סינתזה, משלוח נייד ו<em&gt; בvivo</em&gt; יישום של חיישני pH מבוססי dendrimer

Summary

חיישני הקרינה הם כלים רבי עוצמה בתחום מדעי חיים. כאן אנו מתארים מתודולוגיה לסנתז ולהשתמש בחיישני ניאון מבוסס dendrimer למדוד pH בתאים חיים וin vivo. הפיגום הדנדריטים משפר את תכונותיהם של צבעי ניאון מצומדות המובילים למאפייני חישה משופרים.

Abstract

הפיתוח של אינדיקטורים ניאון ייצג מהפכה למדעי חיים. מבחינה גנטית מקודד וfluorophores הסינתטי עם יכולות חישה אפשר להדמיה של מינים רלוונטיים מבחינה ביולוגית עם רזולוציה מרחבית ובזמן גבוה. צבעים סינטטיים הם של עניין מיוחד הודות לtunability הגבוה שלהם ואת מגוון הרחב של analytes למדידה. עם זאת, מולקולות אלה סובלים מספר מגבלות הקשורות להתנהגות מולקולה קטנה (מסיסות ירודה, קשיים במיקוד, לעתים קרובות אין הדמיה ratiometric מותרת). בעבודה זו אנו מציגים את הפיתוח של חיישנים מבוססי dendrimer ולהציג את הליך למדידת רמת חומציות במבחנה, בתאים חיים וin vivo. אנחנו בוחרים dendrimers כפלטפורמה אידיאלית עבור החיישנים שלנו עבור רבים תכונותיהם רצויות (monodispersity, תכונות מתכונן, multivalency) שגרמו להם פיגום בשימוש נרחב לכמה מכשירים ביו. נטיה של pH הניאוןאינדיקטורים לפיגום dendrimer הובילו לשיפור של הופעות החישה שלהם. בפרט תערוכת dendrimers הקטינה זליגת תא, מיקוד תאיים משופר ויאפשר מדידות ratiometric. חיישנים אלה רומן הועסקו בהצלחה למדידת רמת חומציות בתאים חי הלה ובחי במוח עכבר.

Introduction

השימוש במולקולות ניאון לתייג מולקולות ביולוגיות רלוונטיות ספציפיות השתנתה לחלוטין את הדרך בה אנו לומדים במערכות ביולוגיות. Widefield ומיקרוסקופיה confocal אפשרה להדמיה בזמן אמת ברזולוציה הגבוהה של תהליכים ביולוגיים וכיום הם בין הטכניקות הפופולריות ביותר ללמוד אירועים ביולוגיים במבחנה, בתאי in vivo. ¹ שיפור רלוונטי היה מיוצג על ידי הפיתוח של אינדיקטורים הקרינה , צבעים כלומר הקרינה שתלויה בריכוזה של ישות מולקולרית ספציפית. מדדי ה-pH וסידן בפרט היו השפעה דרמטית על המחקר של פיזיולוגיה של תא עקב הרלוונטיות עצומות של H ⁺ ו Ca ^{2 +} יונים בביולוגיה. ^2,3

עם זאת, רוב צבעי החישה הנוכחיים כמה מגבלות פנימיות הקשורים להתנהגות המולקולה הקטנה שלהם, כגון: א) קשיים בtargeti subcellularng; ii) מסיסות עניות במים וכתוצאה מכך biocompatibility עניים;. וiii) דליפת תא ובכך חוסר היכולת הארוכה זמן לשגות הדמיה ⁴ יתר על כן, את האות של בדיקות רבות לא ניתן לתקן עבור התלות בריכוז הצבע (שאינה ההדמיה ratiometric) ולכן, מדידה מוחלטת בתאים או בvivo היא לא אפשרית.

לאחרונה תוארו המתודולוגיה פשוטה ויעילה כדי להתגבר על המגבלות האלה, המבוססות על נטיה של צבעי חישה על פיגום dendrimer. ⁵ Dendrimers הם פולימרים hyperbranched monodisperse עם מאפיינים מאוד מושך עבור יישומים ביולוגיים. ⁶ בפרט כמה ארכיטקטורות הדנדריטים פותחו ומשמשות לתרופה ⁷ ומסירת גן. ⁸ רק לאחרונה מספר קבוצות התחילו לחקור את הפוטנציאל של מולקולות אלה כפיגום למכשירי חישה. ^9,10,11

אנחנו בעברתאר מסלול קל סינטטי כלפי functionalization של polyamidoamine שונה פיגומים (Pamam) המבוסס על אסטרים הופעלו-NHS. ניתן להשיג ¹² Conjugates בשלב אחד בדרך של דיאליזה כטיהור בלבד. מעניין גישה זו יכולה בקלות להיות מיושמת על מגוון רחב של פיגומים הדנדריטים או פולימרים. ^13,14

כדי להשיג dendrimers ההדמיה ratiometric היו עם שני סטים של צבעים שכותרתו כפולים: א) אינדיקטור pH (כלומר העמסה) וii) מחצית pH עצמאי ניאון (כלומר rhodamine). זה אפשר לנו לבצע הדמיה מדויקת של pH כיחס בין ההעמסה וrhodamine הוא רק תלוי בחומציות ולא יותר על הריכוז של החללית. גישה מעניינת נוספת לנושא זה מיוצגת על ידי השימוש בבדיקות המבוססים על חייו. ¹⁵ כחיים אינם תלויות בריכוז בדיקה מדידות אלה לא צריכים תיקון ratiometric. עם זאת, lifמדידות etime דורשות התקנת אינסטרומנטלי מסובכת יותר והרזולוציה של הזמן שלהם היא תת אופטימלית לתהליכים פיסיולוגיים במהירות, ובכך להגביל היישומים הפוטנציאליים שלהם.

על מנת לבצע הדמיה תאית, החללית צריכה להיות מועברת על פני קרום הפלזמה לתוך cytosol. כdendrimers לא קרום חדיר בשל הגודל וhydrophilicity, משלוח תאיים יכול להיות מושגת באמצעות electroporation. באמצעות טכניקה זו, בשימוש נרחב בביולוגיה לtransfection, מקרומולקולות שכותרתו יכולה להיות מועברות בצורה יעילה לתאים לבצע הדמיה באיכות גבוהה. יתר על כן, עם electroporation ניתן להימנע מסיבוכים הקשורים לאנדוציטוזה dendrimer כמקרומולקולות מועברות ישירות לציטופלסמה. מעניין אחרי dendrimers שונה electroporation תערוכות מגוירים מובחן בתוך התאים גם בהיעדרו של כל רצף מיקוד ספציפי. ⁵ passiv זהדואר מיקוד, רק בשל מאפייני physicochemical של dendrimer, ניתן לנצל כדי להשיג הדמיה pH אברון הספציפי.

הדמיה ratiometric יכולה להתבצע באמצעות מיקרוסקופיה confocal. ההעמסה וrhodamine, קוולנטית מצומדת לפיגום הדנדריטים, היו צילמו בנפרד ומפת יחס פיקסל אחר פיקסל נוצרה. כמה נהלים כדי לשלוט ברמת חומציות תוך תאית בתאים חיים באמצעות יונופורים דווחו. יונופורים הם מולקולות קטנות הידרופובי מסוגלים להעביר יונים על פני קרום הפלזמה; יונופורים עבור H ⁺ יון, כגון nigericin, זמינים וניתן להשתמש בו כדי לכייל את החיישנים מבוססי dendrimer ¹⁶ מדידות אלה חשפו תגובה ליניארי ל-pH באופן דומה למה שנצפה. במבחנה. על בסיס ה-pH תאית כיול ניתן היה למדוד באופן מדויק. מדידות אלה הראו כי חיישן מבוסס dendrimer יכול להיות כלי רב ערך במחקר H ⁺ homeostאס בתאים חיים ובתהליכים פתולוגיים שכרוך בתקלות ויסות רמת חומציות.

לאחרונה הוכיחו כי יכולים להיות מיושמים גם חיישני pH מבוסס dendrimer in vivo, ביצוע ההדמיה pH במוח של עכברים מורדמים. ¹⁷ בשל הסביבה המורכבת של רקמות חיות באיכות גבוהה בחישת vivo היא מאתגרת מבחינה טכנית. כאן אנו מראים תיאור מפורט של ההליך ניסיוני להדמית pH in vivo עם דגש של הסוגיות מכריעות לטפל לבצע הדמיה מדויקת של pH במוח. שני הפוטונים במיקרוסקופ כבר מועסק משתי סיבות עיקריות: א) השימוש באור אינפרא אדום מאפשר להתגבר על חוסר חדירה לרקמות של מיקרוסקופיה confocal הסטנדרטי; ii) את ספיגת שני פוטונים הרחב של העמסה וrhodamine מאפשרת העירור בו זמנית שלהם הימנעות סיבוכים הקשורים לשימוש בשני אורכי גל לעירור. מדידות pH במוח עכבר היוביצע בהצלחה החוצה; חיישנים בקלות להגיב להיפוקסיה לגרום לשינוי של ה-pH במרחב תאי במוח. מדידות אלו מראות כי אינדיקטורים המבוסס על dendrimer יכולים לשמש בהצלחה כדי להדגיש את השינוי פיסיולוגי ופתולוגיים של pH in vivo במודל חיה.

Protocol

1. סינתזה של חיישנים

1. בסעיף הבא שאנו מספקים להליך נטיה של מדדי ה-pH ל dendrimers Pamam. אותו הפרוטוקול יכול להיות מיושם עם שינויים מינימאליים לdendrimers אמין נושאות חלופיות. ^5,17,13,14 dendrimers וצבעים ניתן להשיג בחנויות ניתן להשתמש ללא purifications נוספת.
2. ממיסים את dendrimer בDMSO נטול מים (ריכוז סופי 50 מיקרומטר). הכן פתרונות מניות 10mm של ההעמסה-NHS וtetramethyl-rhodamine-NHS (ת.מ. ר) ב DMSO נטול מים.
3. הוסף לפתרון dendrimer את הכמות הרצויה של העמסה וTMR. היחס טוחנת בתערובת ישקף את כמות הצבעים נטענים על dendrimer. בדרך כלל 1 מיליליטר של תמיסת dendrimer Pamam G4 בצינור microcentrifuge הוא הגיב עם 8 EQ (40 μl) של והעמסת ו8 EQ (40 μl) של TMR. מערבבים את הפתרון בטמפרטורת חדר למשך שעה 12.
4. לדלל 1:10 עם מים deionized ולטעון את התגובהתערובת בשקית דיאליזה (MWCO = 10 KDA). Dialyze ל24 שעות נגד המים deionized החלפה בתדירות גבוהה המים במאגר.
5. מעביר את הפתרון לבקבוקון ולהקפיא יבש ל24 שעות. יש לקבל אבקה סגולה. משקל שהושג מוצק ולהמס אותו במי milliQ בריכוז סופי של 10 מיקרומטר. Aliquot הפתרון ולאחסן ב -20 ° C.

2. במבחנה מדידות pH

1. במבחנת הכיול להכין 500nm פתרון של dendrimer ב PBS (פוספט 2 מ"מ) בקובט קוורץ. השימוש בחיץ מאוד לדלל PBS (2 מ"מ), כדי למנוע שינויים פתאומיים של pH בטיטרציה מומלץ.
2. מדוד את ספקטרום הפליטה של ​​והעמסת (exc 488 ננומטר) ות.מ. ר (exc 550 ננומטר) ולמטב את הגדרות אופטיות של fluorimeter כדי להשיג יחס אות לרעש טוב.
3. בצע טיטרציה pH על ידי הוספת כמויות קטנות של 0.1 NaOH N ונ 'HCl 0.1 לאחר כל תוספת לנער את קובטלערבוב, חכה 1 דקות לאיזון ולמדוד את רמת החומציות באמצעות microelectrode-pH. ספקטרום פליטה של ​​והעמסת וTMR צריך להיות מוקלט על כל צעד ללא כל שינוי בהגדרות אופטיות.
4. מגרש את עוצמת הקרינה לעומת pH לטיטרציה. אות rhodamine צריכה להיות מושפעת מרמת חומציות (<10%). האות והעמסת צריכה להיות עקומת sigmoidal וצריכה להיות מצוידת עם מודל יחיד מחייב עם pK = 6.4.

3. תא תרבות וElectroporation

1. טפח את תאי הלה במדיום שונה Dulbecco הנשר (DMEM) בתוספת 10% בסרום שור העובר ו100 פניצילין U / ml, ו100 מ"ג / מיליליטר סטרפטומיצין (Invitrogen). שמור על תרבות תאים על 37 מעלות צלזיוס באווירת humidified 5% CO _2.
2. עבור electroporation dendrimer, כאשר תאי מחוברות, הסר את המדיה ולשטוף תאים באמצעות DPBS (פוספט שנאגר מלוח של Dulbecco). הסר את DPBS ולהוסיף טריפסין-EDTA. לנטרל את Trypלחטוא על ידי הוספת סרום בינוני המכיל אך לא אנטיביוטיקה. צנטריפוגה ב900-1,200 סל"ד במשך 2 דקות בטמפרטורת חדר. הסר את המדיה ולשטוף את כדורים באמצעות DPBS.
3. ספירת התאים ולקחת 4 * 10 ⁶ תאים. צנטריפוגה ב1,200-1,500 סל"ד במשך 2 דקות בטמפרטורת חדר.
4. Resuspend התא גלולה ב μl 200 של חיץ microporation (המסופק על ידי יצרן microporator) ולהעביר את תאים לצינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר.
5. הוספת תמיסה מימית dendrimer לתוך תאים מושעים. כמות dendrimer נדרש לדגימה היא תלויה בסוג Pamam (בדרך כלל 250 ננומטר עבור קטיוני ו2 מיקרומטר לdendrimers הניטרלי).
6. הוסף חוצץ electroporation (המסופק על ידי יצרן microporator) בצינור microporation. פיפטה את התאים וdendrimers תערובות עם קצה electroporation של 100 μl בגודל נפח. הכנס את פיפטה microporator לתחנת פיפטה. הגדר את המצב הדופק לmicroporation: מתח דופק = 1,005 V; wid דופקה = 35 אלפיות שנייה; דופק מספר = 2.
7. אחרי תאי העברת דופק לצינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר ו צנטריפוגות תאים 5 דקות ב1,200 סל"ד כדי להסיר את עודף dendrimer במדיום. צלחת 10 μl של תאי electroporated על גבי זכוכית תחתונה מנות 35 מ"מ (GWSt-3522 WILLCO צלחת) עם מדיום חדש w / o אנטיביוטיקה.

4. חישה pH בתאים חי הלה

1. תאי תמונה עם מיקרוסקופ 12 שעה confocal לאחר electroporation.
2. ניתן להשתמש בו להגדיר מסנן סטנדרטי ולהעמסה וrhodamine. אם מסננים מתכונן הם סט זמין ערוץ ירוק 500-550 ננומטר ומסלול אדום מ580 ננומטר ל650 ננומטר. עירור ב 488nm הוא אופטימלי להעמסה תוך rhodamine יכולה להיות צילמה גם עם 543nm או קו הלייזר 561.
3. דגש על הדגימה ולהתאים את כוח לייזר וגלאים לזכות למקסם את יחס אות לרעש. אם electroporation היה תאים מוצלחים צריכים להיות ניאון בהיר בשני הערוצים.לוקליזציה תלוי בגודל ואחראי על dendrimer בשימוש. לעתים קרובות כמה לוקליזציה lysosomal (שלפוחית ​​perinuclear קטנה) היא הווה בשל אנדוציטוזה או מידור. רעילות ומדידה אם לוקליזציה lysosomal הוא השולט, כלומר רוב הקרינה הוא מקומי בתוך שלפוחית ​​ואות עניות הוא ציינה בcytosol, מסמן צריכה להיות מושלכת. לרכוש ברצף שני ערוצים, אם יש צורך כמה תמונות לרכוש וממוצע התמונות כדי לשפר את איכות תמונה.
4. לחומציות תא מהדק כיול באמצעות מאגרים עם יונופורים ב-pH שונה ולרכוש לפחות 20 תאים לכל pH כפי שתוארה לעיל. לתיאור מפורט של ההליך ואת ההרכב של המאגרים עיינו Bizzarri ועמיתים לעבודה. ¹⁶ אנו מציעים למדוד לפחות 5 נקודות מpH = 5.5 ל-pH = 7.5. pH מתחת ל -6 הם רעילים לתאים, אך נסבל לזמן קצר, אנו ממליצים לרכוש את התמונות מהר ככל האפשר. אם תאיםמראה סימנים של אפופטוזיס, לבטל את התאים ולהפעיל מחדש.
5. השתמש ImageJ או תוכנה מקבילה לניתוח נתונים. ייבא את התמונות של הערוץ הירוק ואדום, לחסר רקע וליצור פיקסל על ידי הדמיה יחס פיקסל עם האפשרות "מחשבון תמונה".
6. צייר אזור של עניין (ROI) בחירת התא הרצוי ולמדוד את היחס הירוק לאדום תוך תאיים. לנתח את כל התמונות שנרכשו ולאחר מכן לתכנן את היחס מול ה-pH. בטווח 5.5-7.5 המגמה צריכה להיות ליניארי. נכון ליניארי של הנקודות שהושגו ייתן את עקומת הכיול שישמש להמרת יחס ירוק לאדום לחומציות.
7. כבקרה נוספת לרכוש כמה תאים שלא טופלו (אין יונופורים) ומנסה לחשב pH עם עקומת הכיול שהושגה. יש לקבל ערך בין 7.2 ו7.4.

5. בVivo לדוגמא הכנה

1. ניסויים בוצעו על C57BL/6J (זכרים ונקבות) בין ד לאחר הלידהאיי 28 ו70. הרדים את העכבר עם זריקת intraperitoneal של Urethane (כלומר אתיל carbamate) (20% w / v בתמיסת מלח פיסיולוגי, 20 מ"ג / urethane ק"ג). בעלי חיים הוקרבו לאחר ניסוי עם מנת יתר של urethane ואחרי הזרקת intracardiac מאותו חומר ההרדמה.
2. לבצע זריקה תוך שרירית של נתרן זרחה dexamethasone (2 מ"ג / קילוגרם משקל גוף) כדי להפחית את תגובת לחץ בקליפת המוח ובצקת מוחית במהלך הניתוח.
3. לגלח את ראשו של בעל החיים ולהחיל 2.5% ג'ל לידוקאין לקרקפת.
4. השתמש במספריים כדי לחתוך את קפל עור המכסה את הגולגולת של שני ההמיספרות
5. שטוף את העצם החשוף עם מי מלח ובעדינות להסיר את קרום העצם באמצעות מלקחיים. זה יספק בסיס טוב יותר לדבק ומלט שיניים לדבוק בו.
6. החל הודעה ראש פלדת מחוייט עם חדר הדמיה מרכזי ולהדביק אותו עם cyanoacrylate במטוס כ מקביל עם הגולגולת מעל האזור בקליפת המוח של interest ולתקן אותה במקום עם מלט לבן שיניים (Paladur).
7. לתקן את הראש של העכבר על מנת לבצע את פתיחת גולגולת של 2-3 מ"מ בקוטר קדח מעל האזור של עניין.
8. נסה למזער את החימום של קליפת המוח במהלך ניתוח, דמעות dural, או דימום.
9. שמור את הקליפה superfused עם ACSF סטרילי (126 mM NaCl, 3 מ"מ KCl, 1.2 מ"מ KH ₂ PO _4, 1.3 מ"מ MgSO _4, 26 מ"מ NaHCO _3, 2.4 מ"מ CaCl _2, 15 גלוקוז מ"מ, 1.2 HEPES מ"מ במזוקק H ₂ O , PH = 7.4).

6. ההדמיה pH במוח העכבר

1. במהלך הנשימה Animal Aid ניסוי מתן O אוויר _{מועשר-2.} חמצן מועשר עד 80%. O ₂ לחץ וזרימה חלקיים לעתים קרובות מותאם לקבלת סיוע נשימה נכונה. שמור על טמפרטורה קבועה בגוף על 37 מעלות צלזיוס בשמיכת חימום משוב מבוקרת.
2. תקן את בעלי החיים באמצעות דואר הפלדה תחת המטרה של שתי תמונותהתקנת ההדמיה n.
3. כדי להזריק את החיישן בקליפת המוח לטעון פיפטה זכוכית המכילה אלקטרודה AgCl (קוטר קצה 4 מ"מ) עם פתרון dendrimer (1 מיקרומטר). האלקטרודה תאפשר להקליט פוטנציאלים בתחום תאיים.
4. עם התקנת microinjection להכניס את פיפטה בקליפת המוח בכ 150 עומק מיקרומטר. הזרק ל1-2 דקות בלחץ של 0.5 psi.
5. לייעל את ההתקנה האופטית להדמיה. כוח הלייזר צריך להיות מותאם כדי למזער photobleaching וניזקים. בדרך כלל כוח הלייזר המועסק הוא בסביבות 20 mW ורווח PMT נשמרו קבועים ב667 V מאז הכיולים הקודמים הראו כי מתח זה נותן יחס S / N הטוב ביותר.
6. הדמיה להלהיב את החיישן ב820 ננומטר ולזהות בו זמנית והעמסת וקרינת rhodamine דרך מסנני FITC וTRITC סטנדרטיים.
7. לזמן מדידות נפתרו סדרת זמן לשגות לרכוש ב2 הרץ.
8. לתיקון רקע לרכוש מסגרת כהה עם laseתריס r סגור כדי למדוד את הרעש התרמי הממוצע הנובע בPMTs והכן מתווסף בדרך כלל על ידי האלקטרוניקה.
9. לניתוח נתונים לבצע את אותו ההליך שדווח בסעיף 4.

תוצאות

איור 1 מציג ייצוג סכמטי של נטיה של חישת צבעים לפיגומים הדנדריטים שונים. ניתן להשיג אינדיקטורים וכתוצאה מכך צעד סינטטי קל אחד ממוצרים זמינים מסחרי. dendrimers אמין נושאות הם הגיבו בצבעים הופעלו-NHS בDMSO ומטוהר על ידי דיאליזה. נוהל כללי זו כבר שימש בהצלחה עבור תיוג של ...

Discussion

השלבים הקריטיים עבור הדמיה pH מוצלחת עם חיישנים מבוססי dendrimer הם: א) הבחירה של פיגום הדנדריטים הנכון ומספר אינדיקטורים מצומדת אליו וii) אופטימיזציה של פרוטוקול מסירה חיישן בתאים או בגוף חי.

ההליך הסינתטי הוא קל למדי וניתן ליישם ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PAMAM G4	Sigma-Aldrich	412449
Carboxyfluorescein NHS ester	Life technologies	C-1311
TMR NHS ester	Life technologies	C-1171
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
Dyalsis bags	Spectrum Labs	132117
WillCo Dishes	WillCo Wells	GWSt-3512
Urethane	Sigma-Aldrich	U2500