דיגיטלי Inline הולוגרפי מיקרוסקופית (DIHM) של נושאים בחולשת פיזור

Summary

המקומות תלת ממדיים של אובייקטים בחולשה-פיזור יכולים להיות מזוהים באופן ייחודי באמצעות מיקרוסקופ דיגיטלי מוטבע הולוגרפית (DIHM), הכולל שינוי קל במיקרוסקופ רגיל. התוכנה שלנו משתמשת היוריסטי הדמיה פשוטה יחד עם ריילי-זומרפלד גב ההתפשטות להניב את המיקום ואת הגיאומטריה של אובייקט שלב מיקרוסקופי תלת ממדים.

Abstract

אובייקטים בחולשה-פיזור, כגון חלקיקי colloidal קטנים ורוב תאים ביולוגיים, הם נתקלו לעתים קרובות במיקרוסקופ. אכן, מגוון רחב של טכניקות פותחו כדי להמחיש טוב יותר אובייקטי השלב הבאים; ניגוד השלב ודסק"ש הם בין השיטות הפופולריות ביותר לשיפור קונטרסט. עם זאת, עמדת הקלטה וצורה בכיוון מחוץ להדמית מטוס נותרים מאתגרות. דו"ח זה מציג את שיטה ניסיונית פשוטה כדי לקבוע במדויק את המיקום וגיאומטריה של אובייקטים בשלושה ממדים, באמצעות מיקרוסקופ הולוגרפי מוטבע דיגיטלי (DIHM). באופן כללי, הנגיש נפח הדגימה מוגדר על ידי גודל חיישן המצלמה בכיוון לרוחב, ולכידות התאורה בכיוון הצירי. כרכי מדגם אופייניים נעים בין 200 מיקרומטר x 200 מיקרומטר x 200 מיקרומטר באמצעות תאורת LED, ל5 מ"מ x 5 מ"מ x 5 מ"מ ויותר, באמצעות תאורת לייזר. אור ההארה זו מוגדר כך שגלי מטוס הם אירוע על המדגם. אובייקטים בנפח הדגימה אז מפזרים אור, אשר מפריע לאור unscattered כדי ליצור דפוסי התערבות בניצב לכיוון התאורה. תמונה זו (הולוגרמה) מכילה את מידע העומק הנדרש לשחזור תלת ממדי, ויכולה להיות שנתפס על מכשיר הדמיה סטנדרטי כגון ה-CMOS או מצלמת CCD. שיטת גב התפשטות ריילי-זומרפלד מועסקת למקד מחדש מבחינה מספרית תמונות מיקרוסקופ, והיוריסטי הדמיה פשוטה המבוסס על שלב Gouy האנומליה משמשת לזיהוי פיזור אובייקטים בתוך הנפח המשוחזר. שיטה פשוטה אך חזקה כתוצאה ממדידה חד משמעית, ללא מודל של המיקום וצורה של אובייקטים בדגימות מיקרוסקופיות.

Introduction

מיקרוסקופ הולוגרפי מוטבע דיגיטלי (DIHM) מאפשר הדמיה תלת ממדית מהירה של דגימות מיקרוסקופיות, כגון מיקרואורגניזמים שחייה ^1,2 ומערכות חומר רכים ^3,4, עם שינויים מינימאליים להתקנת מיקרוסקופ רגילה. במאמר זה הפגנה פדגוגית של DIHM מסופקת, סביב תוכנה שפותחה במעבדה שלנו. נייר זה כולל תיאור של איך להגדיר את המיקרוסקופ, לייעל את האיסוף וניתוח נתונים, ולעבד את התמונות שתועדו לשחזר נתונים תלת ממדיים. התוכנה (המבוססת בחלקו על תוכנה שפותח על ידי DG גריר ואחרים ⁵⁾ ותמונות דוגמא זמינה באופן חופשי באתר האינטרנט שלנו. תיאור מסופק על הצעדים הדרושים כדי להגדיר את המיקרוסקופ, לשחזר נפחים תלת ממדים מהולוגרמות ולעבד כמויות של עניין וכתוצאה מכך באמצעות קרן חופשית התחקות חבילת תוכנה. העיתון מסכם בדיון על גורמים המשפיעים על איכות השיקום, והשוואה של DIHM עם שיטות מתחרות.

למרות DIHM תואר לפני כמה זמן (לסקירה כללית של העקרונות והפיתוח שלה, לראות את קים ^6), כוח המחשוב הנדרש ומומחיות עיבוד תמונה עד כה במידה רבה להגביל את השימוש בה לקבוצות מחקר מומחה עם דגש על פיתוח מכשיר. מצב זה משתנה לאור ההתקדמות שחלה באחרונה בטכנולוגית המצלמה מחשוב ו. מחשבים אישיים מודרניים יכולים בקלות להתמודד עם העיבוד ודרישות אחסון נתונים; מצלמות CCD או CMOS נמצאות ברוב המעבדות מיקרוסקופית, והתוכנה הנדרשת הוא עשויה להיות זמינה באופן חופשי באינטרנט על ידי קבוצות שהשקיעו זמן בפיתוח הטכניקה.

תוכניות שונות הוצעו להדמית התצורה של עצמים מיקרוסקופיים בשלושה ממדי נפח דגימה. רבים מאלה סורקים טכניקות ^7,8, שבו ערימה של תמונות שתועדה על ידי מ 'echanically תרגום מטוס התמונה באמצעות המדגם. מיקרוסקופ פלואורסצנטי confocal הסריקה הוא אולי הדוגמא המוכרת ביותר. בדרך כלל, צבע פלואורסצנטי מתווסף לאובייקט שלב על מנת להשיג רמה סבירה של ניגוד מדגם, והסדר confocal משמש למקם פליטת ניאון מרחבית. שיטה זו הובילה להתקדמות משמעותית, למשל במדע קולואיד שבו אפשרה גישה לדינמיקה תלת ממדית של מערכות צפופות ^9-11. השימוש בתיוג הוא הבדל חשוב בין מיקרוסקופיה confocal פלואורסצנטי וDIHM, אבל תכונות אחרות של שתי הטכניקות הן כדאי להשוות. יש DIHM יתרון מהירות משמעותי בכך שיש לו את המכשיר ללא חלקים נעים. מראות הסריקה מכאניות במערכות confocal להציב גבול עליון לשיעור רכישת נתונים - בדרך כלל סביב 30 מסגרות / שניות לתמונת פיקסל 512 x 512. ניתן לקבל ערימה של תמונות כאלה ממטוסי מוקד שונים על ידי פיזי Translating שלב המדגם או עדשה אובייקטיבית בין מסגרות, מה שמוביל לשיעור לכידה סופי של כ כרך אחד לשנייה עבור מחסנית מסגרת 30. לשם השוואה, מערכת הולוגרפית המבוססת על מצלמת CMOS מודרנית יכולה ללכוד 2,000 מסגרות / שנייה באותו גודל התמונה ורזולוציה; כל תמונת מעובדת `מחובר 'לתת תמונת מצב בלתי תלויה בנפח הדגימה. כדי לחזור ולהדגיש: דגימות ניאון אינן נדרשות לDIHM, אם כי מערכת פותחה שמבצעת שחזור הולוגרפי של נושא ניאון ^12. כמו גם מידע נפח תלת ממדים, DIHM יכול לשמש גם כדי לספק תמונות לעומת שלב הכמותי ^13, אבל זה מעבר להיקף של הדיון כאן.

תמונות הנתונים הגולמיים DIHM הן דו ממדיות, ובמובנים מסוימים נראות כמו תמונות מיקרוסקופ רגילות, אם כי מחוץ לפוקוס. ההבדל העיקרי בין DIHM ומיקרוסקופ שדה בהיר סטנדרטי טמון בטבעות העקיפה המקיפות את אובייקטי in את שדה הראיה, אלו הן בשל האופי של התאורה. DIHM דורש מקור קוהרנטית יותר מ שדה בהיר - בדרך כלל LED או לייזר. הטבעות העקיפה בהולוגרמה מכילות את המידע הדרוש כדי לשחזר תמונה תלת ממדית. ישנן שתי גישות עיקריות לפרשנות נתוני DIHM; מיקוד מחודש ראוי ומספרי ישיר. הגישה הראשונה היא ישימה במקרים בהם הצורה המתמטית של התבנית העקיפה ידועה מראש ^3,4; תנאי זה מתקיים על ידי קומץ קטן של אובייקטים פשוטים כמו כדורים, גלילים, ומכשולים חצי מטוס. התאמה ישירה היא גם ישימה במקרים בהם המצב הצירי של האובייקט ידוע, והתמונה יכולה להיות מצוידת באמצעות טבלה להסתכל למעלה של תבניות תמונה ^14.

הגישה השנייה (מיקוד המחודש מספרי) היא די כללית יותר ומסתמכת על שימוש בטבעות העקיפה בדמות הולוגרמה דו ממדים לשחזר את השדה האופטי מבחינה מספרית במספר המטוסים (במרווחים באופן שרירותי) המוקדים ברחבי נפח הדגימה. מספר שיטות הקשורים קיימות עבור עושה ⁶ זה; עבודה זו משתמשת ריילי-זומרפלד חזרה טכניקת התפשטות כפי שתאר לי וגריר ^5. התוצאה של הליך זה היא ערימה של תמונות המחקות את ההשפעה של שינוי מטוס מיקרוסקופ המוקד (ומכאן השם `מיקוד המחודש מספרי") באופן ידני. ברגע שערימה של תמונות כבר נוצרה, יש לקבל את עמדתו של הנושא בהיקף המוקד. מספר היוריסטיות ניתוח תמונה, כמו שונות עוצמת מקומית או תוכן תדר המרחבי, הוצג לכמת את חדות מיקוד בנקודות שונות במדגם ^15. בכל מקרה, כאשר מדד תמונה מסוים מוגדל (או למזער), האובייקט נחשב בפוקוס.

בניגוד לתוכניות אחרות שמבקשות לזהות מטוס מוקד מסוים שבו אובייקט הוא "בפוקוס", השיטה בעבודה זו מרימה את points ששוכב בתוך האובייקט של עניין, אשר עשוי להאריך על פני מגוון רחב של מטוסי מוקד. גישה זו חלה על מגוון רחב של נושאים, והוא מתאים במיוחד להארכה, דגימות בחולשה-פיזור (אובייקטי שלב), כגון קולואידים בצורת מוט, שרשרות של חיידקים או שוטונים אוקריוטים. בדגימות כגון ניגוד התמונה משתנה כאשר האובייקט עובר דרך מישור המוקד; יש תמונה לא ממוקדת מרכז אור אם האובייקט הוא בצד אחד של מטוס המוקד ומרכז כהה, אם זה בצד השני. יש לא מעט ניגוד אובייקטי שלב טהורים כאשר הם שוכבים בדיוק במישור המוקד. תופעה זו של היפוך לעומת זאת נדונה על ידי מחברים אחרים ^16,17 וסופו של דבר בשל שלב Gouy האנומליה ^18. זה כבר הכניס על בסיס קפדני יותר בהקשר של הולוגרפיה במקום אחר, שבו הגבולות של הטכניקה מוערכים; חוסר הוודאות האופיינית בעמדה היא בסדר גודל של 150 ננומטר (כפיקסל) בEACכיוון שעות ^19. שיטת האנומליה שלב Gouy היא אחת תוכניות DIHM המוגדרות היטב כמה לקביעת המבנה של אובייקטים מורחבים בשלושה ממדים, אבל בכל זאת כמה אובייקטים הם בעייתיים לשחזר. אובייקטים הנמצאים באופן ישיר לאורך הציר האופטי (מצביע על המצלמה) הם קשה לשחזר במדויק; אי ודאויות באורך והמיקום של האובייקט להיות גדולות. מגבלה זו היא בין שאר בשל העומק הסיביות המוגבל של פיקסלים הקלטת הולוגרמה (מספר הרמות האפורות שונות שהמצלמה יכולה להקליט). עוד תצורה בעייתית מתרחשת כאשר מושא העניין הוא קרוב מאוד למישור המוקד. במקרה זה, תמונות אמיתיות ווירטואליות של האובייקט משוחזרים בסמיכות, והוליד שדות אופטיים מסובכים שקשה לפרש. חשש שני, מעט פחות חשוב כאן הוא ששולי עקיפה וכתוצאה מתופסים פחות של חיישן התמונה, וinf גרנולות גס זהormation מוביל לשיקום עני באיכות.

בפועל, מסנן שיפוע פשוט מוחל כרכים משוחזרים תלת ממדים כדי לזהות היפוכי עוצמה חזקים לאורך כיוון התאורה. אזורים שבם בעוצמה משתנה במהירות מהאור לחושך, או להיפך, אז הם קשורים באזורי פיזור. אובייקטים בחולשה-פיזור מתוארים גם כאוסף noninteracting של אלמנטים כגון ^20; סכום תרומות הבודד האלה לתת את השדה המפוזר בסך הכל שהוא הפוך בקלות באמצעות גב שיטת ריבוי ריילי-זומרפלד. במאמר זה, טכניקת שיפוע עוצמת צירית מוחלת על שרשרת של תאי סטרפטוקוקוס. גופי התא הם אובייקטי שלב (יש החיידק מיני מקדם שבירה נמדדה ²¹ להיות 1.384 בλ = 589 ננומטר אורך גל; מתח סטרפטוקוקוס צפוי להיות דומה) ותופיע כשרשרת בעוצמה גבוהה של כתמים מחוברים ב הלאחר סינון שיפוע דואר נפח דגימה יושם. שיטות מיצוי סטנדרטיות סף והתכונה להחיל נפח מסונן זה מאפשרים המיצוי של פיקסלים נפח (voxels) המתאימים לאזור בתוך התאים. יתרון מסוים של שיטה זו הוא שהיא מאפשרת שחזור חד משמעי של העמדה של אובייקט בכיוון הצירי. שיטות דומות (לפחות, שהולוגרמות אלה השיא קרובים לאובייקט, צילמו באמצעות מיקרוסקופ מטרה) סובלות מחוסר יכולת לקבוע את הסימן של עקירה זו. למרות ששיטת שחזור ריילי-זומרפלד גם לחתום עצמאי במובן זה, הפעולה הדרגתית מאפשרת לנו להבחין בין עצמים שלב החלשים מעל ומתחת למישור המוקד.

Protocol

1. התקנה ורכישת נתונים

1. לגדול תרבות של סטרפטוקוקוס מתח V4051-197 תאים (שחיה חלקה) במדיום KTY ממניות קפוא ^22. דגירה שבייקרה סיבובי לילה בשעה 35 מעלות צלזיוס ו150 סל"ד, לרוויה.
2. לחסן 10 מיליליטר של מדיום KTY הטרי עם 500 μl של התרבות הרווי. דגירה במשך שעה 3.5 נוספת ב35 מעלות צלזיוס ו150 סל"ד עד שהתאים מגיעים לצפיפות אופטית של כ 1.0 בλ = 600 ננומטר (מיליליטר / כ 5 x 10 ⁸ תאים).
3. לדלל 1:400 בתקשורת טרי כדי להשיג הריכוז הסופי של תאי ניעתי.
4. בשקופית מיקרוסקופ, להפוך את טבעת של שומן (לדוגמא ממזרק מלא בוזלין) בסביבות 1 מ"מ גובה ובמקום ירידה של הפתרון לדוגמא במרכז. מניחים מכסה זכוכית באורח קל בראש ולחץ בקצוות כדי לאטום, הבטחת הנוזל שנמצאה בקשר עם שני שקופיות וכיסוי זכוכית. מדגם החדר וכתוצאה מכך צריך להיות around 100-200 מיקרומטר לעומק.
5. מניחים את החדר לדוגמא במיקרוסקופ עם מכסה הזכוכית פונה כלפי מטה, ובזהירות, כדי למנוע היווצרות של בועות אוויר בשמן בין הזכוכית ועדשות.
6. פוקוס מיקרוסקופ על פני השטח התחתון של חדר המדגם, ולהביא את הקבל להתמקד.
7. כבה את התאורה סטנדרטית ולמקם את ראש LED מאחורי צמצם הקבל של המיקרוסקופ. הגדר את אספקת חשמל LED לתפוקה מקסימלית.
8. סגור את צמצם הקבל מידה במלואם, ואם יש צורך, דחיפה LED בהר ועד התאורה מתמקדת בצמצם העדשה האובייקטיבי.
9. הפעל את המחשב והמצלמה, ולהפנות את כל האור ליציאת המצלמה של המיקרוסקופ. התאם את קצב מסגרת ואת גודל התמונה בתוכנת רכישת תמונה.
10. הפוך את זמן חשיפת מסגרת קצר ככל האפשר, תוך שמירה על ניגודיות טובה. בדוק היסטוגרמה עוצמת תמונה, כדי להבטיח שהתמונה היא לא saturaטד או חשוף תחת.
11. במידת צורך, ולמקד את המיקרוסקופ כך שמושא העניין הוא מעט מזוגג (בדרך כלל על ידי 10-30 מיקרומטר). האובייקט ומישור המוקד צריך להיות באותו המדיום (כלומר מישור המוקד צריך לשכב בתוך החדר לדוגמא).

2. שחזור

הצעד הראשון של עיבוד נתונים הוא למקד מחדש מבחינה מספרית מסגרת וידאו בסדרה של עומקים שונים, לייצר ערימה של תמונות. תוכנה ידידותית למשתמש עושה את זה ניתן למצוא כאן: http://www.rowland.harvard.edu/rjf/wilson/Downloads.html יחד עם תמונות דוגמא (שנרכשו באמצעות מיקרוסקופ הפוכה, ועדשה אובייקטיבית 60x טבילת שמן) וזירת קובץ לקרן לייחס טיוח.

1. קלט למסגרת של עניין והרקע שלה בהתאמה כקבצי תמונה נפרדות, בתיבות הרלוונטיות בממשק. תמונת רקע היא מסגרת שfairly מייצג את הרקע של הווידאו, בהיעדר הולוגרמה, וישמש לדיכוי כל רעש קבוע דפוס שיכול להפריע ללוקליזציה הולוגרמה וניתוח.
2. הזן ערכים בתיבות ההגדרות הגלובליות בצד שמאל של המסך לפני הפעלת התכנית. השלושה הראשונים פרמטרים מחסנית פלט הם: מיקום ציר הסיבוב של המסגרת הראשונה ('התחל מוקד'), מספר פרוסות בערימה המשוחזרת ("מספר הצעדים"); מרחק צירי בין כל פרוסה במחסנית ("גודל צעד") .
3. כדי לשחזר את האובייקטים עם הפרופורציות הנכונות, גודל הצעד צריך להיות באותו הגודל כמו את מרווח פיקסל לרוחב. הזן את התדר של המצלמה לרוחב דגימה (מרווח 1/pixel) בתיבת 'Pixel / מיקרון', אורך גל התאורה ומקדם שבירה בינונית בשתי התיבות האחרונות. ערכי ברירת המחדל של התכנית מתאימים לשחזור נתונים ירושלים.
4. לחץ על הכפתור 'Z-שיפוע פליפ "אם מרכז objeCT הוא כהה בהולוגרמה (ראה דוגמא מסגרת 2005 וסעיף הדיון לפרטים נוספים).
5. בדקו את מסנן bandpass / כיבוי מדינה (ברירת מחדל הוא על). מסנן זה אופציונלי bandpass, הממוקם בתיבה שמתחת למתג שיפוע-Flip, הוא אחראי לדיכוי התרומה מפיקסלים רועשים. מסנן bandpass מוחל על כל פרוסה תמונה באופן מיידי אחרי הדור.
6. בדוק את מתג תוצרת ביניים במדינות / כיבוי (ברירת מחדל היא על). צעדי ניתוח ביניים שנכתבו בשני קטעי וידאו פלט, כדחוס קבצי avi:. הראשון הוא הערימה מקדה מחדש (שם קובץ מסתיים ב '_stack.avi'), השני היא הערימה לאחר ניתוח השיפוע הצירי (שם קובץ מסתיים ב ' _gradient.avi '). באופן אידיאלי, ערימה שנייה תכיל את מושא העניין מודגש כאובייקט בהיר על רקע כהה.
7. לאחר הגדרת כל הפרמטרים, לחץ על 'הפעל' בחלון הראשי. המסגרת שנבחרה תופיע בתיבה הראשית של התוכנה.
8. השתמשכלי זכוכית מגדלת שנמצא בסרגל הכלים בצד השמאל של התמונה כדי להגדיל ב( קליק שמאלי) ולהקטין את התצוגה (shift + קליק שמאלי). השתמש בכלי המלבן בסרגל הכלים כדי לבחור אזור של העניין (ROI). ללכוד כמה שיותר מהשולים של הולוגרמה ככל האפשר בתוך המלבן, כמו זה יהיה לייעל את השיקום.
9. לחץ על הכפתור 'התהליך' כדי ליצור שתי ערימות תמונה. בדוק את הערימות וכתוצאה מכך באמצעות ImageJ (שניתן להשיג בחינם בhttp://rsb.info.nih.gov/ij/). אם האובייקט של עניין ניתן לראות בתמונת מחסנית הצבע באופן ברור, המשך לשלב הבא כדי לחלץ את קואורדינטות האובייקט.

3. טיוח

1. חוץ ממיקוד מחודש מסגרת, תכנית זו יכולה לאתר את x, y, z קואורדינטות עבור כל voxel באובייקט של עניין. לחץ על הכפתור 'הפקת תכונה' כדי לאפשר פונקציה זו.
2. הזן את נתיב, כולל סיומת (לדוגמא: c: output.inc הבית), עבורפלט קובץ קואורדינטות. בחר 'סגנון POV-Ray' בתיבה 'פלט לתאם סגנון'. זה גורם לתכנית לכתוב קובץ אובייקט שניתן דמיינו באמצעות החבילה חינם POV-Ray תוכנת raytracing (אשר ניתן להשיג מhttp://www.povray.org/).
3. לעבד מחדש את התמונות כאמורות בסעיף 2 לעיל. התכנית תספק סדרה של (x, y, z) קואורדינטות בהחזר על ההשקעה שנבחרה, שנכתבה לשם הקובץ ב'הפלט לתאם 'התיבה. חילוץ של קואורדינטות אובייקט לוקח משמעותי יותר מאשר דור ערימה.
4. ודא כי מדגם קובץ POV-Ray (מסופק עם קוד השיקום) הוא באותה התיקייה כקואורדינטות להגיש רק נוצרו. ערוך את קובץ POV מדגם. ולהחליף את שם הקובץ במרכאות כפולות על הקו
   # Include "MYFILE.inc"
   עם השם של קובץ נתונים שנוצר על ידי קוד השחזור.
5. לחץ על לחצן 'הפעלת' בPOV-Ray כדי להבהיר תמונת מפת סיביות. Tהוא מיקום המצלמה, תאורה ואפשרויות מרקם הם רק כמה מההתאמות אפשריות בPOV-Ray, ראה את התיעוד באינטרנט לקבלת פרטים.

תוצאות

כדי להדגים את היכולות של DIHM, ניסויים בוצעו על שרשרת של חיידקי סטרפטוקוקוס. השרשרת עצמה נמדדה 10.5 מ"מ ארוכה, והייתה מורכבת מ6-7 תאי sphero-גלילי (שניים מהתאים בשרשרת קרובים לחלוקת) בקטרים ​​בטווח 0.6-1 מיקרומטר. איורים 1A ו-1B להראות את הממשק הראשי של השיקום ותו?...

Discussion

הצעד החשוב ביותר בפרוטוקול ניסוי זה הוא הלכידה מדויקת של תמונות מהתקנה ניסיונית יציבה. עם נתוני רקע עניים, שיקום באיכות גבוהה הוא כמעט בלתי אפשרי. כמו כן, חשוב להימנע מעדשות אובייקטיביות עם אלמנט פנימי שלב ניגוד (נראה כמו annulus כהה כאשר מסתכל דרך החלק האחורי של אובייקט?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope	Nikon Corp.
LED	Thorlabs	M660L3	emission wavelength λ=660 nm, linewidth approximately 20 nm
LED power supply	Thorlabs	LEDD1B
Thread Adapter	Thorlabs	SM2T2
Thread Adapter	Thorlabs	SM1A2
Frame Grabber board	EPIX	PIXCI E4
High-Speed CMOS camera	Mikrotron	MC-1362