CometChip: תפוקה גבוהה 96-ובכן פלטפורמה למדידת נזק לדנ"א בתאי Microarrayed אדם

Summary

אנו מתארים כאן פלטפורמה שמאפשרת זיהוי assay שביט של נזק לדנ"א עם תפוקה חסרת תקדים. דפוסי מכשיר תאי יונקים לmicroarray ומאפשר עיבוד מקביל של 96 דגימות. הגישה מאפשרת ניתוח של קינטיקה הנזק לדנ"א רמת בסיס, נזק לדנ"א הנגרם על ידי חשיפה ותיקון DNA.

Abstract

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular metabolites. Ironically, at high doses DNA damaging agents are also used to treat cancer. The ability to quantify DNA damage responses is thus critical in the public health, pharmaceutical and clinical domains. Here, we describe a novel platform that exploits microfabrication techniques to pattern cells in a fixed microarray. The ‘CometChip’ is based upon the well-established single cell gel electrophoresis assay (a.k.a. the comet assay), which estimates the level of DNA damage by evaluating the extent of DNA migration through a matrix in an electrical field. The type of damage measured by this assay includes abasic sites, crosslinks, and strand breaks. Instead of being randomly dispersed in agarose in the traditional assay, cells are captured into an agarose microwell array by gravity. The platform also expands from the size of a standard microscope slide to a 96-well format, enabling parallel processing. Here we describe the protocols of using the chip to evaluate DNA damage caused by known genotoxic agents and the cellular repair response followed after exposure. Through the integration of biological and engineering principles, this method potentiates robust and sensitive measurements of DNA damage in human cells and provides the necessary throughput for genotoxicity testing, drug development, epidemiological studies and clinical assays.

Introduction

ג'ל אלקטרופורזה תא הבודד assay (SCGE) (aka assay השביט) היא טכניקה המשמשת באופן נרחב לכימות של קשת רחבה של נגעי DNA, כוללים נגעי בסיס, אתרי abasic, הפסקות גדיל בודדות, הפסקות כפולות גדיל, crosslinks ואלקלי רגיש אתרים. העיקרון הבסיסי של assay הוא שDNA שניזוק נודד בקלות רבה יותר מאשר DNA ניזוק בשל התנפצות ואובדן מבנה superhelical. הגירת המידה פרופורציונלית לכמות של נזק לדנ"א, ויכולה להיות דמיין באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. לכידת תמונה וניתוח פרופיל עוצמה של DNA בצורת כוכב שביט הבודד לאחר מכן לספק מדידות פרמטר כגון אורך זנב, רגע זנב, וDNA% בזנב כדי לחשוף את הרמה של נזק לדנ"א בתאים ^1-4.

כרגע יש שתי גרסאות נפוצות של assay השביט:) assay שביט אלקליין ו ב) assay שביט ניטראלי. Assay שביט אלקליין הוא נרחב ביותרגרסה משומשת, אשר עושה שימוש במאגר pH גבוה להירגע DNA לפני אלקטרופורזה וכך מזהה את כל הסוגים של הפסקות גדיל ואתרי אלקלי רגישים. Assay השביט הניטרלי, לעומת זאת, הוא פחות מיומן משום שהיא משתמשת חיץ ניטראלי כדי לשמור על הסלילים כפולים ולזהות הפסקות גדיל כפולות בלבד ^2,5. עבור כימי וסוכנים פיזיים שגורמים לDSBs, SSBs נוצרים בקונצרט, ונוצרים ברמות גבוהות הרבה יותר (למשל SSBs, הנגרם על ידי γIR הם בסדר גודל נפוץ יותר מDSBs). עבור רוב החשיפות מזיקות DNA, DSBs הם הרבה פחות נפוצה מאשר סוגים אחרים של נזק לדנ"א, ולכן הם קשים יותר לאתר. אנחנו הוכחנו בפרסומים קודמים חלון זיהוי של שני הגרסאות. ^6,7

למרות assay השביט כבר משמש באופן שגרתי למחקר בסיסי על נזק לדנ"א ובדיקת התיקון וgenotoxicity ^1,2,8-15, assay כבר דיווח על שחזור ירוד עקב מדגם-ל-מדגם, אדם אל האדם והשתנות מעבדה למעבדה. בנוסף, assay הוא תפוקה נמוכה, בין שאר משום שרכישת תמונה וניתוח הנתונים הם מייגע. יחד, מגבלות אלה תורמים לקבלתה הנמוכה יחסית במחקרים בקנה מידה גדולה. באמצעות שילוב של טכנולוגיות הנדסה ועקרונות, CometChip מביא פתרון לבעיות של תפוקה וחוסר עקביות הקשורים לassay השביט המסורתי ^6,7. בקצרה, כדי ליצור את השבב, עובש microfabricated באמצעות photolithography ליצור microposts בקטרים ​​קטנים כמו זה של תא בודד. העובש משמש אז כדי להחתים על agarose המותך, וכתוצאה מכך מערך של microwells לאחר מתמצק ג'ל. שבבים שמפתחת לחוקרים, בבארות משתנים בגודל תואם עם סוגי תאים שונים. כדי לטעון את השבב, תאים בתקשורת מותר להתיישב לתוך הבארות על ידי כוח הכבידה; תאים עודפים נשטפים. לאחר מכן תאים לכודים הכמוסיםing שכבה דקה של agarose נקודת התכה הנמוך, וצלחת גם ללא תחתית 96 לאחר מכן הידקה אל פני השטח ג'ל ליצור 96 macrowells, כל אחד עם מאות microwells על המשטח התחתון שלה.

פרוטוקול זה מתאר את הצעדים הכלליים לניסויים עם שבב זה, הכוללים הכנת ג'ל, טעינה סלולארי, מינון ותיקון, תמוגה תא, אלקטרופורזה, ודימות פלואורסצנטי. אנו מדגימים שני דוגמאות לניסויי תגובת מנה עם תאי lymphoblast נחשפו סוכנים מזיקים DNA הידוע, באמצעות בסיסי וגרסאות ניטרליות של assay בהתאמה. שני ניסויי תיקון מוצגים גם לתאר איך תגובת תיקון לאחר חשיפה ניתן להעריך באמצעות מערכת.

Protocol

.1 הכנת צ'יפ

1. הסר ג'ל שבב מהחבילה והמקום לצד סרט אחד היטב צלחת מלבנית, ג'ל למטה.
2. לשטוף ג'ל ב25 מ"ל 1x PBS במשך 15 דקות, לחזור על שתי פעמים.
3. ג'ל להגדיר על צלחת זכוכית וכיוון תווית של ג'ל בהתאם.
4. לחץ בעדינות על צלחת 96 היטב ללא תחתית הפוכה על ג'ל; לוודא שכל הבארות של הצלחת גם ללא תחתית נמצאות בשטח של ג'ל.
5. השתמש 1.5 'קליפים קלסר' בכל צד של הצלחת כדי להבטיח הידוק עם הזכוכית.
6. לשאוב את PBS העודף חיץ בכל טוב.

2 תאים טוען

1. הכן השעיות תא:
   1. לשורות תאי השעיה, לדלל השעיה תא בתקשורת כדי להשיג ריכוז סופי של 10 ⁵ -10 ⁶ תאים / מ"ל.
   2. לשורות תאים חסיד, בצע את מתנתק / פרוטוקולי trypsinization נורמלים ודilute תאים מנותקים בתקשורת לריכוז סופי של 10 ⁵ -10 ⁶ תאים / מ"ל. אם תאים לצבור, עובר השעיה תא במסנן תא לקבל השעיה תא בודדת.
2. הוספה של השעיה תא 100 μl היטב בכל הצלחת 96 היטב.
3. צלחת כיסוי עם סרט ג'ל על מנת למנוע אידוי של תקשורת.
4. לאפשר לתאים לטעון לפחות 30 דקות ב37 ° C חממה.
5. הסר שבב מתקשורת חממה ולשאוב מכל טוב.
6. הסר מהדקים ו96 גם צלחת תחתית; להחזיק את השבב עם צלחת הזכוכית בזווית ובעדינות לשטוף עם PBS 1x כדי להסיר תאים עודפים על agarose.
7. בדוק טעינת תא באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר עם עדשה אובייקטיבית 4X. אם טעינה מספיקה הוא ציין, לחזור מצעד 2.1.
8. מניחים שבב הועמס על אף פני השטח (ספסל מעבדה). שבב שכבה עם 1% agarose נמוך נקודת התכה (LMP) שהוא מראש חימם על 37 מעלות צלזיוס. השתמש כ 2̵1; 3 מ"ל של agarose LMP נחוץ לכל שבב.
9. לאפשר כיסוי לביסוס ראשון ב RT במשך 3 דקות ולאחר מכן לעבור ל4 מקרר מעלות צלזיוס למשך 5 דקות לgelation מלאה.

.3 מינון ותיקון

הערה: כדי ללמוד ברמת נזק לדנ"א בסיסית, דלג לשלב 4.

1. בזהירות ליישר את הבארות של השבב (שנוצר מההידוק קודם) עם הבארות של צלחת 96, גם ללא תחתית חדשה. Re-עיתונות 96 גם הצלחת תחתית בהידוק עליון ומאובטח עם קליפים קלסר.
2. הוספה של כימי של מינון רצוי 100 μl היטב בכל הצלחת 96 היטב; לבצע מינון / טיפול בקרח או במקרר 4 ° C לכמות רצויה של זמן.
3. לאחר מינון, כימיקלים לשאוב מכל טוב ולשטוף משם כימי שיורית באמצעות 1x PBS. אם נזק ישיר הוא למד כאן, המשך לשלב 4.
4. ללמוד קינטיקה תיקון, לאפשר לתאים בשבב לתקן בתקשורת ב37 C °. Lyse (המשך לשלב 4) בנקודות זמן ספציפיות.
   הערה: תיקון יכול להתבצע על שבב עם 96 גם צלחת תחתית המצורפת, או השבב ניתן לחתוך לחתיכות נפרדות לאחר הסרת צלחת 96 היטב ללא תחתית.

.4 תמוגה

1. כדי לבצע assay שביט אלקליין:
   1. להפוך את העבודה מאגר תמוגה אלקליין על ידי הוספת 1% Triton X-100 אלקליין פתרון מניות תמוגה (2.5 M NaCl, 100 מ"מ Na ₂ EDTA, 10 מ"מ טריס, pH 10). הכן כ 25 מ"ל של עבודה חיץ תמוגה לכל שבב.
   2. טרום צמרמורת עובדת מאגר תמוגה אלקליין על 4 מעלות צלזיוס.
   3. לצלול שבב במאגר תמוגה מגניב עובד בסיסי ולאפשר תמוגה לבצע O / N במקרר 4 ° C.
2. כדי לבצע assay שביט ניטראלי:
   1. להפוך את העבודה מאגר תמוגה ניטראלית על ידי הוספת 1% Triton X-100 ו10% DMSO לפתרון מניות תמוגה ניטראלי (2.5 M NaCl, 100 מ"מ Na ₂ EDTA, 10מ"מ טריס, 1% N -Lauroylsarcosine, pH 9.5). הכן כ 25 מ"ל עובד מאגר תמוגה לכל שבב.
   2. טרום חם עובד מאגר תמוגה ניטראלי ב43 ° C.
   3. לצלול שבב במאגר תמוגה חם עובד ניטראלי ולאפשר תמוגה לבצע O / N ב43 ° C חממה.

.5 אלקטרופורזה

1. כדי לבצע assay שביט אלקליין:
   1. הסר מאגר תמוגה ובמהירות לשטוף שבב עם 1x PBS.
   2. שבב מאובטח בתא אלקטרופורזה עם צד סרט ג'ל פונה כלפי מטה באמצעות קלטת דו צדדית.
   3. להביא את החדר לחדר קר 4 מעלות צלזיוס.
   4. למלא את התא עם חיץ אלקליין הקר אלקטרופורזה (0.3 M NaOH, 1 מ"מ Na ₂ EDTA) לרמה שפשוט מכסה את הג'ל.
   5. לאפשר להתרה בסיסית ל40 דקות.
   6. הפעל אלקטרופורזה ב1 V / cm ו300 mA ל30 דקות בחדר הקר. כוון את עוצמת הקול של חיץ אלקטרופורזה בצ'הmber להשיג רצוי נוכחי פועל.
2. כדי לבצע assay שביט ניטראלי:
   1. הסר מאגר תמוגה ולשטוף שבב עם חיץ אלקטרופורזה הניטרלית (2 מ"מ Na ₂ EDTA, 90 מ"מ טריס, חומצה בור 90 מ"מ, pH 8.5) עבור 2 x 15 דקות ב 4 ° C..
   2. שבב מאובטח בתא אלקטרופורזה עם צד סרט ג'ל פונה כלפי מטה באמצעות קלטת דו צדדית.
   3. להביא את החדר לחדר קר 4 מעלות צלזיוס.
   4. למלא את התא עם חיץ אלקטרופורזה ניטראלי קר (2 מ"מ Na ₂ EDTA, 90 מ"מ טריס, חומצה בור 90 מ"מ, pH 8.5) לרמה שפשוט מכסה את הג'ל.
   5. לאפשר ג'ל לשבת בחדר קר ל60 דקות.
   6. הפעל אלקטרופורזה ב0.6 V / cm ו -6 mA ל60 דקות בחדר הקר. כוון את עוצמת הקול של חיץ אלקטרופורזה בתא כדי להשיג נוכחי ריצה רצויה.

.6 הדמיה פלורסנט

1. הסר שבב מתא אלקטרופורזה מcolחדר ד.
2. לנטרל את ג'לי במאגר נטרול (0.4 M טריס, pH 7.5) עבור 2 x 15 דקות במקרר 4 ° C.
3. כתם השבב עם כתם DNA ניאון של בחירה (כלומר, זהב SYBR, Ethidium ברומיד) תחת מפעל מומלץ נהלים. תמונה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

ניתוח .7 הנתונים

לנתח תמונות כוכב שביט על ידי תוכנת assay שביט סטנדרטית כגון קומט 5.5.

תוצאות

בדוגמא ראשונה זו, אנו מתארים את הגישה לכימות רמות ראשוניות של נזק לדנ"א בתאי lymphoblastoid אדם לאחר חשיפה לנזק חמצוני באמצעות H ₂ O _2. על מנת להעריך ₂ O ₂ -induced נגעי בסיס H והפסקות גדיל בודדות, תנאי שביט אלקליין משמשים. לאחר הטעינה הושלמה ותאים כבר במארז עם שכבת agarose, 96 גם צלחת תחתית נלחץ על פני השטח כדי ליצור 96-תאים על השבב. כל אחד מ96-הבארות ניתן במינון עם סוג או ריכוז של כימיקלים שונים. הנה ארבעה מינונים שונים של H ₂ O ₂ שמשו ו1x PBS שימש כביקורת השלילית. נציג תמונות של כוכבי שביט ערוכים מוצגות באיור 1 א, שבו לא טופל (למעלה), 50 מיקרומטר (באמצע) ו100 מיקרומטר H (תחתון) ₂ O ₂ -exposed דגימות הפגינו רמות של זנבות שביט שונות. ניתוח של תמונות שביט ניתן perforתרופה באמצעות תוכנה זמינה באופן מסחרי, אשר בדרך כלל מכמתת את רמות נזק המבוסס על מרחק עוצמת הקרינה והגירה הכולל של כל זנב שביט. מדידות מבוצעות בדרך כלל על 50 עד 100 שביטים למצב והערך החציוני (בין% DNA זנב או אורך זנב) מחושבת. איור 1 מדגימה את עקומת תגובת DNA זנב אחוז מנותחת משביטי תא lymphoblastoid TK6 נחשפו לארבעה ריכוזים שונים של H ₂ O _2. העקביות בין ניסויים עצמאיים מדגימה את יעילותה של גישה זו בהערכת תגובת נזק לדנ"א מרמות השונות של טיפולים כימיים בתאים.

כדי ללמוד על הבדלים בין דגימות (למשל, בין macrowells) ובין חזרות של אותו הניסוי, בין מדגם ושונה בין ניסוי היה להתוות באיור 2 א ו -2 בהתאמה. בתוך כל ניסוי, גם כל 96-wשבב ell הוא שווה ערך למדגם שונה ומכאן הווריאציה להיטב היטב מגלה וריאציה בין המדגם של המכשיר. כאן, תאי TK6 נטענים ב12 בארות של שבב 96, גם טופלו במינון זהה של H ₂ O ₂ ו lysed מייד לאחר טיפול. כל הצעדים הניסיוניים האחרים בוצעו במקביל והחציונים של לפחות 50 שביטים מכל macrowell היו זממו באיור 2 א. ממוצע החציונים הוא DNA 77.53% בזנב, עם סטיית תקן היא 3.99%. מתוך נתונים אלה, אנו לחשב שמקדמים שונים בין דגימות הוא 5.2%, שהוא פי כמה וכמה נמוך מassay המסורתי, הממחיש את החוסן המשופר של assay זה ^6,16. כדי ללמוד על שחזור של assay, אנו נחשפים תאי TK6 בשבב עם 75 מיקרומטר H ₂ O ₂ ולנתח את הרמה המיידית של נזק לדנ"א. ניסוי זה חזר על עצמו שש פעמים ונתונים של כל ניסוי היו להתוות בFigure 2B. תחת תנאי ניסוי זהים, השגנו תוצאות הנעות בין 41.76% ל57.87%, כפי שמוצג פסים אפורים בדמות. הממוצע של שש חזרות הוא 49.57%, עם סטיית תקן של הממוצע רק 2.04%. הווריאציה הנמוכה בקרב חוזרים מרמזת כי assay השביט מבוצע במכשיר הרומן הזה הוא מאוד לשחזור.

כדי להעריך קינטיקה תיקון, תאים מותרים כדי לתקן את הדנ"א שלהם בתקשורת טרי לאחר טיפול. Lysing macrowells בנקודות זמן שונים חושף את השינוי בנזק לדנ"א לאורך זמן. דוגמא מוצגת באיור 3. בניסוי זה, תאי TK6 היו ארוזים ראשון בשבב, שטופלו ב50 מיקרומטר H ₂ O _2, ואפשרו לתקן עד 60 דקות לאחר חשיפה. תאים היו lysed ב 0, 20, 45 ו60 דקות בהתאמה. תמונות שביט נציג בנקודות זמן שונות מוצגות באיור 3 א, והשינוי ברמות הנזק לדנ"א לאורך הזמן הוא להתוות בתרשים3B. הנתונים אלה עולים כי כמעט כל הנזק יתוקן בתוך ההודעה H 45 דקות ₂ O ₂ טיפול. משתנים רב יכולים להשפיע על השער של תיקון, כולל הסוג של שורת תאים וסוכן כימי המשמש. מכאן חוקרים יכולים לבצע שינויים בפרוטוקול (כלומר, הארכת תיקון זמן) כדי להתאים לצרכימים נוספים בחקירותיהם. כאן אנו מספקים הוא דוגמא נוספת לניסוי תיקון באמצעות שבב זה, שבו תאי TK6 מאותגרים עם סוכן genotoxic שונה N -Methyl- 'N -Nitro- N -Nitrosoguanidine (MNNG) סוכן אלקילציה הידוע כדי לגרום לנגעי בסיס כולל 7-methylguanine ו3-methyladenine. הם נגעים אלה יומרו לabasic אתרים או על ידי depurination הספונטני או על ידי ההסרה האנזימטית על ידי glycosylases DNA. אתר abasic וכתוצאה מכך ניתן ביקע בתנאים בסיסיים ובכך זוהה על השבב. חשיפה ראשונית גורמת לעלייה משמעותית בנזק, עולה מהארוךזנבות, ועם זמן זנבות אלה צומצמו התאים לשחזר DNA ללא פגע במהלך תיקון. למרות אלקילציה ונזק חמצוני שניהם תוקנו בעיקר על ידי מסלול תיקון כריתת בסיס, הסכום של נגעים שנוצרו והחלבונים מעורבים בתיקון להשתנות. וריאציות אלו יכולות להוביל לשיעורים שונים של המרה לabasic אתרים, כמו גם שיעורים שונים של תיקון של אתרי abasic וכתוצאה מכך. באיור 4, קינטיקה התיקון של תאי TK6 נחשפה ל0.1, 1, ו -3 מיקרוגרם / מ"ל של MNNG מוצג. בניסוי זה, הרחבנו את זמן ניסוי שללאחר חשיפה 2 שעות, כי נזק הנגרם על ידי MNNG מופיע להתמיד זמן רב יותר ואינו מסומנת בקצב איטי יותר בהשוואה לH ₂ O ₂ -induced נזק.

ניתוח של DSBs באמצעות תנאים ניטרליים דומה מאוד לפרוטוקול לניתוח של נגעים בודדים גדיל באמצעות התנאים בסיסיים. כדי להציג את רמות נזק ראשוניות, תאי TK6 נחשפו לרמות משתנה של Gir, והתאים וכתוצאה מכך lysed וelectrophoresed בpH ניטראלי (איור 5A). ראוי לציין כי את המורפולוגיה של זנבות השביט היא שונה מתנאי assay אלקליין. כדי להשיג DNA המקוטע הנצפה באמצעות assay זה, מינון IR המשמש הוא גבוה באופן משמעותי (0-100 Gy) מאשר המינון הדרוש כדי לראות נזק באמצעות התנאים בסיסיים. בנוסף, מצאנו כי אורך הזנב הוא הפרמטר הכי רגיש הבמשקף את מידת הנזק לדנ"א בעת שימוש assay השביט הניטרלי ^7. עקומת תגובת המנה ניתחה מתוארת באיור 5 ב. תיקון של הפסקות גדיל כפול DNA בתאים גם ניתן להעריך, והוכח על ידי Weingeist et. אל. ^7. יחדיו, CometChip הניטרלי מציע כלי רב ערך עבור ניתוח תפוקה גבוהה של DNA DSBs.

"Width =" 1highres.jpg 500 "/>
איור 1. H ₂ O ₂ במינון תגובה של תאי TK6 באמצעות assay שביט אלקליין. () שביטים microwell ערוכים מlymphoblasts שלא טופל TK6 (למעלה) ותאי TK6 נחשף ל50 מיקרומטר (באמצע) ו100 מיקרומטר H (התחתון) ₂ O ₂ עבור 20 דקות ב 4 ° C.. סרגל קנה מידה הוא 100 מיקרומטר. H (B) ₂ O ₂ תגובת מינון של תאי TK6 נחשפו לרמה השונות של H ₂ O _2. כל נקודת נתונים היא הממוצעת של שלושה ניסויים בלתי תלויים, שבו DNA זנב אחוז החציוני של לפחות 50 שביטים בודדים הושג בכל ניסוי. ברים שגיאה מייצגים את שגיאת התקן של הממוצע משלושה ניסויים בלתי תלויים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2. Inter-Sample והשתנות. וריאציה Inter-ניסויי () לדוגמא ל-Sample. תאי lymphoblast אנושיים TK6 הועמסו 12 בארות של שבב 96 היטב. כל טוב נחשף לשל H 50 מיקרומטר 100 μl ₂ O ₂ עבור 20 דקות ב 4 ° C.. תא היה lysed באופן מיידי וassayed עבור DNA% זנב. הנתונים של כל אחד גם מוצגים כאן. כל אחת מהתיבות מייצגים את החציון לפחות 50 שביטים בודדים מכל טוב. הממוצע של 12 בארות הוא 77.53%, סטיית התקן היא 3.99%, ומקדם שונים מחושב להיות 5.2%. וריאציה (ב ') ניסוי לניסוי. תאי lymphoblast אנושיים TK6 הועמסו שבב 96 היטב, חשופים ל75 מיקרומטר H ₂ O ₂ 100 μl ל20 דקות ב 4 ° C. תא היה lysed באופן מיידי וassayed עבור DNA% זנב.אותו הניסוי חזר על עצמו 6 פעמים ונתונים של כל חוזר מוצגים כפס אפור. כל אחת מהתיבות מייצג את DNA% הזנב החציוני של לפחות 100 שביטים בודדים מכל חוזר. הממוצע של 6 חזרות הוא 49.57%, כפי שמוצג בגב בר כאן. סטיית התקן של 6 חזרות היא 4.99%, ושגיאת התקן של הממוצע מחושבת להיות 2.04%, מיוצגת כבר שגיאה בדמות.

איור 3. תיקון של H ₂ O ₂ נזק -induced בlymphoblasts TK6. () סכמטי של מחקר תיקון עם שביטים נציג. מטופלים תאי TK6 עם סוכנים מזיקים ואפשרו לתקן בתקשורת על 37 מעלות צלזיוס לפני תמוגה. (ב) קינטיקה תיקון של תאי TK6 לאחר טיפול ב50 מיקרומטר H ₂ O ₂ ל20 דקות ב 4 & #176; C. כל נקודת נתונים היא הממוצעת של שלושה ניסויים בלתי תלויים, שבו DNA זנב אחוז החציוני של לפחות 50 שביטים בודדים הושג בכל ניסוי. ברים שגיאה מייצגים את שגיאת התקן של הממוצע מניסויים חוזרים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4. תיקון של נזק הנגרם על ידי MNNG בlymphoblasts TK6. מטופלים תאי TK6 עם 0.1, 1, ו -3 מיקרוגרם / מ"ל MNNG ל30 דקות ב 4 ° C ואפשרו לתקן בתקשורת על 37 מעלות צלזיוס עד 120 הודעה דקות חשיפה. DNA זנב אחוז החציוני של לפחות 50 שביטים בודדים הושג עבור כל אחד משלושה ניסויים בלתי תלויים. ברים שגיאה מייצגים את שגיאת התקןשל הממוצע משלושה ניסויים בלתי תלויים.

איור 5. תגובת מינון IR של תאי TK6 באמצעות assay שביט ניטראלי. () ערוכות שביטים microwell מlymphoblasts שלא טופל TK6 (למעלה) ותאי TK6 נחשף ל40 Gy (באמצע) ו80 Gy (למטה) קרינת גמא. סרגל קנה מידה הוא 100 מיקרומטר. תגובת מינון IR (B) של תאי TK6 נחשפו לרמה השונות של קרינת גמא. כל נקודת נתונים מייצגת את אורכו הממוצע זנב (מיקרומטר) של לפחות 300 שביטים ונקוו משש macrowells על השבב. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

genotoxins בכל מקום בסביבה וגם בתוך תאים אנושיים מפעיל עומס ונזק לדנ"א הסלולרי בלתי נמנעים. למעשה, ההערכה היא שיש 1000 של נגעי DNA קיימים בתאי אדם במצב יציב ^18. הבנת רגישות נזק וקינטיקה תיקון בבני אדם לא רק מביאה תובנה למחקר בסיסי, אבל גם יתרונות לפיתוח תרופות. באופן אירוני, למרות היכולת של נזק לדנ"א כדי לקדם את הסרטן, סוכנים מזיקים DNA משמשים ברמות גבוהות מאוד לטיפול בסרטן, מה שהופך את הידע על נזק לדנ"א ותיקון רלוונטי לרפואה מותאמת אישית. CometChip הוא מכשיר מחקר חדשני שמנצל שיטות microfabrication לחולל מהפכה assay נזק לדנ"א ארוך היה קיים. בנייה על אותם העקרונות של assay השביט המסורתי, השבב מספק תפוקה גבוהה יותר באופן משמעותי ושחזור טוב יותר. אנו מתארים כאן שיטות לשימוש בשבב הזה. כדי להבהיר את השירות ואת החוסן שלה, אנו מציגים תוצאות הלוך ושובמ 'מספר ניסויים שבהם השבב נעשה שימוש כדי להעריך נזק הנגרם על ידי מספר סוכנים המזיקים DNA שונה, ובו נעשה שימוש כדי להעריך תיקון DNA. יחד, תוצאות שהוצגו כאן מספקות מידע מועיל לשימוש בשבב ולהפגין התחולה הרחבה שלה למחקר על נזק לדנ"א ותיקון.

אחד הצעדים החשובים ביותר בפרוטוקול זה הוא להשיג טעינת תא יעילה. שורות תאים רבות נבדקו במערכת זו, ובכלל זה גם השעיה ותאים חסיד. טעינת יעילות תלויה במשתנים רבים כגון סוג תא, גודל תא, ריכוז טעינה וזמן. שורות תאי השעיה כגון תאי lymphoblastoid הם הקלים ביותר לעבוד איתו. ריכוז של ההשעיה התא יכול להשתנות מאוקטובר ^{4 - אוקטובר 6} תאים לכל 96 היטב וטעינה בדרך כלל משלימה ב15-30 דקות. צפיפות תאים גבוהה יותר מאפשרת טעינה ומקצרת את משך הזמן הנדרש לתאים להתיישב לתוך microwells.

פרמטרים טוען לתאים חסיד יכולים להיות שונים מתאי השעיה. שורות תאים כגון סינית אוגרים השחלות (CHO) תאים, נמצאו כבעלי יעילות טעינה דומה לתאי השעיה (trypsinization הבא) ובכך להשתמש בתנאי טעינה דומים. סוגי תאים אחרים, כגון תאים סרטניים בקלות ליצור אגרגטים תא בהשעיה, דורשים טיפול נוסף. עובר השעיות תא דרך מסנן תא בודד והוספת טריפסין לתקשורת ההשעיה יכולה לדכא ההיווצרות של צבירי תאים במהלך טעינה. לבסוף, במונחים של זמן טעינה, הזמן הנדרש עבור לכידת שורות תאים חסיד בmicrowells יכול להשתנות מ20 דקות לשעה 1. כתוצאה מכך, מומלץ שמשתמשים לבצע ניסויי פיילוט כדי לקבוע תנאי טעינה אופטימליים לפני שתמשיך לחקירות נוספות. יעילות טוען יכולה להיות דמיין תחת מיקרוסקופ שדה בהיר או באופן מדויק יותר מתגלה על ידי צביעת התאים במארז עם DAPI או DNA האחרכתמים קודם להערכה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

אחד יתרונות עיקריים של שיטה זו ושבב הוא צדדיות. ראשית, חוקרים אינם מוגבלים לריכוז תא עבודה ספציפי, כי תאים עודפים נשטפים, וmicroarray מבטיח שביט בצפיפות אחידה. שנית, microwells יכול להתבצע עם גדלים משתנים כדי להתאים סוגי תאים בגדלים שונים. בנסיבות שתאים מרובים נלכדים בmicrowell בודד, שביטים רב תא הם תוצאות מכוילות עצמיים ותשואה עקבית בהשוואה לשביטי תא בודדים ^6,7. יתרון נוסף תיבנות תאים בmicroarray הוא שכל השביטים הם אז באותו מישור המוקד עם עמדות קבועות, הפחתת רעש בשל שביטים לא ממוקדים ולהקל הדמיה וניתוח אוטומטיים. השיפורים המשמעותיים בתפוקה וברגישות הניתנים על ידי CometChip לאפשר היישום של assay ללימודים בקנה מידה גדולים. יחדיו, השבב מספקכלי רב ערך sa להערכת נזק לדנ"א לחוקרים, toxicologists, קלינאים ואפידמיולוגים.

בעוד assay השביט ידוע ברגישות שלה מעולה באיתור מגוון רחב של נזק לדנ"א, assay זה גם סובל מסגולי נמוך. שימוש בפרוטוקול זה משפר באופן משמעותי את שחזור ואת התפוקה של assay, אך לא להפגין התקדמות בסגולית. יחד עם זאת, ריבוב assay עם מתודולוגיות אחרות דווח כיעיל בהשגה סגוליות גבוהה יותר. דוגמא אחת היא ההכללה של אנזימי נגע ספציפי מטוהרים. אנזימים אלה יכולים להמיר נגעי בסיס אחר לגילוי להפסקות גדיל לזיהוי ואתרי abasic ^1,19-21. דוגמא נפוצה היא glycosylase endonuclease תיקון formamidopyrimidine-DNA (FPG), אשר חושף שינויי DNA חמצוני ^19,22. כי צעד עיכול האנזים מיושם לאחר תמוגה תא, המערכת יכולה להיות מטופלים באותה הדרךשקופית sa מסורתית agarose ללא שינויים לפרוטוקול. אף על פי הפרוטוקול מפורט אינו מתואר כאן, גישה זו הותאמה על ידי משתמשים רבים assay שביט מסורתיים בעבר וניתן למצוא את הפרוטוקולים בקלות. בפרסום קודם, שהשתמשנו בשיטה זו כדי לזהות נזק הנגרם על ידי אור ניאון ^22.

היתרון העיקרי של שיטה זו הוא התפוקה שהוא מספק, אשר פותחת דלתות למחקרים שהיו בעבר כמעט בלתי אפשריים. היכולת לעבד 96 דגימות על אותה הפלטפורמה לא רק מפחיתה עבודה וזמן, אלא גם מפחיתה את הרעשים ניסיוניים ומשפרת באופן משמעותי שחזור. הווריאציה מדגם Inter היא נמוכה יותר באופן משמעותי מהווריאציה המסורתית שקופית לשקופית, אשר יכול להיות גבוהה יותר 2 לקפל מאשר הווריאציה נצפתה עם השבב הזה ^6,7. רעש מופחת גם מוביל לרגישות משופרת, המאפשר זיהוי של הבדלים דקים יותר בין דגימות. הכיוון שהמכשיר מעסיק standard פורמט 96 היטב, זה תואם עם ציוד מחקר כללי וHTS טכנולוגיות. קחו למשל מחקר שדורש הערכה של 100 דגימות, בהנחה שחוקר ממוצע יכול לעבד ~ 30 שקופיות זכוכית במהלך כמה ימים. בהתחשב בכך שכל דגימה צריכה להתבצע בשלושה עותקים, זה ייקח כחודש כדי להשלים את מחקר כזה, שגם סובל באופן בלתי נמנע ממדגם לדגום וריאציה. בניגוד לכך, 100 תנאי עיבוד, כל אחד בשלושה עותקים, עם שבב זה דורש רק כמה צלחות וניתן לבצעו בשלושה ימים. שיפור משמעותי זה בתפוקה פותח את הדלת למחקרים שהיו בלתי ניתנים להשגה בעבר.

הפרוטוקול המובא כאן מתאר את שני נהלים הבסיסיים לביצוע assay השביט הסטנדרטי וצעדים שונה הנדרשים להשתמש בפלטפורמת CometChip. עם היכולת למדוד את שני רמות נזק לדנ"א טבועים ותגובה לתיקון שלאחר מכן, assay הוא רלוונטי ביותר למגוון רחב של יישומים ביולוגיים וקליניים. מידע על ההשפעה של חשיפה לחומרים כימיים מסוימות בגנום מאפשר מניעת מחלות וטיפול. יתר על כן, יש גם עניין משמעותי בקביעת שינויים ברגישות נזק לדנ"א ויכולת תיקון בקרב אנשים ^23,24. טכניקה זו מספקת את התפוקה הנדרשת ללימודים בקנה מידה גדולה כזה. ידע על וריאציות בין פרט הוא קריטי לזיהוי אנשים רגישים ולעיצוב טיפולים אישיים או אסטרטגיות סיכולים. יחדיו, הטכנולוגיה שהוצגה כאן מספקת תפוקה גבוהה, פלטפורמת ניתוח נזק לדנ"א אובייקטיבית וכמותי שיש לו את הפוטנציאל להפוך למתודולוגיה סטנדרטית בעתיד קרוב.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
UltraPure LMP Agarose (low melting point)	Invitrogen	16520	Multiple suppliers
Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS) 1x	Gibco by life technologies	14190	Multiple suppliers
Crystalline NaCl	Macron Chemicals	7581-06	Multiple suppliers
Crystalline Na2EDTA	Macron Chemicals	4931-04	Multiple suppliers, Irritant
Crystalline Tris (base)	Sigma-Aldrich	T1503	Multiple suppliers, Irritant
Crystalline Tris (acid)	J.T.Baker	4106	Multiple suppliers
Crystalline N-lauroylsarcosine	Sigma-Aldrich	L9150	Multiple suppliers, Highly toxic by inhalation, Irritant
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100	Multiple suppliers, Harmful by ingestion., Irritant
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D4540	Multiple suppliers, Combustible Liquid, Target Organ Effect
Crystalline NaOH	Macron Chemicals	7708-06	Multiple suppliers, Corrosive
Hydrochloric acid	VWR	BDH3871	Multiple suppliers, Corrosive
Crystalline boric acid	Sigma-Aldrich	B6768	Multiple suppliers, Target Organ Effect, Teratogen, Reproductive hazard
CometChip	Trevigen		Under development for distribution, contact Trevigen directly to obtain materials necessary
1-well dish	Thomas Scientific	73521-420
Bottomless 96-well plate	VWR	655000-06
1.5' binder clips	Staples		Multiple suppliers
Glass plate	Tag Hardware		Customized to size of 96-well plate
Owl Horizontal Electrophoresis System	VWR	27372-131	Multiple suppliers
PowerPac Basic Power Supply	Bio-Rad	164-5050	Multiple suppliers