האכלה של קרציות בבעלי חיים להילוכים וXenodiagnosis במחקר מחלת ליים

Summary

מחלת ליים היא המחלה וקטור הנישא ביותר המדווח בדרך כלל בצפון אמריקה. הסוכן סיבתי, Borrelia burgdorferi הוא חיידק החיידק מועבר על ידי קרציות Ixodid. הילוכים וזיהוי של זיהום במודלים של בעלי חיים מותאם על ידי השימוש בהאכלה לתקתק, שאנו מתארים כאן.

Abstract

הילוכים הסוכן האטיולוגי של מחלת ליים, Borrelia burgdorferi של, מתרחש על ידי ההתקשרות והאכלת דם של מיני קרצית קרציות על מארחים של יונקים. בטבע, פתוגן חיידקי zoonotic זה עשוי להשתמש במגוון של מארחים מאגר, אך העכבר הלבן רגל (leucopus Peromyscus) הוא המאגר העיקרי לקרציות זחל וnymphal בצפון אמריקה. בני אדם הם מארחים מקריים בתדירות הגבוהה ביותר נגועים ב ' burgdorferi ידי עקיצת קרציות בשלב nymphal. B. burgdorferi מתאים את עצמו למארחיו לאורך כל מחזור enzootic, ולכן את היכולת לחקור את הפונקציות של החיידקים הללו ואת ההשפעות שלהם על מארחים יונקים דורשת שימוש בהאכלה לתקתק. בנוסף, הטכניקה של xenodiagnosis (באמצעות הווקטור הטבעי לאיתור ושחזור של גורם מזהם) כבר שימושית במחקרים של זיהום מסתורי. על מנת לקבל nymphal קרציות שB. הנמל burgdorferi,קרציות נמאס חיידקים חיים בתרבות דרך צינורות נימים. שני מודלים של בעלי חיים, עכברים וקופים לא אנושיים, הם נפוצים ביותר ללימודי מחלת ליים מעורבים האכלה לתקתק. אנו מדגימים את השיטות שבן יכולות להיות מוזנת קרציות אלה עליו, והתאוששו מבעלי חיים לאף אחד מזיהום או xenodiagnosis.

Introduction

ב2011, מחלת ליים הייתה המחלה ארצית Notifiable הנפוצה ביותר 6 בצפון אמריקה (http://www.cdc.gov/lyme/stats/index.html). B. burgdorferi הוא חיידק צדדי, שניהם מבחינה גנטית וantigenically (הנסקרת ב ^1). החוקה הגנטית שלו כוללת כרומוזום גדול (> 900 KB) ועד 21 פלסמידים (12 ליניארית, עגול 9), עם התוכן משתנה בין פלסמיד מבודד. זה יותר מה ללמוד על החיידק זה, כמו מעל 90% ממסגרות הקריאה פתוחה פלסמיד אינם קשורים לכל רצפים חיידקים ידועים ^2,3. B. burgdorferi מציג מגוון רחב של אנטיגנים כמטרות פוטנציאליות של חסינות מארחת. עם זאת, זיהום שלא טופל נמשך לעתים קרובות. האינטראקציה של חיידקים עם המילייה תקתק וסביבת מארח החוליות מחייבת הסתגלות על ידי ב ' burgdorferi לאורך כל תהליך הזיהומים. בקידוד פלסמיד כמההגנים ידועים לבוא לידי ביטוי באופן דיפרנציאלי בתגובה לשינויים בטמפרטורה, pH, צפיפות תאים ואף שלב של מחזור החיים של קרצית ^4-8.

המחקר של B. הסתגלות burgdorferi לאורך מחזור enzootic, ותגובות מארח בעקבות זיהום על ידי התוואי הטבעי מסתמך על היכולת להאכיל קרציות במודלים של בעלי החיים מתאימים. מחקרים כאלה נתקלים באתגרים הטכניים של יצירת קרציות כי נמל B. burgdorferi, ולהבטיח את העברת ו / או האכלה היעילה של קרציות במחשב המארח למופת. בנוסף, הבלימה וההתאוששות של קרציות נגועות היא חיונית. בין הדגמים השתמשו בעכברים וקופים לא אנושיים, כל אחד מהם משמש ככלי חשוב במחקר הם מחלת ליים. כמו עם העכבר לבן רגל, שהוא מארח מאגר טבעי לB. burgdorferi, עכבר המעבדה הוא מארח רגיש מאוד שתומך בזיהום מתמשך של ב ' burgdorferi ^9. תחשיב היחסיםגעיית זיהום של עכברי מחלה רגישה, כגון מתח C3H, החיידקים להפיץ לרקמות רבות, כוללים העור, שלפוחית ​​השתן, שרירים, מפרקים ולב. תגובות דלקתיות לזיהום להוביל ללב חולה ורקמת מפרקים. בעוד שהחיידקים להתמיד במארח זה ולהישאר זיהומיות, נגעים דלקתיים יכולים להיות לסירוגין, לא בניגוד לתהליך בבני אדם. מודל העכבר ובכך סיפק מידע רב על B. הפתולוגיה מושרה burgdorferi, כולל דלקת פרקים וcarditis ולארח תגובות חיסוניים ^10-12. מנקודת המבט של הפתוגן, גנים מסוימים מתבטאים באופן דיפרנציאלי במהלך הדבקה של יונקים היו מאופיינים, כפי שיש לי כמה נחוץ להעברה מוקטור תקתק ^13-21.

למרות שכמה מינים של בעלי חיים ששמשו במחקר מחלת ליים ^22, קופי רזוס לחקות באופן קרוב ביותר את האופי רב איבר של מחלות אנושיות ^23. בניגוד לאחריםמודלים של בעלי חיים, ורוחבה של ביטויי מחלה כגון migrans אודם, carditis, דלקת פרקים, ונוירופתיה של מערכת עצבים ההיקפית ומרכזית שנצפו בקופי מקוק. בעכברים, מארח המאגר לB. burgdorferi, מחלה משתנה לפי זן עכבר וגיל ^24, תוך הגילויים מוקדם והופץ מאוחר הם ⁹ נדירים. בנוסף, מכרסמים אחרים, lagomorphs, וניבים כל נכשלים להפגין מחלה נוירולוגית מB. זיהום burgdorferi ^25. חשוב לציין, קופי מפגין סימנים שאופייניים לכל שלושת השלבים של borreliosis ליים, כלומר,, הופץ מוקדם מוקדם מקומי, ושלב מאוחר מחלת ליים ^26-28. migrans אריתמה (EM) הוא חשב להתרחש ב70-80% מהמקרים אדם ^29, ובא לידי הביטוי גם בקופי רזוס ^28,30. בעקבות זיהום, החיידקים להפיץ מהאתר של חיסון לאיברים מרובים. Spirochetal DNA זוהה בmu השלדscles, לב, שלפוחית ​​השתן, עצבים היקפיים ומקלעת, כמו גם במערכת העצבים המרכזית (מוח, גזע המוח ומוח קטן, בעמוד השדרה, ומאטר דורה) ^{ביום 31.}

סמן האכלה על עכברים נוצלה על ידי בנו וצוות מחקר נוסף להתפשטות של מושבות לתקתק, ביכולת מאגר מלומדת ^32-36 ובמחקרים של B. burgdorferi פתוגנזה ^37-40. טכניקה זו שימשה גם לxenodiagnosis ובדיקה של יעילות חיסון בעכברי ^41-44. יש לנו נמאס קרצית קרציות על פרימטים לא אנושיים לפיתוח מודל ^28, מחקר של יעילות חיסון ^45, ולxenodiagnosis בהערכה של טיפול אנטיביוטי שלאחר התמדת ^46. קרציות שB. הנמל יכול להישמר burgdorferi במחזור enzootic טבעי על ידי האכלת זחלים על עכברים נגועים ובאמצעות נימפות ללימודים, כפי שמועברים החיידקים בשלבי החיים. בדוח זה, אנו מורים על איך ליצור קרציות נגועים בסוג בר או B. המוטציה burgdorferi, באמצעות נימי צינור האכלה. זה גם יכול להתבצע על ידי microinjection ⁴⁷ ועל ידי טבילה ^48. מטרתו של מבוא המלאכותי של B. burgdorferi לקרציות יכולה להיות ללמוד זנים מוטנטים יכולת העברתו אינו ידוע, כדי ליצור קבוצה של קרציות עם שיעור זיהום גבוה, וכדי להפחית את הפוטנציאל לטעויות על ידי שמירה על מושבה תקתק נקייה ואחר נגוע. בנוסף, אנו מדגימים האכלה לתקתק על עכברים וקופים לא אנושיים, כדי להבטיח בלימה והתאוששות של קרציות הרצופה. השימוש בהאכלה לתקתק הוא חיונית למחקרים עתידיים של מערכת החיסונית ל-B זיהום burgdorferi, יעילות חיסון ליים פוטנציאלית, וxenodiagnosis לגילוי זיהומי תורת הנסתר.

Protocol

מתווה ניסוי של חיסון לתקתק והאכלה על בעלי חיים למחקר מחלת ליים מתוארת באיור 1.

1. Nymphal קרצית Inoculating קרציות עם B. burgdorferi באמצעות צינור האכלה בנימים

בעת ביצוע מניפולציות עם קרציות, חלוקי מעבדה לבנים עם שרוולים אלסטיים, כפפות, כובעים נפוחים חד פעמי הם שחוקים.

1. הטכניקה שלנו היא גרסה שונה של שדווח על ידי Broadwater et al. ^49. הכן את צינורות נימים על ידי חימום ומושך pipets פסטר לרזון לשבור באמצעות חולץ pipet. בעזרת מלקחיים ולנתח היקף, לשבור את הטיפים לקוטר האופטימלי (כ 0.2 מ"מ). צינור סטנדרטי לגודל mouthpart תקתק משמש כמדריך לשינוי גודל. מגן פנים צריך להיות משוחק בעת הכנת pipets.
2. לגדול ב burgdorferi לבין 2-8 x 10 ⁷ / מיליליטר (שלב אמצע יומן) במדיום BSK-H קון (Sigma)Taining 6% בסרום ארנבת.
3. השתמש קרציות nymphal שאוחסנו ב23 מעלות צלזיוס למשך 4-6 שבועות נשירה שלאחר זחל. מקום קרציות על גבי צלחת קטנה 60 x 15 מ"מ פטרי עם קלטת דו צדדית על פני השטח התחתון החיצוניים של הצלחת. הנח את הגחון בצד קרציות פונה כלפי מעלה.
4. טובלים את קצה צינור נימים לתוך B. צינור תרבות burgdorferi לאחר הערבוב. מניחים את צינור הנימים מעל hypostome של חלקי הפה תקתק באמצעות היקף ניתוחים. השתמש בחימר דפוס כדי לתקן את הצינור במקום, כפי שמוצג באיור 2 א.
5. הנח את צלחות פטרי עם קרציות מודבקות בתוך גיגית פלסטיק שקופה גדולה לרמה נוספת של בלימה. מגבות נייר רטובות מתווספות לספק לחות. מניחים את קרציות בחממה תרמית 37 מעלות צלזיוס במשך 30 שעות דקות-2 עד עשיית הצרכים הוא נראית לעין. זה מצביע על כך בתקשורת המכילה חיידקים עברה דרך לתקתק.
6. הנח את קרציות ל2-4 שבועות ב23 ° C כדי לאפשר הסתגלות לסביבה לתקתק לפני ההאכלהשלהם על בעלי חיים.

2. הדבקה של עכברים עם B. burgdorferi ידי Tick

1. לדלל מניות קטמין 1:10 ב מים סטריליים. הרדימי כל עכבר עם 100 מ"ג / ק"ג קטמין ידי זריקת intraperitoneal עם מזרק טוברקולין
2. ברגע שהעכבר הוא בהרדמה מלאה, לגלח את העכבר מהאוזניים ועד לאמצע הגב באמצעות קנס (רמינגטון להחליק ומשיי) גוזם חשמלי.
3. במחבת לבנה ללא חפצים אחרים בקרבת מקום, להעביר את קרציות nymphal (שburgdorferi B. נמל) על ידי מכחול לח לאזור נטול השיער של העכבר. לחלופין, ניתן להציב קרציות נגוע בעכברים לxenodiagnosis של עכברים עם זיהום חשוד. השימוש במשטח נקי, לבן עבור מיקום תקתק עוזר להבטיח שכל קרציות פנויות תהיה לראות בקלות.
4. מניחים את העכבר בכליאה מיוחדת (אלנטאון כליאה, אלנטאון, פנסילבניה). הכליאה כוללת גריל נירוסטה מוגבה מתחתית הכלוב. Tהוא בראש הכלוב שונה על ידי המכונה בחנות בבית שלנו כדי לרומם את מחזיק בקבוק מים מספיק כדי לאפשר תנועה חופשית של העכבר מתחת. המחבת מלאה בכ ½ סנטימטר של מים כדי ללכוד כל קרציות שנפלו מעכברים (איור 3 א). כדי למזער את הסיכון של היפותרמיה, כריות חימום לשימוש חוזר, במיקרוגל לפני השימוש, ממוקמות מתחת לכלובים עד לעכברים להתעורר לגמרי מהרדמה. בעלי חיים הם לעתים קרובות ataxic כפי שהם להתאושש מן ההרדמה ומתחככות מזון ומגשי מים, ולכן אלה יש להסיר. מפלס המים הוא נמוך מספיק כדי למנוע את האיברים של עכברים משקיעה.
5. מניחים את הכלוב בתוך מגש, כי כבר בשורה עם רסק מלכודת סבך (Contech, ויקטוריה, BC, קנדה) וקלטת כדי להבטיח הלכידה של פרוקי רגליים. עכברים בכלוב ביחידות ונצפו ברציפות במהלך התקופה של הרדמה.
6. בתוך 2 שעות, כאשר עכברים הם לגמרי ער מההרדמה, מגש האוכל ובקבוק מים מוחלפים לכלוב. לאחר 24 שעות, העשרת הדיור בהיקף של צריף פלסטיק וnylabone תוחלף.
7. לאחר 3, 4, ו 5 ימים, בדוק את העכבר, הכלוב ומים בכלוב לקרציות נמאס. המים הכלוב הוא מנופה דרך מחבת מתכת לבנה (כלומר "פנורמי זהב"). יש לשטוף את הפד קרציות במים נקיים ולאחסן בצנצנות פלסטיק (איור 3 ב). בימים 3 ו -4, להחליף מים בכלוב עם מים נקיים. ביום 5, לבדוק לא רק את הכלוב, אבל העכבר ביסודיות לקרציות. בדרך כלל בשלב הזה כל קרציות האכילה וניתן להחזיר העכברים לכליאה רגילה.
8. מניחים את כל הפסולת מכלובי העכבר, כולל נוזלים, במכל Biohazard למעוקר וסילוק. שמור יומן של מספר קרציות שהונחה על עכברים ואלה התאוששו בכל העת.

3. האכלת קרציות על פרימטים לא אנושיים לזיהום עם B. burgdorferi או xenodiagnosis

1. הכן את מכשיר הבלימה לתקתק: חותכים עיגול בקוטר ¾ אינץ' 1 בגודל 3 אינץ3 אינץ LeFlap (דש) באמצעות אזמל נקי ומדריך המדידה. השתמש לחתוך החוצה כתבנית לחתוך עיגולים בגודל זהה בקצף Biatane וDuoderm. הקצף משמש כדי לרומם את הדש מעל פני השטח של העור ולמנוע ריסוק אפשרי של קרציה. Duoderm מוסיף שכבה נוספת של ריפוד ושכבות הקצוות של מכשיר הבלימה לאבטחה נוספת מבריחה לתקתק. תרשים של מכשיר הבלימה מתואר באיור 4.
2. צוות וטרינרים יהיה להרדים את החיה עם 5-8 מ"ג / קילוגרם Telazol בהזרקה לשריר.
3. קליפ השיער של בעלי החיים באמצעות גוזם חשמלי (אוסטר) מצויד בגודל 40 להבים. כל התחומים שיהיה מכוסה על ידי המעיל נחתכים: גב, קדמי, חלק עליון של זרועות. שימוש בקצף גילוח וסכיני גילוח חד פעמים כפולה להב, לגלח באופן הדוק על שטח של כ 25 סנטימטר אנכי x 20 אופקי סנטימטר. לנגב לנקות עם מגבות נייר לחות ומכה יבשה עם חום נמוך לייבוש העור.
4. הנח את הדש על tdorsum של בעל החיים, ממש מתחת לעצם השכם, משני צדי עמוד השדרה. השתמש סמן כדי לעקוב אחר המעגל באותה נקודה. הכן את השטח של עור סביב למעגל על ​​ידי ניגובו עם SkinPrep. זה מסיר שומן בעור, שעלול להשפיע על הידבקות של מכשירי דבק והכלה. השארת על היקף 1 סנטימטר של שטח מסביב למעגל, למרוח שכבה של דבק עור (SkinBond) ברוחב של כ -4 ס"מ.
5. הסר את הגיבוי דבק מקצף Biatane ולהדביק על העור במקום המתאים. בעלי חיים מורדמים שוב על ידי צוות וטרינרים עם 5 מ"ג / קילוגרם Telazol. לאטום את הקצוות עם דבק עור וקלטת Hypafix. הסר את הגיבוי דבק מהדש ולהדביק על גבי Biatane. הנח קלטת Hypafix מסביב לקצוות של LeFlap, אז קלטת את דש הרשת של הדש ולמקם את המעיל על בעלי החיים. דבק קלטת ומלכודת סבך מוחל על הרצפה בהיקפית המקיפים את הכליאה לא אנושית הפרימטים לאבטחה נוספת.
6. כדי למזער את ההשפעות של chemicals משמש בשלב 3.4 על האכלה לתקתק, קרציות מתווספות 24 שעות לאחר שהתקן הבלימה הוא במקום. בשלב זה, את האבטחה של המכשיר היא גם בדקה וחיזקה במידת הצורך. בדרך כלל, 20 נימפות תאכלנה (נשירת 4-8 שבועות שלאחר זחל) מתווספות לעור בתוך המכשיר באמצעות מכחול.
7. הסר את הגיבוי דבק מהרשת של הדש ולאטום אותו במקום. לבסוף, להסיר את גיבוי Duoderm לחשוף דבק, ומניח על גבי מכשיר הבלימה. הוספת חתיכת סרט Hypafix פני מעגל הרשת הפתוח, ולהחליף את המעיל. מכשיר הבלימה הושלם מוצג באיור 5 א.
8. לאחר 5 ימים, להרדים החיות כאמור לעיל והמעיילים יוסרו. הסר את הסרט ראשון כדי לבדוק האכלת תקתק דרך הרשת (איור 5). לקלף את Duoderm זהירות מהדש.
9. למשוך בחזרה את חלק הרשת בקצוות כדי לספק גישה לקרציות. קרציות הפד נמצאות לעתים קרובות ליד או מתחתמעגל הקצף (איור 5 ג) ומוסרים והניח במים נקיים עם מכחול. הסר את ההתקן פעם אחת את כל קרציות נמאס הגלוי נאספות (איור 5D).

הערה: לעתים קרובות, מכשיר הבלימה יכול להיות פשוט התקלף מהעור. אם ההידבקות היא חזקה ועלולה לגרום נזק לעור, ממס Unisolve מוחל על האזור להסרת עדינה. העור הוא ניגב עם isopropanol וקרציות מאוחסנים ב23 ° C. אם משתמש בו לזיהום, ניתן לכתוש קרציות כדי לאשר את המספר שהכיל B. burgdorferi. אם משמש לxenodiagnosis, קרציות נשמרות עבור 1-3 שבועות לפני הניתוח של תוכן midgut.

תוצאות

בעקבות השלמת האכלת נימים, קרציות הם נחו בדרך כלל ב23 מעלות צלזיוס למשך 2-3 שבועות לפני שהם מוזנים בבעלי חיים לצורך השידור. באמצעות טכניקת נימי ההאכלה, מצאנו כי מעל 90% מהפד קרציות B. נמל burgdorferi. אחוז קרציות החיובית נקבע על ידי שטיפת קרציות בחמצן ואתנול, ולאחר מכן ר...

Discussion

על מנת לקבל קרציות שB. הנמל burgdorferi ללימודים במורד הזרם, קרציות יכולות להיות: (1) האכיל בעכברים נגועים בשלב הזחל, (2) שקוע בB. תרבויות burgdorferi בבית או בשלב הזחל או nymphal ^48; (3) microinjected עם B. burgdorferi ^47, או (4) ב-fed צינור נימים burgdorferi ^49. ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
BSK-H	Sigma	B-8291
Ketamine HCl
Tangle Trap coating Paste	Ladd research	T-131
SkinPrep	Allegro Medical Supplies	177364
LeFlap, 3" x 3"	Monarch Labs
Hypafix tape	Allegro Medical Supplies	191523
SkinBond	Allegro Medical Supplies	554536
UniSolve	Allegro Medical Supplies	176640
Biatane Foam, adhesive 4"x4"	Coloplast	3420
DuoDerm CGF Dressing - 4" x 4", (3/4)" adhesive border	Convatec	187971
Nonhuman primate jackets with flexible 2" back panels; add drawstrings at top and bottom	Lomir Biomedical Inc.
EQUIPMENT
Pipet puller	David Kopf Instruments	Model 700C
Dark field microscope	Leitz Wetzlar	Dialux
Dissecting microscope	Leica	Zoom 2000
Mouse caging	Allentown caging