "מצליף" (ציתות) צינורות (איור 1 ד). עצור לפני או אחרי כל בועות האוויר לפני האיונים הם שטפו את הצינורית. אם אינך בטוח, תפסיקו להיכנס כאיונים האחוריים של הצינורית כמו אוויר שנותרבועות לפני האיונים יכולים לסייע במניעת רפלוקס (זרימה חוזרת) של איונים מתוך ACE. הוא ייעלם בן לילה.
  7. בשלב זה, אתה מוכן להזרים האיונים לACE (ראה שלבים הבאים).

2. איון השתלה ללשכה הקדמית של העין

  1. מקם את העכבר מורדם על משטח חם תחת סטריאוסקופ.
  2. הנח את פרצופו של העכבר להרדמה "מסכה" מחוברת לחמצן / מכונת הרדמת isoflurane. המסכה עשויה מקצה 1 מ"ל פנוי פלסטיק פיפטה (ללא מסנן) ומחוברת לצינורות הרדמה עד הסוף הצר (האיור 2a, ב).
  3. עדינות חוזר בי את העפעפיים של העין כדי להיות מושתלים באמצעות אצבע והאגודל של היד החופשית שלך ו" פופ "העין על חשיפה טובה יותר וגישה נוחה (איור 2 ג). זה ידרוש קצת תרגול כדי לשכלל בלי לפגוע פגיעה קשה נשימה של העכבר על ידי לחץ מוגזם עלצוואר או חסימת זרימת דם לראש.
  4. השימוש במזרק אינסולין חד פעמי (29 - 31G) כאזמל, לחדור בזהירות רק הקצה בקרנית ולעשות חתך רוחבי אחד. הפוך את החתך באמצע בין השיא של הקרנית וגובל למזער ריפלוקס של האיים במהלך הזרקה מתוך ACE (איור 2 ד).
  5. בזהירות להכניס צינורית (preloaded עם איונים) דרך החתך.
  6. לאט להוציא איונים מתוך הצינורית ולהפקיד אותם בחלק העליון של הקשתית. כדי להימנע מריפלוקס איון בשל הצטברות לחץ מוגזמת בACE, להוציא את האיים בדחיפות קצרות כבנפח קטן (הים) שאפשר ברבע השני לחתך. זה יכול להיות עוד יותר על ידי הדחיסה הבטיח איונים בצינורות בעת טעינת הצינורית (אנא ראה שלב 1.6).
  7. לאט לאט לחזור בי הצינורית מתוך ACE. זהו צעד קריטי, במיוחד, אם נפח גדול של איונים הוזרק כריפלוקס איון בשל presבטוח לבנות בתוך ACE עשוי להיות בלתי נמנע. כדי למנוע / למזער ריפלוקס איון, בעדינות לסובב את הצינורית ואילו בתוך ACE לשחרר לחץ עודף דרך החתך מסביב לצינורית. לבדוק סימנים של ריפלוקס כפי שאתה מנסה לחזור בו צינורית ואם צריך, יש להמתין עד שוך לחץ לפני לחלוטין retracting הצינורית מתוך ACE.
  8. יש לשטוף את העיניים עם מושתלות סטרילי PBS או תמיסת מלח.
  9. הזרק עצירות לשיכוך כאבים שלאחר הניתוח (0.05-0.1 מ"ג / ק"ג, תת עורי) עבור 48 השעות הראשונות.
  10. החל משחה אנטיביוטית עיני אריתרומיצין לעין המושתלת מייד לאחר השתלה.
  11. הנח את החיה חזרה בכלוב מחומם כדי לאפשר התאוששות מן ההרדמה.

תוצאות

ישנם כמה פרמטרים שמגדירים השתלה "טובה". השתלה טובה היא אחד שנמשך ללא דימום בעת ביצוע החתך כפי שניתן לראות בוידאו. דימום מנוע / ממוזער על ידי חדירה רק קצה האזמל (מחט) לתוך ACE (איור 3 א). זה גם יעזור למנוע מגע ולנקב של הקשתית. זה גם יבטיח חתך קטן שירפא היטב מבלי ?...

Discussion

איי לבלב עכבריים היינו מבודדים באמצעות עיכול collagenase אחרי טיהור בשיפועים בצפיפות, כפי שתואר קודם לכן 33. איים מבודדים בתרבית הלילה לפני ההשתלה. אמנם זה לא ייתכן שיידרש, מומלץ לאפשר לאיונים להתאושש מהליך הבידוד. זה קריטי כאשר ההשתלה מתבצעת במקבלי סוכרת כפי שהוא יב?...

Disclosures

PO.B. הוא אחד ממייסדי Biocrine החברה ביוטכנולוגיה, שהוא הולך להשתמש בלשכה הקדמית של העין כפלטפורמת שירות מסחרית. AC הוא על הפטנט להגנת טכנולוגיה זו.

Acknowledgements

אנו מכירים בבני זוג. קמילו Ricordi, אנטונלו Pileggi, ר 'דמאריסו Molano, סטפן Speier ודניאל Nyqvist לדיונים פוריים. אנו מודים גם לEleut הרננדז ודייגו אספינוסה-Heidmann לתמיכה טכנית, ומייק ואלדס ומרגרט Formoso לעזרה עם הקלטת וידאו. ביירון מלדונאדו נרשם, הערך והפיק את הווידאו הסופי. תמיכה במחקר סופקה על ידי מכון מחקר סוכרת הקרן (www.DiabetesResearch.org), NIH / NIDDK / פוסי (F32DK083226 לMHA; NIH RO3DK075487 לAC; U01DK089538 לPO.B.). תמיכה במחקר נוספת כדי PO.B סופקה באמצעות כספים מקרולינסקה, מועצת המחקר השבדית, קרן הסוכרת השבדית, Erling-פרסון קרן המשפחה, המשפחה הקנוטה ואליס ולנברג הקרן, Skandia החברה לביטוח בע"מ, תוסס ( FP7-228933-2), תכנית מחקר אסטרטגי בסוכרת בקרולינסקה Institutet, נובו נורדיסק הקרן, וקרן המעגן פון של Kantzow.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
שם מגיב חברה מספר קטלוגים תיאור / תגובות
IsoTHESIA (isoflurane) אספקת לבריאות בעלי חי Buttler 11695-6775-2 99.9% isoflurane / מ"ל
Ketaset (קטמין HCL) לבריאות בעלי חי דודג פורט 0856-2013-01 הרדמת זריקות אלטרנטיבית
Beprenex (העצירות HCL) רקיט בנקיזר בריאות (בריטניה) בע"מ 12496-075-7-1 0.3 מ"ג / מ"ל
USP אריתרומיצין אופטלמולוגית משחה, 0.5% אקרון 17478-070-35 אפלייד מונע לעין מושתלת
0.9% כלוריד הנתרן (מלוח) Hospira בע"מ 0409-7983-03 להזרקת IV. סטרילי
PBS Gibco 10010-023 1X. סטרילי
CMRL בינוני 1066 Cellgro 98-304-CV תוספת, שינוי CIT. תקשורת המועדפת לאיונים

References

  1. Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. Intravital microscopy: a novel tool to study cell biology in living animals. Histochem. Cell Biol. 133 (5), 481-491 (2010).
  2. Leibiger, I. B., Caicedo, A., Berggren, P. O. Non-invasive in vivo imaging of pancreatic ?-cell function and survival - a perspective. Acta Physiol. (Oxf). , (2011).
  3. Wang, Y., Maslov, K., Kim, C., Hu, S., Wang, L. Integrated photoacoustic and fluorescence confocal microscopy. IEEE Trans Biomed. Eng. 57 (10), 2576-2578 (2010).
  4. Ntziachristos, V. Going deeper than microscopy: the optical imaging frontier in biology. Nat. Methods. 7, 603-614 (2010).
  5. Aswathy, R. G., Yoshida, Y., Maekawa, T., Kumar, D. S. Near-infrared quantum dots for deep tissue imaging. Anal. Bioanal Chem. 397 (4), 1417-1435 (2010).
  6. Ghoroghchian, P. P., Therien, M. J., Hammer, D. A. In vivo fluorescence imaging: a personal perspective. Wiley Interdiscip Rev. Nanomed Nanobiotechnol. 1 (2), 156-167 (2009).
  7. Prescher, A., Mory, C., Martin, M., Fiedler, M., Uhlmann, D. Effect of FTY720 treatment on postischemic pancreatic microhemodynamics. Transplant Proc. 42 (10), 3984-3985 (2010).
  8. Leblond, F., Davis, S., Valdés, P., Pogue, B. Pre-clinical whole-body fluorescence imaging: Review of instruments, methods and applications. J. Photochem. Photobiol. B. 98 (1), 77-94 (2010).
  9. Toso, C., Vallee, J. P., Morel, P., Ris, F., Demuylder-Mischler, S., Lepetit-Coiffe, M., et al. Clinical magnetic resonance imaging of pancreatic islet grafts after iron nanoparticle labeling. Am. J. Transplant. 8 (3), 701-706 (2008).
  10. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  11. Wang, B. G., Konig, K., Halbhuber, K. J. Two-photon microscopy of deep intravital tissues and its merits in clinical research. J. Microsc. 238 (1), 1-20 (2010).
  12. Denk, W., Delaney, K. R., Gelperin, A., Kleinfeld, D., Strowbridge, B. W., Tank, D. W., et al. Anatomical and functional imaging of neurons using 2-photon laser scanning microscopy. J. Neurosci. Methods. 54 (2), 151-162 (1994).
  13. Cahalan, M. D., Parker, I. Choreography of cell motility and interaction dynamics imaged by two-photon microscopy in lymphoid organs. Annu. Rev. Immunol. 26, 585-626 (2008).
  14. Khorshidi, M. A., Vanherberghen, B., Kowalewski, J. M., Garrod, K. R., Lindstrom, S., Andersson-Svahn, H., et al. Analysis of transient migration behavior of natural killer cells imaged in situ and in vitro. Integr. Biol. (Camb). 3 (7), 770-778 (2011).
  15. Matheu, M. P., Cahalan, M. D., Parker, I. Immunoimaging: studying immune system dynamics using two-photon microscopy. Cold Spring Harb. Protoc. 2011, pdb.top99 (2011).
  16. Celli, S., Albert, M. L., Bousso, P. Visualizing the innate and adaptive immune responses underlying allograft rejection by two-photon microscopy. Nat. Med. , (2011).
  17. Fan, Z., Spencer, J., Lu, Y., Pitsillides, C., Singh, G., Kim, P., et al. In vivo tracking of 'color-coded' effector, natural and induced regulatory T cells in the allograft response. Nat. Med. 16 (6), 718-722 (2010).
  18. Sabek, O., Gaber, M. W., Wilson, C. M., Zawaski, J. A., Fraga, D. W., Gaber, O. Imaging of human islet vascularization using a dorsal window model. Transplant Proc. 42 (6), 2112-2114 (2010).
  19. Coppieters, K., Martinic, M. M., Kiosses, W. B., Amirian, N., von Herrath, M. A novel technique for the in vivo imaging of autoimmune diabetes development in the pancreas by two-photon microscopy. PLoS One. 5 (12), e15732 (2010).
  20. Martinic, M. M., von Herrath, M. G. Real-time imaging of the pancreas during development of diabetes. Immunol Rev. 221, 200-213 (2008).
  21. Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Method for 2-Photon Imaging of Blood Flow in the Neocortex through a Cranial Window. J. Vis. Exp. (12), e678 (2008).
  22. Palmer, G. M., Fontanella, A. N., Shan, S., Hanna, G., Zhang, G., Fraser, C. L., et al. In vivo optical molecular imaging and analysis in mice using dorsal window chamber models applied to hypoxia, vasculature and fluorescent. 6 (9), 1355-1366 (2011).
  23. Jain, R. K., Munn, L. L., Fukumura, D. Dissecting tumour pathophysiology using intravital microscopy. Nat. Rev. Cancer. 2 (4), 266-276 (2002).
  24. Taylor, M. The response of capillary endothelium to changes in intravascular pressure, as seen in the rabbit's ear chamber. Aust. J. Exp. Biol. Med. Sci. 31 (5), 533-543 (1953).
  25. Shan, S., Sorg, B., Dewhirst, M. W. A novel rodent mammary window of orthotopic breast cancer for intravital microscopy. Microvasc. Res. 65 (2), 109-117 (2003).
  26. Speier, S., Nyqvist, D., Cabrera, O., Yu, J., Molano, R. D., Pileggi, A., et al. Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology. Nat. Med. 14 (5), 574-578 (2008).
  27. Speier, S., Nyqvist, D., Kohler, M., Caicedo, A., Leibiger, I. B., Berggren, P. O. Noninvasive high-resolution in vivo imaging of cell biology in the anterior chamber of the mouse eye. Nat. Protoc. 3 (8), 1278-1286 (2008).
  28. Falck, B. Site of production of oestrogen in the ovary of the rat. Nature. 184, 1082 (1959).
  29. Bickford-Wimer, P., Granholm, A. C., Bygdeman, M., Hoffer, B., Olson, L., Seiger, A., et al. Human fetal cerebellar and cortical tissue transplanted to the anterior eye chamber of athymic rats: electrophysiological and structural studies. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84 (16), 5957-5961 (1987).
  30. Adeghate, E., Donath, T. Morphological findings in long-term pancreatic tissue transplants in the anterior eye chamber of rats. Pancreas. 5 (3), 298-305 (1990).
  31. Abdulreda, M. H., Faleo, G., Molano, R. D., Lopez-Cabezas, M., Molina, J., Tan, Y., et al. High-resolution, noninvasive longitudinal live imaging of immune responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2011).
  32. Unutmaz, D., Xiang, W., Sunshine, M. J., Campbell, J., Butcher, E., Littman, D. R. The primate lentiviral receptor Bonzo/STRL33 is coordinately regulated with CCR5 and its expression pattern is conserved between human and mouse. J. Immunol. 165 (6), 3284-3292 (2000).
  33. Pileggi, A., Molano, R. D., Berney, T., Cattan, P., Vizzardelli, C., Oliver, R., et al. Heme oxygenase-1 induction in islet cells results in protection from apoptosis and improved in vivo function after transplantation. Diabetes. 50 (9), 1983-1991 (2001).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

73hyperinsulinismIn vivo

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved