מודלים ושיטות להערכת תחבורה של ליפידיות פני מחסומים נייד

Summary

יישומים טיפוליים רבים דורשים הובלה בטוחה ויעילה של נשאי תרופות והמטענים שלהם על פני מחסומי תאים שבגוף. מאמר זה מתאר התאמה של שיטות הוקמו על מנת להעריך את השיעור ומנגנון של תחבורה של nanocarriers סמים (NCS) על פני מחסומים סלולריים, כגון במערכת העיכול (GI) אפיתל.

Abstract

ספקי משנה מיקרומטר (nanocarriers; NCS) לשפר את היעילות של תרופות על ידי שיפור מסיסות, יציבות, זמן מחזור, מיקוד, ושחרורו. בנוסף, חוצים מחסומים סלולריים בגוף הוא קריטי עבור שני המשלוח האוראלי של NCS הטיפולי למחזור הדם והתחבורה מהדם לרקמות, שבו יש צורך בהתערבות. תחבורת NC פני מחסומים סלולריים מושגת על ידי: מסלול paracellular (i), באמצעות שיבוש זמני של צמתים שמשתלבים תאים סמוכים, או (ii) את מסלול transcellular, שבו חומרים הם הפנימו על ידי אנדוציטוזה, מועבר על פני גוף התא, ומופרש על פני התא ההפוך (transyctosis). משלוח פני מחסומים סלולריים ניתן להקל על ידי צימוד הרפוי או הספקים שלהם עם סוכני מיקוד שלהיקשר באופן ספציפי לסמנים על פני קרום תא המעורב בהובלה. כאן, אנו מספקים שיטות למדידת WHI המידה ומנגנון של תחבורת NC על פני מחסום תא מודל,פרק מורכב מmonolayer של תאי האפיתל במערכת העיכול (GI) גדל על קרום נקבובי נמצא בכנס transwell. כינונה של מחסום חדירות אושר על ידי מדידת התנגדות חשמלית transepithelial (Teer), תחבורת transepithelial של חומר שליטה, וimmunostaining של צמתים הדוקים. כדוגמא, ~ 200 NCS פולימר ננומטר משמשים, אשר נושא מטען טיפולי והם מצופים בנוגדן שמכוון הקובע על פני קרום תא. הנוגדנים או המטען טיפולי מתויג עם ¹²⁵ למעקב radioisotope וNCS שכותרתו מתווספים לחדר העליון מעל monolayer התא לתקופות שונות של זמן. NCS הקשורים לתאים ו / או מועברים לתא הבסיסי ניתן לאתרם. מדידה של ¹²⁵ אני חופשי מאפשרת חיסור של השבר המושפל. מסלול paracellular נבחנים על ידי קביעת שינויים אפשריים הנגרמים על ידי תחבורת NC לפרמטרי המחסום שתוארו לעיל. i תחבורת Transcellulars נקבע על ידי עסק בהשפעה של ויסות מסלולי אנדוציטוזה וtranscytosis.

Introduction

מחסומים נייד במעשה גוף כשער בין הסביבה החיצונית והתאים פנימיים. זהו המקרה לרירית אפיתל להפריד את פני השטח החיצוני החשופים של מערכת העיכול (GI) בדרכי ^ו1-3 זרם הדם. מחסומים נייד גם לייצג את הממשק שבין זרם הדם וparenchyma ומרכיבים תאיים של רקמות ואיברים. זהו המקרה לרירית האנדותל הפנימית בכלי דם, כגון מחסום דם הריאה, מחסום דם המוח, וכו ^'1 היכולת לחצות מחסומים סלולריים אלה בגוף היא חיונית לאספקה ​​יעילה של סוכנים טיפוליים ואבחון למחזור הדם ורקמות / איברים שבו יש צורך בהתערבות.

כדי לשפר את המסירה של סוכנים טיפוליים או אבחון, ניתן לטעון תרכובות אלה לnanocarriers תת מיקרומטר (NCS). אפשר לנסח רכב משלוח סמים אלו עם מגוון רחב שלchemistries ומבנים כדי לייעל את מסיסות תרופה, הגנה, הפרמקוקינטיקה, שחרור, וחילוף חומרים של ^4,5. NCS יכול להיות גם פונקציונליות עם זיקה או מיקוד moieties (למשל נוגדנים, סוכרים פפטידים, aptamers, וכו ') כדי להקל על הדבקה לאזורים בגוף שבו נדרש הפעולה הטיפולית ^2,6. מיקוד של NCS לגורמים הביעו על פני השטח של מחסומים סלולריים יכול עוד יותר להקל על תחבורה אל ו / או על פני רפידות אלה ^2,6.

התפקיד של סלקטיבי שינוע חומרים בין שתי סביבות דורש תכונות ייחודיות מסוימות בקרב שכבות תאים. מאפיין אחד כזה הוא קוטביות בתא, שבו קרום הפסגה מול לומן של חללים משתנה מקרום basolateral המכוון כלפי interstitium הרקמות, ביחס למורפולוגיה קרום ורכב שומנים, מובילים, וקולטני ^2. תכונה נוספת כרוכה junctio אינטרNS חיבור תאים סמוכים. רגולציה של החלבונים היוצרים צמתים הדוקים, מולקולות במיוחד junctional הידבקות (קונפיטורות), occludins, וclaudins, לווסת את תפקוד המחסום כדי לאפשר באופן סלקטיבי או לא הובלת חומרים בין תאים, המכונים תחבורת paracellular, המאפשר מעבר של חומרים מהלום ל שטח basolateral ^3. עקידת אלמנטים רבים טבעיים וסינטטיים (לויקוציטים, מולקולות, חלקיקים, ומערכות אספקת סמים) לחסמים סלולריים בגוף יכולה לגרום לפתיחת תא לצומת, אשר עשוי להיות ארעי ויחסית לא מזיק או ממושך יותר, ולכן, לא בטוח עם גישה של חומרים בלתי רצויים על פני המחסום ^2,5,7-9. כתוצאה מכך, מסלול זה יכול להיות מוערך על ידי מדידת ההתנגדות החשמלית transepithelial (Teer) ודיפוזיה פסיבית paracellular של מולקולות (זליגת paracellular במסמך זה נקרא), לפיה ירידה בהתנגדות לזרם חשמלי או דליפת paracellular המוגברת של ineמתחם rt לחלל basolateral מצביע על פתיחת צמתים תא, בהתאמה ^5,10,11. כדי להשלים את השיטות הללו, כל אחד מחלבוני הצומת ההדוקים המפורטים לעיל יכול להיות מוכתם על מנת להעריך את היושרה שלהם, שבו צריכים להופיע כתמים מרוכזים בגבולות תאי תאים בכל רחבי הפריפריה התא ^5,10,12.

לחלופין, מערכות אספקת סמים, כי יעד גורמי תא שטח מסוימים, כגון אלה הקשורים לבורות מצופים clathrin או invaginations קרום בצורת בקבוק שנקרא caveolae, עלולות לעורר ספיגת ועי לתוך תאים על ידי אנדוציטוזה, מתן שדרת עבור משלוח סמים לתאים תאיים ^{5, 13.} בנוסף, אנדוציטוזה עלולה להוביל לסחר בשלפוחית ​​על פני גוף התא לשחרור בצד basolateral, תופעה הידועה בtransyctosis, או תחבורת transcellular ^14. לכן, ידע של קינטיקה והמנגנון של אנדוציטוזה ניתן להשתמש כדי לנצל תאייםnd משלוח הסמים transcellular, שמציע מצב בטוח יחסית ושליטה מלאה של משלוח בהשוואה לתוואי paracellular. (אנדוציטוזה כמו במקרה של מולקולת הידבקות תא (רמ"א בתיווך)) המנגנון של אנדוציטוזה ניתן להעריך עם מאפננים של מסלולים קלאסיים (clathrin ואנדוציטוזה בתיווך caveolin, וmacropinocytosis) או מסלולים שאינם קלאסיים ^5,13,15 .

בעוד סחר תאיים לעתים קרובות למד בבארות או coverslips סטנדרטיים, היעדר תא basolateral מונע קיטוב תא ואת היכולת ללמוד תחבורה פני שכבות תאים. כדי להתגבר על מכשול זה, תחבורה ברחבי monolayers התא נחקרה ארוכה באמצעות transwell מוסיף ^10,11,16,17, שמורכב מחדר עליון (פסגת), קרום חדיר נקבובי שבו תאים לצרף ולהקים monolayer הדוק, ונמוך יותר קאמרי (basolateral) (איור 1). בתצורה זו, תחבורה ניתן למדוד בקודקוד לכיוון basolateral על ידי מתן טיפול לחדר העליון, בעקבות ההובלה דרך monolayer התא והקרום הנקבובי הבסיסי, ולבסוף איסוף הבינוני בתא התחתון לכימות של חומר מועבר. תחבורה בכיוון basolateral לפסגה גם ניתן למדוד על ידי ממשל ראשוני לתא התחתון והאוסף הבא מהעליון קאמרי ^5,10,12,16. טכניקות שונות קיימות כדי לאמת את היווצרות מחסום חדירות על transwells, כולל Teer ומבחני תחבורת paracellular, כפי שתוארו לעיל. בנוסף, המסנן החדיר שבו תאים בתרבית ניתן להסיר בניתוח הדמיה (למשל על ידי הקרינה, confocal, מיקרוסקופית אלקטרונים), כהוכחה נוספת של מודל monolayer תא, כמו גם את המנגנון של תחבורה. בחירה של סוג הקרום, שהוא זמין בגדלים שונים נקבוביות, חומרים ופני שטחים, תלויה בפקטו השוניםrs כגון גודל של חומרים או חפצים כדי להיות מועברים, סוג התא, ואת שיטת הדמיה ^16,18-20. Transwell מוסיף גם להקל כימות מבוקר ומדויק של תחבורה בהשוואה למערכות של יונקים מורכבים, כאמצעי אחסון של התאים ועל פני השטח של תאים ידועים קבועים. בעוד גורמים רבים המעורבים בin vivo משלוח בוטלו, לרבות הנוכחות של ריר מעיים, מאמץ גזירה, אנזימי עיכול, תאי מערכת החיסון, וכו ', בקנה מידה הקטן הזה במודל מבחנה מספקת מידע ראשוני שימושי לגבי תחבורה.

כדוגמא כדי להמחיש את ההתאמה של שיטות אלה ללמוד תחבורת NC פני מחסומים סלולריים ^10,11,16,17, אנו מתארים כאן מקרה שבו הפוטנציאל להובלת NC פני האפיתל במערכת העיכול היה במתכונת על ידי בחינת מעבר משלוח סמים מודל של מערכת באמצעות monolayer של אדנוקרצינומה מעי גס אפיתל האנושי (קאקו-2) תאים. לצורך, ג זואמות היו בתרבית במוסיפה transwell, על terephthalate 0.8 מיקרומטר הנקבובית פוליאתילן מסנן (PET) (קוטר 6.4 מ"מ), שהוא שקוף וניתן להשתמש בם להדמיה מיקרוסקופית. מעמדו של מחסום החדירות אומת על ידי מדידת Teer, תחבורת הפסגה לbasolateral של חומר שליטה, אלבומין, והדמית מיקרוסקופ פלואורסצנטי של אלמנט של צמתים ההדוקים, חלבון occludin. מודל של פולימר הממוקד NC משמש, בהיקף של 100 ננומטר, חלקיקי פוליסטירן, לא מתכלים. NCS הם מצופים על ידי ספיחת משטח עם נוגדן מיקוד לבד או שילוב של נוגדני מיקוד ומטענים טיפוליים, שבו גם מרכיב יכול להיות מתויג עם ¹²⁵ למעקב radioisotope. בדוגמא שנבחרה, הנוגדנים מזהה הידבקות אינטר מולקולה 1 (ICAM-1), חלבון לידי ביטוי על פני השטח של אפיתל במערכת העיכול (וגם אחרים) תאים, אשר הוכח כדי להקל תאיים וo תחבורת transcellular ספקים ו סמים ומטעניהם ^21. המטען הוא אלפא Galactosidase (α-Gal), אנזים טיפולי המשמש לטיפול במחלת פברי, הפרעת אחסון lysosomal גנטי ^22.

NCS המצופה, של כ -200 ננומטר בגודלם, מתווספים לתא apical מעל monolayer התא וטופחו על 37 מעלות צלזיוס למשך תקופות משתנות של זמן, שלאחריו ¹²⁵ אני בNCS ניתן לאתרם קשור לmonolayer ו / או התא מועבר לתא basolateral מתחת לתאים. קביעה נוספות של ¹²⁵ אני חופשי מאפשרת חיסור של השבר והערכה המושפל תחבורת NC המצופה. המנגנון של תחבורה מוערך יותר על ידי בחינת שינויים במחסום החדירות הנוגעים לתוואי paracellular, באמצעות הפרמטרים שתוארו לעיל, תוך הובלת transcellular נקבעת על ידי בחינת שינויים בתחבורה כאשר ויסות מסלולים של אנדוציטוזה וtranscytosis.

ontent "> שיטות אלה מספקים מידע רב ערך לגבי דגמי מחסום סלולארי, במידה ושיעור ההובלה של מערכת אספקת סמים, ואת המנגנון של תחבורה כזה, לחלוטין ומאפשר הערכה של הפוטנציאל עבור משלוח סמים על פני מחסומים סלולריים.

Protocol

1. Culturing חד שכבתי נייד בהוספת Transwell

1. בשכונת סטרילי, רמת בטיחות ביולוגית 2 תא תרבות, מקום 0.8 מ"מ הנקבובית PET transwell מוסיף לתוך צלחת 24 גם (4 בארות לכל מצב, למובהקות סטטיסטיות) עם מלקחיים. כל החומרים שנכנסו למכסת המנוע צריכים להיות מעוקרים עם אתנול.

הערה: הגודל הנקבובית של המסנן צריך להיות שנבחר בהסכם לגודל הממוצע של NC בשימוש, כדי לאפשר תחבורה על פני הממברנה. כמו כן, לתוצאות משמעותיות מבחינה סטטיסטית, כל תנאי ניסוי דורש מינימום של ארבע חזרות (בארות) בתוך אותו הניסוי, ומינימום של 3 ניסויים בלתי תלויים.

2. הכן את המדיום סלולרי תרבות המכיל מדיום DMEM בתוספת גלוקוז 4.5 גר '/ ל', 15% בסרום שור עוברי, ו -1% סטרפטוקוקוס עט, וחום ל37 מעלות צלזיוס באמבט מים.
3. לדלל אדנוקרצינומה מעי גס אפיתל אנושי (קאקו-2) תאים במדיום סלולרי ומקום200-400 μl של פתרון התא לתוך התא העליון (הפסגה) של להכניס transwell, בצפיפות של 1.5 x 10 ⁵ תאים / ² סנטימטר. למלא את התא התחתון (basolateral) עם 700-900 μl של מדיום סלולרי.
4. תרבות תאים ב37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2, ולחות 95% עבור 16-21 ימים, והחליפו את המדיום בתא העליון ותחתון בכל 3-4 ימים, תוך שימוש באמצעי האחסון שצוין בשלב 1.3. החלף בינוני לפי הסדר הבא כדי לשמור על הלחץ מעל (ולא מתחת) monolayer התא: לשאוב את המדיום מהתא התחתון, לשאוב את המדיום מהחדר העליון, למלא את התא העליון עם מדיום חדש, ולמלא את התא התחתון עם מדיום חדש.

2. אימות של GI אפיתל חדירות המחסום באמצעות Transepithelial חשמל ההתנגדות (Teer) וImmunostaining של צומת הדוקים

1. עבור אחסון לטווח קצר (פחות מ -2 שבועות), לצלול אלקטרודות STX100 בsolu אלקטרוליטtion (.1-.15 M KCl או NaCl). חבר את כבל האלקטרודה ליציאת האלקטרודה במד EVOM וולט אוהם, כך שהמערכת היא קצרה חשמלית באופן פנימי, והוא שמר על הסימטריה האלקטרודה. עבור אחסון לטווח ארוך, לשטוף עם DH ₂ O ולאחסן אותו במצב יבש, כהה.
2. כדי לעקר את האלקטרודות, לטבול באתנול במשך 15 דקות ולאפשר לאוויר יבש ל15 שניות. לחלופין, ניתן לאחסן את האלקטרודות במכסת מנוע UV. יש לשטוף את האלקטרודות בתמיסה סטרילית אלקטרוליט (תמיסת מלח חיץ פוספט, PBS) או .1-0.15 פתרון M KCl או NaCl, לפני כל מדידת התנגדות.
3. עם מד וולט אוהם מוגדר להגדרת ההתנגדות, במאונך למקם את האלקטרודות הבמכילה את תוסף transwell היטב, עם האלקטרודה הקצרה בחדר העליון ואלקטרודה הארוכה בתא התחתון נוגע בתחתית הבאר. לאחר קריאת EVOM תתייצב, להקליט את ערך ההתנגדות (שניתן באוהם; Ω) לכל אחד.
4. חישוב התנגדות (ההתנגדce מנורמל לאזור; Ω × ² סנטימטר) של דגימות על ידי הפחתת התנגדות רקע (Teer של מוסיף transwell ללא תאים) והכפלה בשטח הממברנה. ערכי התנגדות לרוב מדווחים בספרות. (ראה דיון)
5. חזור על מדידות בכל 1-2 ימים עד Teer ערכי עלייה למקסימום ורמה, המצביעים על היווצרותו של מחסום חדירות, אשר בדרך כלל לוקח 2-3 שבועות מרגע platting תא. ערכי המישור Teer וזמן דרוש כדי להשיג את שלמות מחסום עשויים להשתנות בהתאם למספר תא מעבר.
6. כדי לאמת את נוכחותם של צמתים הדוקים בmonolayers תא עם Teer הגבוה (שווה או מעל ערך הסף להיווצרות מחסום), לתקן את התאים על ידי דגירה עם paraformaldehyde 2% קרים במשך 15 דקות. לאחר מכן, לשטוף תאים עם PBS ומדגיר אותן 30 דקות בטמפרטורת חדר עם 1 מיקרוגרם / מיליליטר אנטי occludin. שטוף תאים שוב עם PBS ומדגיר אותן 30 דקות בטמפרטורת חדר עם 7.5 מיקרוגרם / מיליליטר ונוגדנים משני luorescently שכותרת. השתמש בבארות עם Teer נמוך כביקורת שלילית להיווצרות מכשול.

הערה: כתחליף לאנטי occludin, ניתן להשתמש בנוגדנים לחלבוני צומת הדוקים חלופיים.

7. הבלו בזהירות את קרום המסנן שבי monolayer הקבוע מצורף, ולעלות על גבי שקופיות להדמיה באמצעות epifluorescence או confocal.

3. הערכת Transepithelial תחבורה של נשאים ממוקדים

1. תווית נוגדנים (נוגדנים חד שבטיים כנגד עכבר ICAM-1, אנטי ICAM, בדוגמא זו) מיקוד עם ¹²⁵ אני, כפי שתואר בעבר ^7. השתמש assay ברדפורד להעריך ריכוז חלבון ודלפק גמא לקבוע ¹²⁵ אני תוכן בנוגדנים, ואז לחשב את הפעילות הספציפית בספירת לדקה (CPM) / מ"ג של נוגדן שכותרתו.

הערה: כדי לשלוט על הספציפיות, מחדשכבול ההליך על ידי IgG עכבר תיוג, אשר ישמש להכנת NCS המצופה שאינו ממוקד. ללמוד הובלה של מטענים טיפוליים, לחזור על תהליך תיוג המטען, למשל, אלפא Galactosidase (α-Gal) בדוגמא זו. חלופות יכולות לשמש לסוכן המיקוד, שליטה שאינה ספציפית, או מטען טיפולי. גם שיטות חלופיות ניתן להשתמש כדי לתייג תרכובות ולהעריך את הריכוז של עמיתיהם שכותרתו.

2. זוג שכותרת מיקוד נוגדנים (אנטי ICAM בדוגמא שלנו) על פני השטח של NCS. בדוגמא זו, דגירה nanobeads קלקר (קוטר 100 ננומטר) במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר עם ¹²⁵ I-אנטי ICAM לאפשר ספיחת פני השטח, כפי שתואר על ^7.

הערה: לקבלת השליטה שאינה ספציפית להשתמש ¹²⁵ I-IgG. כדי לעקוב אחר שינוע מטענים, להשתמש בשילוב של מיקוד נוגדנים ^ו125 מטען שהכותרת אני (α-גל בדוגמא שלנו).

3. צנטריפוגה ב XG 13,000 במשך 3 דקות ולהסיר את עמיתיהם שאינם מצופים בsupernatant על ידי שאיפה. Resuspend את הכדור המכיל NCS המצופה באמצעות 1% אלבומין בסרום שור (BSA) ב-PBS על ידי pipetting, וsonicate בהספק נמוך כדי לשבש אגרגטים פוטנציאל חלקיקים (20-30 בפולסים קצרים).
4. לאפיון NC, למדוד את הגודל, polydispersity, וζ-פוטנציאלי של חלקיקים מצופים באמצעות פיזור אור דינמי (בעקבות הוראות ספק), ולכמת את מספר ¹²⁵ כותרת מיקוד מולקולות נוגדן (למשל אנטי ICAM) על פני השטח של החלקיקים באמצעות דלפק גמא.

הערה: שיטות אלה ניתן לחזור להעמיתים שאינם ספציפיים וטיפוליים. הגודל של חלקיקים מצופים נע סביב 200 ננומטר.

5. הוספת ¹²⁵ NCS אני נוגדנים, (למשל ¹²⁵ I-אנטי ICAM NCS; 56 NCI / מיליליטר) לתא העליון מעל monolayers המחוברות קאקו-2 עם Teer &# 8805; 350 Ω × ² סנטימטר (ראה דיון) על רקע (16-21 ימים לאחר זריעה). לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך מרווחים אחד או יותר זמן רצוי. מדוד Teer (סעיף 2.3) לפני ואחרי הדגירה כדי להעריך את ההשפעות של NCS במחסום החדירות.

הערה: הליך זה ניתן לחזור להעמיתים שאינם ספציפיים וטיפוליים.

6. אסוף בינוני מהתאים העליונים ותחתונים ולשטוף אותם פעם אחת עם 0.5 מיליליטר DMEM על 37 מעלות צלזיוס (בית עליון) או 1 מיליליטר DH ₂ O (תא תחתון). לאסוף את שוטף למדידה בסך הכל תוכן radioisotope באמצעות דלפק גמא.
7. למדידה של שבריר התא, בלו, המסנן החדיר, למשל באמצעות סכין גילוח כדי לחתוך מסביב לקצוות, ודגירה בצינור דלפק גמא עם 1% טריטון X-100 עבור 10 דקות (כדי לשחרר את תוכן תא), לפני מדידת תא הקשורים רדיואקטיביות סך הכל.
8. כדי למדוד ¹²⁵ אני מחדשבחכירה מNCS במהלך הובלה או עקב הידרדרות פוטנציאלית, התמהיל ראשון 300 μl של מדגם (משברים העליונים, תחתון, או תא) עם 700 μl של BSA 3% ב-PBS ו200 μl חומצת Trichloroacetic (TCA). דגירה בטמפרטורת חדר למשך 15 דקות. בינתיים זה זמן, למדוד את הרדיואקטיביות הכוללת של מדגם זה בדלפק גמא.
9. דגימות TCA צנטריפוגה ב 3,000 XG במשך 5 דקות על מנת להפריד בין חלבון שלם (גלולה) מהחלבון המושפל או ¹²⁵ אני שבריר (supernatant). לכמת את הרדיואקטיביות שלי שבריר ¹²⁵ החופשי ולחסר ערך זה מרדיואקטיביות בסך הכל נמדד לפני צנטריפוגה. זה יספק את כמות החלבון שכותרתו כי הוא לא מושפל.

4. מנגנון של Transepithelial תחבורה של Nanocarriers ממוקד

1. תווית אלבומין עם ¹²⁵ כפי שתוארו בסעיף 3.1 והעבר דיווחה ^7.

הערה: אלבומין הוא 66.5חלבון kDa, ולכן, חומר גדול יחסית. למרות שליטה בתוקף להובלה פסיבית של אובייקטים גדולים יותר (למשל 200 NCS ננומטר משמש כאן), זה צריכה להיות מוחלף עם מולקולות נותב אינרטי קטנים יותר כאשר לומדים הובלה של נשאי תרופות קטנים יותר (ראה דיון).

2. כדי להעריך תחבורת paracellular באמצעות זליגת paracellular אלבומין, קאקו-2 monolayers תרבות על transwell מוסיף כפי שתואר לעיל.
3. למדיום החדר העליון מעל monolayer התא, להוסיף או ¹²⁵ I-אלבומין לבד (ביקורת שלילית המראה את הרמה הבסיסית של דליפה), או ¹²⁵ NCS-ממוקד נוגדן I-אלבומין ולא רדיואקטיבי (כמתואר בסעיף 3.5). לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך מרווח הזמן שנבחר (ים), שאמור להתאים לאלו שנבדקו בעת בדיקת תחבורת NC. מדוד Teer (סעיף 2.3) לפני, במהלך, ואחרי הדגירה, ואז לאסוף את כל השברים ^ל125 אני כולל ^ו125 אני מדידות חופשיות כפי שמצוין. בסעיף 3 הערה: בנוסף בד בבד ¹²⁵ NCS IgG שליטת I-אלבומין ולא רדיואקטיבי עשוי לשמש כביקורת.
4. כביקורת חיובית לפתיחת צמתים אינטר, להוסיף מדיה תא המכילה 5 מ"מ H ₂ O ₂ לתאי העליונים ותחתונים של להכניס transwell, ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. ואז, למדוד Teer (סעיף 2.3) ולהוסיף ¹²⁵ I-אלבומין לחדר העליון למרווחי הזמן שנבחרו. מדוד Teer בנקודות זמן שונים לאורך הדגירה לזהות ריקבון ערך Teer נגרמים על ידי H ₂ O פתיחה מושרה ₂ של צמתים התא.
5. בניסויים מקבילים, להעריך תחבורת transcellular, המכונה גם transcytosis, ¹²⁵ NCS-ממוקד אני על ידי דוגרים קאקו-2 monolayers מחוברות עם או monodansylcadaverine מיקרומטר 50 (MDC; מעכב של אנדוציטוזה בתיווך clathrin), 1 מיקרוגרם / מיליליטר filipin (מעכב של caveolar אנדוציטוזה בתיווך), וורטמן 0.5 מיקרומטרב( מעכב של phosphatidylinositol 3 קינאז [PI3K], מעורב בmacropinocytosis), או 20 מיקרומטר [5 - (N-אתיל-N-איזופרופיל) אמילוריד] (EIPA, מעכב של macropinocytosis ואנדוציטוזה בתיווך CAM ^15).

הערה: ¹²⁵ I-IgG NCS ^ו125 I-אלבומין עשוי לשמש בקרות שליליות להשפעה של מעכבים האלה, ושיטות אחרות (לדוגמא: טכניקות siRNA) עשויות לספק עיכוב בררני יותר.

6. מדוד Teer (סעיף 2.3) לפני, במהלך, ולאחר הדגירה של תאים עם מעכבים וחומרי רדיואקטיבי, כבקרה נוספת להשפעה של מעכבים על חדירות השכבה.

תוצאות

כאימות של מודל התא שלנו ללמוד תחבורת transepithelial של NCS הממוקד, איור 2 מראה כי קאקו-2 monolayers תא מצופה בצפיפות של 1.5 × 10 ⁵ תאים / ² סנטימטר הגיעה מפגש ~ יום 12 ושמר עד יום 18 יושרת monolayer, מסומן על ידי (איור 2 א) Teer. זו קבלה תוקף על ידי הנוכחות של צמתים הדוקי?...

Discussion

שימוש בשיטות שנדונו לעיל, ניתן לקבוע מודל תא לחקר תחבורה של NCS הממוקד על פני מחסומים סלולריים, כמו בדוגמא הניתנת לקאקו-2 תאי אפיתל, שהוא רלוונטי להערכת תחבורה מלומן במערכת העיכול אל הדם במקרה של מערכות להולכת תרופות דרך הפה. Culturing של monolayers תאי אפיתל במערכת העיכול במוסי?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Transwell inserts	BD Falcon	353095
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), 1x	Cellgro	10-013-CM
Fetal Bovine Serum (FBS)	Cellgro	35-015-CV
Pen Strep	Gibco	15140
Human epithelial colorectal adenocarcinoma (Caco-2) cells	ATCC	HTB-37TM
125Iodine	Perkin Elmer	NEZ033H002MC	Radioactive hazard
Phosphate Buffer Saline (PBS)	Gibco	14190-235
Bovine Serum Albumin (BSA)	Equitech Bio	BAH-66
Paraformaldehyde (16%)	Fisher Scientific	15710
Mouse Immunoglobulin G (IgG)	Jackson ImmunoResearch	015-000-003
Mouse monoclonal antibodies to human ICAM-1 (anti-ICAM)	Marlin 1987
α-Galactosidase, from green coffee beans	Sigma	G8507-25UN
FITC latex beads, 100 nm	Polysciences, Inc.	17150
Triton X-100	Sigma	234729-500ML
Trichloroacetic acid (TCA)	Fisher Scientific	SA433-500
Occludin antibody (Y-12), goat polyclonal anti-human	Santa Cruz Biotechnology	Sc-27151
Monodansylcadaverine (MDC)	Sigma	D4008
Filipin	Sigma	F9765
5-(N-ethyl-N-isopropyl) amiloride (EIPA)	Sigma	A3085
Wortmannin	Sigma	W1628
Gamma counter	Perkin Elmer	Wizard2
Volt-ohm meter	World Precision Instruments	EVOM2
TEER electrodes	World Precision Instruments	STX100	Electrodes available for different well-plates
Dynamic Light Scattering (DLS)	Malvern	Nano-ZS90