איתור, חזותי וquantitating הדור של מינים חמצן תגובתי במערכת מודל אמבה

Summary

מתאמנים את סט של פרוטוקולים למדידה של מיני חמצן תגובתי (ROS) שניתן ליישם במודלים סלולריים אמבה ויונקים שונים למחקרים איכותיים וכמותיים.

Abstract

מיני חמצן תגובתי (ROS) מהווים מגוון של מולקולות וקצרות מועד, המכיל חמצן, שהם באופן דינמי interconverted או בוטלו או catalytically או באופן ספונטני. בשל אורך חיים הקצר של רוב ROS והגיוון של מקורותיהם והמגוירים subcellular, ניתן לקבל תמונה שלמה רק על ידי מדידות מדוקדקות באמצעות שילוב של פרוטוקולים. כאן, אנו מציגים סט של שלושה פרוטוקולים שונים באמצעות OxyBurst גרין (OBG) מצופה חרוזים, או dihydroethidium (DHE) וAmplex UltraRed (AUR), כדי לפקח איכותי וכמותית ROS השונים בphagocytes המקצועי כגון Dictyostelium. אנו מותאמים נהלי חרוזים ציפוי וחרוזים מצופים OBG משומשים ומיקרוסקופיה חיות לדמיין דור ROS intraphagosomal דינמי ברמת התא הבודד. זיהינו lipopolysaccharide (LPS) מE. coli כממריץ רב עוצמה לייצור ROS בDictyostelium. בנוסף, אנו דזמן אמת eveloped, מבחני בינוני תפוקה באמצעות DHE וAUR למדוד באופן כמו סופראוקסיד תאיים ו-H ₂ O ₂ תאי ייצור, בהתאמה.

Introduction

מיני חמצן תגובתי (ROS) מעורבים במגוון רחב של תהליכים ביולוגיים כגון הגנת מארחת, איתות, פיתוח רקמות ותגובה לפציעה, כמו גם יתר לחץ דם וסרטן. מכונות מונואמין NADPH phagosomal למדו היטב מוקדשת לדור ROS המהיר, המכונה פרץ חמצוני, כדי להרוג חיידקי בלע בphagosomes 'נויטרופילים ^1. בנוסף, זליגה של אלקטרונים כתוצר לוואי של שרשרת הנשימה במיטוכונדריה חשבה בעבר להיות אחראי אך ורק למקור ללא פיקוח של ROS. אבל לאחרונה, זה זוהה כמנגנון חשוב לתרום להרג intraphagosomal של חיידקים במקרופאגים עכבר ^2. בשנים האחרונות, האמבה החברתית, Dictyostelium, הפכה למודל רב עוצמה והפופולרי ללמוד מנגנונים פנימיים תא של תגובת החיסון המולדת. ואכן, Dictyostelium וphagocytes האנושי לשתף ברמה גבוהה באופן מפתיע של שימור בmoleculaמנגנונים r אחראים לחיידקים חישה, היבלעות והרג ^3,4. Homologs של חלבונים ואנזימים הקשורים לייצור ROS או סילוק רעלים, כגון oxidases NADPH, catalases, dismutases סופראוקסיד, ניתן למצוא בשני בני אדם וDictyostelium. כמו האמבה למדה הטוב ביותר, Dictyostelium מציג מספר יתרונות ייחודיים על פני מערכת מודל של יונקים. הם גדלים בטמפרטורת חדר ללא הצורך בCO _2, עם זמן הכפלה של 8-10 לשעה. הם יכולים להיות כל הזמן בקלות כמו תרבויות חסיד או השעיה. בנוסף, הודות להגנום הפלואידים הרצף מלא והמבואר שלהם, ולמניפולציה גנטית קלה, Dictyostelium הפך אורגניזם מודל ניסיוני מאוד אטרקטיבי.

במחקרים קודמים, נגזרים כלור ופלואור שונים של ההעמסה (הידועה קולקטיבי OxyBurst גרין, OBG) שפולט הקרינה לאחר חמצון על ידי ROS, שימש ככתב ROS. est Cell-permeantנגזרי erified משמשים למדידת ROS cytoplasmic, ואילו או dextran-נגזרי תא impermeant-חלבון בשילוב משמשים למדידת ROS תאי. בפרט, חרוזים מצופים BSA OBG כבר נעשו שימוש כדי לזהות ייצור ROS phagosomal בתאי יונקים ^5. עם זאת, הגישה המבוססת על קורא microplate יכולה רק לתת עקומת דור ROS בממוצע מאוכלוסייה של תאים. עם הפרוטוקול הנוכחי, באמצעות Dictyostelium, תא בלען מקצועי, ותנאי ניסוי מותאמים, אנו מקבלים phagocytosis היציב והיעיל מבלי להטות כל opsonin על חרוזים. DHE נעשה שימוש במערכות שונות מודל, כגון נויטרופילים ומקרופאגים יונקים, כדי לזהות ייצור ROS ^6-9. בינתיים, יש כמה מחלוקות על הסגוליות והרגישות של ^8,10 השיטה. כמו גרסה משופרת של Amplex אדום, עוצמת הקרינה של AUR הוא פחות רגיש לחומציות, מה שהופך אותו מתאימים יותר למדידהROS בחוגי nonneutral או חומצי חלש. AUR הוחל לאחרונה במספר מערכות של יונקים ^11,12, אך השימוש בו בדגמי nonmammalian, אשר לעתים קרובות דורשים תקשורת צמיחת חומצי חלש, לא דווח עד כה. בנוסף, אין פרוטוקול שפורסם כמותית ודינמית למדידת ייצור ROS ולוקליזציה באמבה החברתית Dictyostelium.

המטרה של הקבוצה של פרוטוקולים שהוצגה היא לספק פתרון קל ותכליתי כדי לפקח ROS שונים והלוקליזציה שלהם, ועוד יותר לתת תובנות מנגנונים תאיים הקשורים ל-ROS. עבור assay OBG, השתמשנו במיקרוסקופ חי כדי לפקח על כל התהליך של דור ROS phagosomal לאחר הספיגה של חרוזים מצופים OBG ידי תאי Dictyostelium, וסיפק גישה חדשה כדי ללמוד את מנגנון הרג intraphagosomal של חיידקים. יש לנו אופטימיזציה מבחני DHE וAUR בינוני תפוקה בDictyostelium, למדוד superox תאיתIDE ו-H ₂ O ₂ תאי ייצור, בהתאמה, על ידי שימוש בLPS כממריץ ROS חזק. שים לב שLPS הוצג לאחרונה על הגדלת פעילות bactericidal של Dictyostelium כלפי חיידקי phagocytosed ^13. בנוסף, הטיפול בDEDTC וקטלאז במפורש אישר כי שתי השיטות הללו באופן ספציפי למדוד סוגים שונים ומגויר subcellular של ROS בDictyostelium. לבסוף, assay OBG יכול להיות מותאם לכל תא phagocytic חסיד, על ידי opsonizing נוסף חרוזים עם ligands לקולטנים phagocytic של תאי חיים. באופן עקרוני, מבחני DHE וAUR יכולים להיות גם למדידות בכל תא חסיד או nonadherent תחת תנאי ניסוי מתאימים מכויל.

Protocol

1. ויזואליזציה ומדידה איכותית של ROS הייצור בPhagosomes

צריכים להיות מוכנים חרוזים מצופים OBG מראש. נהלי ציפוי חרוזים וטכניקת כיסוי אגר מעובדים מאזכור פורסם ^5,14.

1. הוסף 1 מיליליטר של השעיה 3.0 מיקרומטר חרוזים carboxylated סיליקה (כ 1.8 x 10 ⁹ חרוזים) לתוך צינור 1.5 מיליליטר, לשטוף את החרוזים 3x עם 1 מיליליטר של PBS על ידי ספין וvortexing מהירים.
2. Resuspend את החרוזים 1 מיליליטר של PBS המכיל 25 מ"ג / מיליליטר cyanamide (כדי להפעיל את חרוזים סיליקה carboxylated לקוולנטית לאגד prelabeled BSA), דגירה על גלגלים ל15 דקות.
3. 3x לשטוף עם 1 מיליליטר של חיץ צימוד (0.1 borate M נתרן, pH 8.0) על ידי מהיר ספין (צנטריפוגות במלוא המהירות בצנטריפוגה מיני בראש הטבלה למשך 5 שניות או לחלופין צנטריפוגות XG ב 2000 דקות 1 בצנטריפוגה בראש טבלה) ו vortexing להסיר cyanamide העודף.
4. מערבבים את חרוזים נשטפו עם 500 μl של גoupling מאגר המכיל 1 מ"ג של OxyBurst גרין (OBG) H2HFF (Dihydro-2 ', 4,5,6,7,7'-hexafluorofluorescein)-BSA, למלא את הצינור עם גז חנקן מגז יכול סטנדרטי לפני הסגירה, ו לדגור על גלגלים ל14 שעה (לילה) בשעה RT בחושך.
5. שטוף את החרוזים 2x עם 1 מיליליטר של מרווה חיץ (250 מ"מ glycin PBS) כדי להסיר OBG unreacted, ופעמים עם חיץ צימוד כדי להסיר את חיץ מרווה ידי ספין וvortexing מהירים.
6. הוסף 1 מיליליטר של חיץ צימוד המכיל 50 מיקרוגרם של אסתר 594 succinimidyl אלקסה פלואוריד כדי להטות לארגון ה-BSA. מלא את הצינור עם חנקן לפני הסגירה, ולדגור על גלגלים ל1.5 שעות בטמפרטורת חדר בחושך.
7. שטוף את החרוזים 3x עם 1 מיליליטר של מרווה חיץ ידי ספין וvortexing כדי לעצור את התגובה מהיר, ולאחר מכן לשטוף את החרוזים 3x עם 1 מיליליטר של PBS על ידי ספין וvortexing מהירים.
8. לבסוף, resuspend את החרוזים 1 מיליליטר של PBS עם 2 μl של 10% w / v אזיד עבור אחסון לטווח ארוך. מדוד את concentration של חרוזים בהשעיה עם hemocytometer (בדרך כלל סביב 1-2 x 10 ⁹ חרוזים / ml), למלא את הצינור עם חנקן לפני הסגירה, ולאחסן ב 4 ° C בחושך.
9. יעילות הציפוי של העמסת OBG ניתן לבדוק על ידי בדיקת ספקטרום הפליטה באמצעות עירור ב500 ננומטר. כאשר חמצון על ידי H ₂ O ₂ בנוכחות חזרת peroxidase (HRP), עוצמת הקרינה של חרוזים חמצון, בשיא פליטה (538 ננומטר), היא גבוהה יותר 11-12x יותר מזה של חרוזים מצופים nonoxidized.
10. הקציר גדל באופן אקספוננציאלי תאי Dictyostelium מצלחת פטרי 10 סנטימטר, צלחת צפיפויות שונות של תאים על 3 מנות סנטימטר עם פלסטיק ברור אופטי או בתחתית כוס, ולגדל אותם בין לילה. בחר את המנות שהן מחוברות% על 80 לצורך הניסוי. פרוטוקול מפורט לטיפוח תאי Dictyostelium כבר פורסם ^15.
11. החלף את מדיום התרבות עם מדיום LoFlo (בינוני LF), דגירה של2 שעות לפני הניסוי על מנת להקטין את autofluorescence תאי וintraendosomal של מדיום תרבות HL5C.
12. במקביל, להמס 10 מיליליטר 1.5% אגר bacto במדיום LF, יוצק אגר על גבי משטח שטוח (כלומר צלחת זכוכית של 10 סנטימטר x 10 סנטימטר) כדי ליצור שכבה אגר על 1 מ"מ עובי, להמתין ל10-15 דקות כדי לחזק. חותכים את השכבה אגר לתוך 2 ס"מ X 2 סנטימטר ריבועים ומקום במדיום LF לשימוש מאוחר יותר.
13. בינתיים מכין את ספינינג הדיסק או מיקרוסקופ שדה רחב, לקבוע את הטמפרטורה של החדר הסביבתי ב22 ° C ולהתאים את ההגדרות לניסוי זה. (ראה הערות נוספות בדיון).
14. לאחר 2 שעות של דגירה, לשאוב את מדיום LF מצלחת 3 סנטימטר, אבל monolayer התא עדיין צריך להיות מכוסה על ידי שכבה דקה של מדיום. לדלל את חרוזים מצופים ל1.5 x 10 ⁷ מיליליטר / חרוזים, ולהוסיף 10 μl על שכבת התא.
15. קח גיליון אגר מרובע אחד, ניקוז נוזל עודף אבל לשמור על רטוב. בעדינות לשים את הכיכר אגר דואר על גבי שכבת התאים. אל תזיז את הכיכר אגר כאשר הוא שוכב על התאים. הכיסוי אגר משמש להגברת קשר בין חרוזים ותאים, ובכך לשפר את הספיגה, וזה גם מעט דוחס את התאים, שמירה טובה יותר להם במישור המוקד של המטרה.
16. מניחים את המכסה על הצלחת, מניח אותו על הבמה מיקרוסקופ, ובאופן אוטומטי לצלם בערוצים האדומים, ירוק ושלב כל 1 דקות לשעה 2 או יותר.
17. בחר ולהתמקד באירועים סלולריים המכילים את כל התהליך של phagocytosis. מיזוג 3 הערוצים מותאמים ולהרכיב את התמונות לסרט באמצעות תוכנת עיבוד תמונה מקצועית. לכמת עוצמות הקרינה של כל חרוזים שנבחרו בערוצים אדומים וירוקים, והיחס ירוק / אדום ישקף את ייצור ROS phagosomal הדינמי של התאים.

2. מדידת תפוקה בינונית כמותי ושל תאית Superoxide הפקה

1. לאסוף one 80% צלחת ומחוברות של Dictyostelium ב10 מיליליטר של מדיום HL5C. צנטריפוגה תאי Dictyostelium ב850 XG במשך 5 דקות, בזהירות ובינוני עודפים לשאוב לחלוטין. תאי resuspend במאגר SS6.4 [0.12 M סורביטול במאגר סורנסן (14.69 מ"מ KH ₂ PO ₄ ו6.27 מ"מ Na ₂ HPO _4), pH 6.4], לספור תאים ו לדלל את צפיפות סופית של 6 x 10 ⁶ תאים / מיליליטר (ראה הערות נוספות בדיון).
2. הוסף 50 μl של השעיה תא לתוך באר כל צלחת לא שקופה לבנה 96 היטב (ראה הערות נוספות בדיון).
3. לדלל מניות DHE (30 מ"מ DMSO) קיפול 500 עם SS6.4, פיפטה 50 μl של DHE המדולל לזה גם בעזרת פיפטה רבה במידת צורך. הריכוז הסופי של DHE הוא 30 מיקרומטר. התגובה מתחילה באופן מיידי.
4. ניתן להוסיף גירויים או מעכבים, בשלב זה, או בנקודות זמן אחרות בהתאם לצרכים ספציפיים.
5. השתמש בסופו של דבר הנקודה "ראש הקריאה & #34; מצב של קורא microplate הקרינה, עם עירור הקרינה / פליטה ב522 ננומטר nm/605, לקרוא כל 2 דקות לשעה 1, לנער בינוני 5 שניות / דקות, על 22 ° C.

3. הפקת H כמותי ותפוקה גבוהה מדידה של תאי ₂ O ₂

1. בצע את השלבים כפי שתואר ב2.1 ו2.2.
2. הכן HRP המדולל על ידי הוספת 5 μl של מניית HRP (100 U / ml במים מזוקקים) ל10 מיליליטר של SS6.4, מערבולת או להפוך את הצינור לערבב היטב ולשמור על קרח לשימוש מאוחר יותר. פתרון HRP בדילול מלא הוא ב0.05 U / ml.
3. מכין את תערובת תגובת AUR ידי ערבוב מניית AUR (10 מ"מ AUR DMSO) ופתרון HRP המדולל למאגר SS6.4 לריכוזים הסופיים של 6.25 מיקרומטר, ו0.005 U / ml, בהתאמה. כדוגמא, כדי להכין את תערובת התגובה ל40 תגובות, לערבב 1600 μl של SS6.4 עם 400 μl של HRP בדילול מלא ו2.5 μl של פתרון מניות AUR.
4. הוסף 50 μl תמהיל AURture לזה גם בעזרת פיפטה רבה במידת צורך. עכשיו מתחילה להיוצר התגובה.
5. ניתן להוסיף גירויים או מעכבים, בשלב זה, או בנקודות זמן אחרות בהתאם לצרכים ספציפיים.
6. השתמש במצב נקודת הסיום "הקריאה הראשונה" של קורא צלחת מיקרו הקרינה, עם עירור הקרינה / פליטה ב530 nm/590 ננומטר, לקרוא כל 2 דקות לשעה 1, לנער בינוני 5 שניות / דקות, על 22 ° C.

תוצאות

הדור של ROS בphagosomes ניתן דמיינו איכותי ודינמי על ידי מיקרוסקופ (S1 קובץ). הקרינה האדומה הנפלטת על ידי Alexa פלואוריד 594 היא pH-רגיש ונשאר קבוע בסביבת phagosomal, בעוד חמצון של OBG מגביר הקרינה שלו במסלול הירוק. ספקטרום הפליטה של במבחנה מתחמצן וחרוזים מצופים OBG nonoxidized מו...

Discussion

בהשוואה לשיטות שתוארו קודם לכן, assay OBG דינמי מדמיין את התהליך של יצירת ROS phagosomal ברמת התא הבודד, במקום למדוד אות ROS ממוצעת מאוכלוסייה של תאים. שיטות אוכלוסיית מיצוע כאלה נוטים לטשטש מידע קריטי הנגרם על ידי phagocytosis nonsynchronous. אנחנו הסתגלנו בהצלחה מבחני DHE וAUR לDictyostelium ומ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
OxyBURST Green H2HFF BSA	Invitrogen	O-13291
Alexa Fluor 594	Invitrogen	A-20004
Carboxylated silica beads	Kisker Biotech	PSi-3.0COOH
HL5C medium	ForMedium	HLC0102
LoFlo medium	ForMedium	LF1001
Bacto agar	BD	204010
Dihydroethidium	Sigma	37291-25MG
Amplex UltraRed	Invitrogen	A36006
Horseradish peroxidase	Roche	10108090001
Diethyldithiocarbamate (DEDTC)	Sigma	D3506-100G
Catalase	Sigma	C9322-1G
Cyanamide	Sigma	187364-25G
Lipopolysaccharides	Sigma	L2630-25G
EQUIPMENT
ibidi μ-Dish 35 mm, high	ibidi	81156	Bottom made of optically clear plastic
MatTek dish 35 mm	MatTek corporation	P35G-1.5-14-C	Bottom made of a glass coverslip
Scepter Cell Counter	Merck Millipore	PHCC00000
White 96 well plate	Nunc	236108
Centrifuge	SORVALL	Legend RT
Microplate reader	BioTek	Synergy Mx