הקמתה של<em&gt; במבחנה</em&gt; מערכת ללמוד את התנהגות תאית של<em&gt; קנדידה glabrata</em&gt; בהמקרופאגים THP-1 אדם

Summary

המאמר הנוכחי מתאר פרוטוקול להקים מערכת מודל תרבית תאים במבחנה כדי לחקור את האינטראקציה של הפתוגן פקולטטיבי תוך תאי אנושי פטריית קנדידה glabrata עם מקרופאגים אדם אשר יהיה כלי שימושי כדי לקדם את הידע של מנגנוני ארסיות פטרייתי שלנו.

Abstract

מערכת מודל תרבית תאים, אם לחקות קרוב של תנאים סביבתיים מארח, יכול לשמש כאלטרנטיבה זולה, לשחזור ובקלות למניפולציה למערכות מודל חיה ללימוד צעד ספציפי של זיהום חיידקים פתוגנים. שורת תאי monocytic אדם THP-1, אשר, על טיפול אסתר phorbol, הוא מובחן למקרופאגים, כבר בעבר נעשתה שימוש כדי ללמוד אסטרטגיות ארסיות רבים פתוגנים תאיים כגון שחפת Mycobacterium. כאן, אנו דנים בפרוטוקול לחוקק במבחנה מודל תרבית תאים מערכת באמצעות THP-1 מקרופאגים להתוות את האינטראקציה של שמרי הפתוגן אנושי אופורטוניסטי קנדידה glabrata עם תאי phagocytic המארח. מערכת מודל זה היא פשוטה, מהיר, נוח למסכי מוטציה תפוקה גבוהה, ואינה דורשת ציוד מתוחכם. ניסוי זיהום מקרופאג טיפוסי THP-1 לוקח כ 24 שעות עם 24-48 שעות נוספות כדי לאפשר תאיים התאושששמרים לגדול על המצע עשיר למושבה להרכיב ניתוח כדאיות מבוסס יחידה. כמו במבחנה מערכות מודל אחרות, מגבלה אפשרית של גישה זו היא קושי בחיוץ התוצאות שהתקבלו למעגלי תא חיסון מורכבים ביותר קיימים במארח האנושי. אולם, למרות זאת, בפרוטוקול הנוכחי הוא מאוד שימושי כדי להבהיר את האסטרטגיות שהפתוגן פטרייתי עשוי להעסיק להתחמק / לנטרל תגובת מיקרוביאלית ולשרוד, להתאים, ולהתרבות בסביבה התזונתית ירודה של תאים חיסוניים מארחים.

Introduction

מיני קנדידה הם הגורם המוביל לזיהומים פטרייתיים פולשניים מסכנות חיים בחולי מדוכאי חיסון ^1. קנדידה glabrata, הפתוגן nosocomial מתעוררים, הוא שני או שלישיים מבודד בתדירות הגבוהה ביותר מיני קנדידה מחולי טיפול נמרץ בהתאם למיקום הגיאוגרפי ^1-3. פילוגנטית, ג glabrata, שמרי ניצנים הפלואידים, קשור באופן הדוק יותר לSaccharomyces cerevisiae מאשר spp קנדידה פתוגניים אינם שמרי מודל פתוגניים. כולל ג אלביקנס ^4. עולה בקנה אחד עם זו, ג glabrata חסר כמה תכונות ארסיות פטרייתי מרכזיות, כולל הזדווגות, פעילות מפרקי חלבונים מופרשת ופלסטיות המורפולוגית ^4-5.

למרות שג glabrata אינו טופס העובש, הוא יכול לשרוד ולשכפל במקרופאגים העכבריים והאנושיים ^6-8 טוען כי היא פיתחה מנגנוני פתוגנזה ייחודיים. מידע מוגבל זמין על האסטרטגיות שג glabrata מעסיק לשרוד סביבת מקרופאג תאית תזונתית ירודה ולנטרל חמצוני ותגובות מארח nonoxidative רכובים על ידי תאים חיסוניים מארח ^5. מערכת מודל מקרופאג רלוונטי היא תנאי הכרחי כדי להתוות את האינטראקציה של ג glabrata עם תאי phagocytic מארח באמצעות גישות הגנומי וproteomic פונקציונליים. תאים היקפיים mononuclear הדם (PBMCs) ומקרופאגים עצם שמקורם במח (BMDMs) ממקור אנושי ועכברי, בהתאמה, קודם לכן שימשו ללמוד את האינטראקציה של ג glabrata עם תאים חיסוניים מארח ^7,9. עם זאת, קושי בהשגת PBMCs וBMDMs, תוחלת שלהם מוגבלת החיים ווריאציה מקומית בין תורמי יונקים שונים להגביל את הניצול של תאים אלה מערכות מודל צדדי כ.

כאן, אנו מתארים שיטה להקמתה של מערכת במבחנה ללמוד intracellular התנהגות של ג תאי glabrata במקרופאגים נגזרו משורת תאי monocytic אדם THP-1. המטרה הכללית של פרוטוקול זה הייתה לחוקק מערכת מודל פשוטה, זולה, מהירה, ושחזור תרבית תאים שניתן להשפיע בקלות ללמוד היבטים שונים של האינטראקציה הפתוגן מארח פטרייתי.

THP-1 תאים ששמשו בעבר לפענח את התגובה החיסונית המארחת נגד מגוון רחב של פתוגנים, כולל חיידקים, וירוסים, פטריות ^ו10-12. תאי THP-1 monocytic קלים לשמור ויכולים להיות מובחן, על טיפול אסתר phorbol, למקרופאגים אשר לחקות מקרופאגים נגזרות מונוציטים של אדם ומבטאים את סמני מקרופאג מתאימים ^13. היתרונות העיקריים של מערכת מודל מקרופאג THP-1 הם קלות השימוש וחוסר דרישת ציוד מתוחכמת.

הפרוטוקול המובא כאן הוא להתאמה בקלות ללמוד את האינטראקציה של פתוגנים פטרייתי אדם אחרים עם הוזt תאים חיסוניים. ההליך הנוכחי גם יכול להיות מועסק על מנת לזהות גורמים ארסי לפתוגן של עניין באמצעות מסכי מוטציה תפוקה גבוהה. הוכחה של רעיון זה באה לידי ביטוי על ידי השימוש המוצלח של מערכת מודל התרבות THP-1 לזהות סט של 56 גנים הנדרשים להישרדותו של ג glabrata במקרופאגים אדם ^8.

Protocol

מומלץ לבצע ג ניסויי זיהום glabrata במעבדה עם בלימת בטיחות ביולוגית ברמה 2 (BSL-2).

1. הכנת monolayer מקרופאג THP-1.
2. הכנת ג השעיה תא glabrata.
3. זיהום של מקרופאגים THP-1 עם ג תאי glabrata.
4. מדידה של קצב phagocytosis ושכפול תאיים באמצעות assay יחידת המושבה להרכיב.
5. ניטור של שכפול תאיים באמצעות מיקרוסקופ לייזר confocal סריקה.

1. הכנת THP-1 Macrophage חד שכבתי

1. THP-1 הוא קו סלולרי monocytic אדם נגזר מהדם ההיקפי של ילד זכר 1 בן סובל מלוקמיה חריפה monocytic ^14. THP-1, שורת תאי השעיה, נשמר באופן שיגרתי על 37 מעלות צלזיוס ב5% CO ₂ humidified במדיום תרבות RPMI-1640 תוספת 10% FBS (בסרום שור עוברי). טיפול עם phorbol 12 myristate 13 יצטטו (PMA, אסתר phorbol) תוצאות בבידול מסוף של תאי monocytic THP-1 למקרופאגים. חשוב מכך, טיפול PMA אינו משפיע על כדאיות תא ותאים מובחנים לא להתחלק.
2. זרע כ 1.5 x 10 ⁶ מונוציטים THP-1 ב100 תרבות מנות מ"מ RPMI-1640 בינוני מלא (מדיום RPMI-1640 תוספת סרום 10%, 2 מ"מ גלוטמין ו 1x אנטיביוטיקה; 10 מיליליטר / צלחת) ולתת לתאים לגדול ב 37 ° C ב 5% CO _{2 למשך} 2 ימים.
3. ברגע שTHP-1 תאים הגיעו צפיפות של 8 x 10 ⁵ תאים / מיליליטר, להעביר את המנה התרבות לזרימה למינרית תרבית תאים ובעדינות לערבל אותו לresuspend תאים התיישבו.
4. פיפטה ההשעיה התא החוצה, מקום לתוך צינור סטרילי 15 מיליליטר ו צנטריפוגות ב 1,000 סל"ד (130 XG) במשך 4 דקות. בטל supernatant ו להשעות תא גלולה THP-1 ב 5 מיליליטר בינוני טרי, prewarmed, RPMI-1640 מלאה.
5. ספירת תאים עם hemocytometer ולדלל את celהשעיה ליטר לצפיפות סופית של 10 ⁶ תאים / מיליליטר עם מדיום להשלים RPMI-1640 prewarmed
6. הוסף 1 μl של 160 מניית מ"מ PMA (פתרון 13 יצטטו 12 Myristate phorbol הערוך sulfoxide דימתיל) ל10 מיליליטר השעיה תא THP-1 (ריכוז סופי 16 ננומטר) ומערבבים היטב. לוותר על ההשעיה תא 1 מיליליטר לבאר כל צלחת תרבית רקמת 24 היטב דגירה צלחת בחממה נשמרה על 37 ° C עם 5% CO ₂ למשך שעות 12.
7. הסר בינוני ישן, להוסיף 1 מיליליטר prewarmed RPMI-1640 בינוני מלאה ומאפשר לתאים להתאושש במשך שעות 12 על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO _2.
8. שים לב לתאים תחת מיקרוסקופ הפוכה כדי לוודא שתאי monocytic THP-1 הסגלגל בהשעיה כבר מובחנים למקרופאגים שטוחים, ציר בצורה והחסידה. תאים מובחנים אלה הם עכשיו מוכנים לנהל ג מחקרי זיהום glabrata.

2. הכנת ג glabrata & #תרחיף תא; 160

Bg2 זן ג glabrata פראי מהסוג ישמש להדביק THP-1 מקרופאגים. ג תאי glabrata נמצאים באופן שגרתי בתרבית YPD הנוזלי (תמצית שמרים (1%)-peptone (2%), דקסטרוז (2%)) בינוני. בינוני YPD מוצק הוא הוכן על ידי הוספה אגר 2% לפני מעוקר בינוני.

1. כדי להכין את התרבות של ג glabrata, לבחור מושבה את אחת מהצלחת אגר עם לולאה סטריליים, חד פעמים ולחסן ל10 מיליליטר מדיום נוזלי YPD ו דגירה של 14-16 שעה עם הרעד (200 סל"ד) ב30 ° C.
2. צנטריפוגה תרבות זו (1 מיליליטר) בשעה 4,000 סל"ד (1,800 XG) במשך 5 דקות בmicrocentrifuge בראש טבלה, לשטוף תאים שלוש פעמים עם PBS (פוספט שנאגרו מלוח, pH 7.4) סטרילי ולהשעות את התא גלולה ב 1 מיליליטר PBS.
3. מדוד OD ₆₀₀ של ג ההשעיה glabrata תא ולדלל עם נפח מתאים של PBS סטרילי כדי לקבל צפיפות של 2 x 10 מיליליטר / ⁶ תאים (OD ₆₀₀= 0.1). לחלופין, צפיפות התאים הרצויה יכולה להיות מושגת על ידי ספירת תאי שמרים באמצעות hemocytometer.

3. זיהום של המקרופאגים THP-1 עם ג תאי glabrata

1. הוסף 50 ג μl השעיה תא glabrata לTHP-1 מקרופאגים (10 ⁶ תאי זרע לכל טוב של צלחת תרבות 24 גם) כדי להשיג משרד הפנים (ריבוי של זיהום) של 0.1 דגירה צלחת ב 37 ° C עם 5% CO _2.
2. כדי לקבוע שמרי ספירות קיימא, לדלל 50 ג μl תא השעיה פי 100 glabrata בPBS סטרילי וצלחת על מצע מוצק YPD 100 μl. דגירה צלחות ב30 מעלות צלזיוס ולספור ידני את מספר מושבות שמרים המופיעות אחרי 1-2 ימים. מספרים אלה יהיו, מכאן ואילך, יופנו כג 0 שעות glabrata CFUs (מושבה להרכיב יחידות).
3. לאחר coculturing 2 שעות של תאי THP-1 עם ג תאי glabrata, תרבות בינונית שנזרקו על ידי היפוך צלחת תרבית רקמת 24 גם iמאגר na ולשטוף בעדינות שלוש פעמים עם PBS סטרילי prewarmed להסיר ג תאי nonphagocytosed תאי glabrata. שטיפות עדינות עם PBS הן חיוניים כדי להשיג את ההסרה של כל השמרים תאיים שלמה בלי לגרום נזק לmonolayer מקרופאג THP-1.

4. מדידה של Phagocytosis דרג ותאי שכפול באמצעות מושבה להרכיב יחידת Assay

1. Lyse ג glabrata נגוע THP-1 מקרופאגים ב 1 מיליליטר סטרילי H ₂ O למשך 2 דקות, לגרד בעדינות כדי להסיר את פסולת מקרופאג מהבאר ולאסוף lysate תא בצינור microcentrifuge. אימות מיקרוסקופית של תמוגה מקרופאג המוחלטת היא מרכזית להתאוששות של כל השמרים הפנימו.
2. הכן דילול פי 100 של lysate ב PBS סטרילי, צלחת על מצע מוצק YPD 100 μl ודגירת צלחות ב30 ° C.
3. אחרי 1-2 ימים, לספור ידני את מספר ג glabrata מושבות ap כיpeared על מדיום YPD, להכפיל בגורם לדילול (2 CFUs שעה) ולחשב את שיעור phagocytosis המתייחס לאחוזים של ג תאי glabrata המעובדים על ידי THP-1 מקרופאגים לאחר coincubation שעה 2 תוך שימוש בנוסחה הבאה.
   phagocytosis% = [(CFUs ב2 h) / (CFUs ב 0 h)] X 100
4. כדי למדוד את קצב השכפול תאיים של ג תאי glabrata בTHP-1 מקרופאגים, לאסוף שמרים תאיים בזמן שונה נקודות לפרסם כלומר זיהום. 4, 6, 8, 10, 12, ו24 שעות, על ידי חזרה על שלבי 3.3-4.3.
5. לחשב הישרדות / שכפול של פי ג תאי glabrata בTHP-1 מקרופאגים על ידי חלוקת סך CFUs בכל נקודת זמן נתון עם אלה בשעה 2 (שמרי phagocytosed).

5. ניטור של תאיים שכפול באמצעות Confocal אסאה סריקה מיקרוסקופית

1. ביצוע השלבים המתוארים בסעיף 1, זרע 5 x 10 ⁵ תאים THP-1 שטופל ב-PMA בכל טוב של שתי שקופיות קאמריות ארבעה היטב ולדגור על 37 ° C עם 5% CO ₂ למשך שעות 12.
2. החלף בינוני ישן עם מדיום מלא prewarmed RPMI-1640 ולאפשר לתאים להתאושש מטיפול PMA עבור שעות 12.
3. הכן את ה-GFP (חלבון פלואורסצנטי ירוק) מתויג ג ההשעיה תא glabrata כפי שתואר בסעיף 2 ולהדביק לTHP-1 מקרופאגים למשרד הפנים של 1. אם ג glabrata זנים להביע GFP אינם זמינים, תאי שמרים שכותרתו עם FITC (isothiocyanate והעמסת) ניתן להשתמש כדי לעקוב אחר המתרחשים בתחילת לפרסם דהינו זיהום. שיעור phagocytosis והתבגרות phagolysosomal בשעה 2.
4. דגירה שקופיות במשך שעה 2 ב37 ° C עם 5% CO _2, להפוך אותם בקפידה כדי לבטל בינוני ולשטוף 3x עם סטרילי, prewarmed PBS.
5. הוסף 500 μl prewarmed RPMI-1640 Medi מלאאממ לכל תא של שקופית אחת ודגירה אותו על 37 ° C עם 5% CO ₂ למשך 22 שעה.
6. כדי לתקן 2 ג hr מקרופאגים THP-1-נגועים glabrata, להוסיף 500 μl של פורמלדהיד .3.7% (שהוכן PBS) לכל תא של שקופית אחרת ודגירה אותו בטמפרטורת חדר למשך 20 דקות בחושך.
7. לשטוף להחליק שלוש פעמים עם PBS, להוסיף 500 μl Triton-X (0.7%), ו דגירה בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות בחושך.
8. 3x שקופיות לשטוף עם PBS, להסיר קאמרי משקופית התרבות ואוויר לייבש אותו ל3-5 דקות בחושך.
9. הר בזהירות coverslip באמצעות מדיום Vectashield הרכבה המכיל DAPI (4 ',6-diamidino-2-phenylindole) בשקופית הימנעות היווצרות בועה. להסיר בעדינות את הנוזל העודף עם Kimwipe ולאטום קצות coverslip עם לכה לציפורניים. שקופיות חנות בחושך על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
10. חזור על שלבים 5.4 ו5.6-5.9 לעבד THP-1 תאים 24 הודעה hr זיהום.
11. תאי תמונה באמצעות confo סריקת לייזרמיקרוסקופ קאל (אובייקטיבי 60x נפט טבילה, עירור ב 405 ננומטר ו488 ננומטר לDAPI וכתם ה-GFP, בהתאמה).

תוצאות

זיהום ניתוחים של מקרופאגים THP-1 שטופל ב-PMA עם ג תאים מהסוג בר glabrata (WT) גילו כי תאי WT היו phagocytosed ידי מקרופאגים בשיעור של 55-65% אחרי 2 coincubation שעה. יתר על כן, ג תאי glabrata היו מסוגלים להתנגד להריגתו על ידי THP-1 מקרופאגים ועברו 5 מתונות - לגידול פי 7 בCFUs לאחר 24 ?...

Discussion

מערכת חיסון מולדת משחקת תפקיד חשוב בשליטה על זיהומים פטרייתיים אופורטוניסטיים. המקרופאגים תורמים להגנה נגד פטריות על ידי בליעה והרס של הפתוגן פטרייתי. לפיכך, הבהרה של גורמים הנדרשים להישרדות ו / או מנטרל את הפונקציות מיקרוביאלית של מקרופאגים תקדם את ההבנה של אסטרטג?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
THP-1	American Type Culture Collection	TIB 202	Human acute monocytic leukemia cell line
RPMI-1640	Hyclone	SH30096.01	For maintaining THP-1 cells
Phorbol 12-myristate 13-acetate	Sigma-Aldrich	P 8139	Caution: Hazardous
YPD	BD-Difco	242710	For growing Candida glabrata cells
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	F8775	For fixation of C. glabrata-infected THP-1 macrophages
Phosphate buffered saline (PBS)			Buffer (137 mM NaCl, 10 mM Phosphate, 2.7 mM KCl,  pH 7.4) for washes
Saline-sodium citrate (SSC)			Buffer (3 M NaCl, 0.3 M sodium citrate for 20x concentration) for washes
Prehybridization buffer			Buffer (50% formamide, 5x Denhardt’s solution, 5x SSC, 1% SDS) for hybridization
VECTASHIELD mounting medium	Vector Labs	H-1200	For mounting slides for confocal microscopy
32P-labeled α-dCTP	JONAKI-BARC	LCP-102	For radiolabeling of signature tags
100 mm tissue culture dishes	Corning	430167	To culture THP-1 cells
24-well tissue culture plate	Corning	3527	To perform C. glabrata infection studies in THP-1 macrophages
4-chamber tissue culture-treated glass slide	BD Falcon	REF354104	To image C. glabrata-infected THP-1 macrophages
Hemocytometer	Rohem India		For enumeration of cells
Table top microcentrifuge	Beckman Coulter	Microfuge 18	For spinning down cells in microtubes
Table top centrifuge	Remi	R-8C	For spinning down cells in 15 ml tubes
Spectrophotometer	Amersham Biosciences	Ultraspec 10	To monitor absorbance of yeast cells
Plate incubator	Labtech	Refrigerated	To grow C. glabrata cells
Shaker incubator	New Brunswick	Innova 43	To grow C. glabrata cells
Water jacketed CO2  incubator	Thermo Electron Corporation	Forma series 2	To culture THP-1 cells
Confocal microscope	Carl Ziess	Ziess LSM 510 meta	To observe C. glabrata-infected THP-1 macrophages
Compound microscope	Olympus	CKX 41	To observe C. glabrata and THP-1 macrophages
PCR machine	BioRad	DNA Engine	To amplify unique tags from input and output genomic DNA
Hybridization oven	Labnet	Problot 12S	For hybridization
PhosphorImager	Fujifilm	FLA-9000	For scanning hybridized membranes
Thermomixer	Eppendorf	Thermomixer Comfort	For denaturation of radiolabeled signature tags
Gel documentation unit	Alphainnontech	Alphaimager	To visualize ethidium bromide-stained DNA in agarose gels