הערכה טרום קלינית של מעכבי טירוזין קינאז לטיפול בלוקמיה חריפה

Summary

טירוזין קינאז רצפטור באים לידי ביטוי ectopically בסוגי סרטן רבים וזוהו כמטרות טיפוליות בלוקמיה חריפה. כתב יד זה מתאר אסטרטגיה יעילה להערכה טרום קלינית של מעכבי טירוזין קינאז לטיפול בלוקמיה חריפה.

Abstract

טירוזין קינאז רצפטור היה מעורב בפיתוח וההתקדמות של סרטן רבים, כולל שני לוקמיה וגידולים מוצקים, והם מטרות טיפוליות druggable אטרקטיביים. כאן אנו מתארים אסטרטגית ארבעת שלבים יעילים להערכה טרום קלינית של מעכבי טירוזין קינאז (TKIs) בטיפול בלוקמיה חריפה. בתחילה, ניתוח כתם מערבי משמש כדי לאשר את עיכוב היעד בתאים לוקמיה בתרבית. פעילות פונקציונלית אז הוא הוערך באמצעות מבחני clonogenic בmethylcellulose או תרבויות אגר רכות. תרכובות ניסיוניות המדגימות פעילות במבחני תרבית תאים מוערכות in vivo באמצעות עכברי NOD-SCID-גמא (NSG) המושתלים orthotopically עם שורות תאים לוקמיה. במחקרי vivo pharmacodynamic ראשוניים להעריך עיכוב יעד בתקיעות leukemic מבודדת ממח העצם. גישה זו משמשת כדי לקבוע את המינון ואת לוח זמנים של ממשל נדרש ללעכב יעד אפקטיבייון. מחקרים מאוחרים יותר להעריך את היעילות של TKIs in vivo באמצעות לוציפראז לבטא בתאי סרטן דם, ובכך לאפשר לניטור bioluminescent לא פולשנית של נטל לוקמיה והערכת התגובה לטיפול באמצעות vivo מערכת הדמיה פליטת אור ב. אסטרטגיה זו הייתה יעילה להערכה של TKIs במבחנה in vivo ויכולה להיות מיושמת לצורך זיהוי של סוכנים ממוקדים מולקולריים עם פוטנציאל טיפולי או להשוואה ולתעדוף ישירים של תרכובות מרובות.

Introduction

לוקמיה לימפובלסטית חריפה (ALL) היא המחלה ממארת השכיחה ביותר בקרב ילדי ^1,2. שיעור ההישרדות הכללי עבור כל ילדים B-שושלת (B-ALL) הוא כ 85%, אך תת ספציפיים ביולוגיים, כולל T-שושלת ALL (T-ALL), יש לי הפרוגנוזה עדיין עני יותר אפילו עם פרוטוקולים טיפוליים הנוכחיים. טיפול נוסף של ALL הישנות עדיין מהווה אתגר ^3. למרות שהרוב המכריע של חולים מבוגרים עם לוקמיה חריפה להשיג הפוגה עם כימותרפיה-up מול, חולים רבים עדיין סובלים הישנות ^4. משטרים כימותרפיות הנוכחיים בטיפול בלוקמיה חריפה ידועים כגורמים לתופעות לוואי לטווח קצר וארוך הקשורים ברעילות. לכן, טיפולים פחות רעילים שמתמקדים בתאי סרטן עם השפעה מינימאלית על רקמות נורמליות יש צורך במידה רבה. בשנים האחרונות, הושם דגש על הפיתוח של רומן, סוכנים מולקולריים ממוקדים עם סגוליות לתאי סרטן, לעתים קרובות תוך שימוש בכימיה איטרטיביכדי לייצר חומרים פעילים רבים אשר חייבים לאחר מכן להשוות ועדיף ^5. כתב יד זה מתאר אסטרטגיה יעילה להערכה טרום קלינית של TKIs לטיפול בלוקמיה חריפה, שניתן להשתמש בם לצורך ההערכה של תרכובת בודדת או להשוואה ישירה של תרכובות מרובות על מנת להקל על פיתוח תרופה.

השיטה המוצגת כאן מורכבת מארבעה שלבים. ראשון ביוכימי (1) ונגד לוקמיה (2) פעילות של המתחם (ים) מוערכות בתרבית תאים, ולאחר מכן עיכוב של היעד אישר בדגמים (3) בעלי חיים, ויעילות לבסוף טיפולית של TKI (ים) נקבע במודלי xenograft לוקמיה orthotopic (4). למחקרים אלה, חשוב לבחור שורות תאים רלוונטיות, שהם נציגים של תת הביולוגיים הנפוצים ביותר. שורות תאים יש לבחור, ששניהם, מבטאים את היעד של עניין ואין להם את היעד של ריבית, כדי לבדוק האם הם med השפעות ביולוגיותiated על ידי עיכוב של היעד. זה רלוונטי במיוחד לפיתוח של מעכבי מולקולה קטנים, שיש לי מחוץ יעד תופעות שעשויות להיות חשוב לפעילות אנטי סרטניים. כמו כן יש לבחור שורת תאים שתלויה ביעד להשפעות פונקציונליות, כגון ריבוי או הישרדות. מחקרים ראשוניים אימות היעד (מחוץ להיקף של מאמר זה) באמצעות התערבות RNA או באמצעים ספציפיים אחרים כדי לעכב את היעד יכולים לשמש כדי לזהות שורות תאי יעד תלוי. כמו כן, רצוי לבחור שורות תאים שיכולים ליצור xenografts העכברית, כך שתוצאות תרבית תאים יכולות להיות באופן ישיר יותר בתרגום לin vivo ניסויים.

להערכה של פעילות ביוכימית בתיווכו של TKIs בתאי סרטן דם, ירידה בזרחון הקולטן יכולה לשמש כאינדיקציה לעיכוב היעד. יכולים להיות מועסקים מבחני ניתוח כתם מערבי או ELISA, בהתאם לזמינות והספציפיות של נוגדנים.אם נוגדנים עם סגוליות מספיק ליעד זמינים, מבחני ELISA עדיפים כפי שהם יותר כמוני ויעילים. במקרים בהם נוגדנים עם סגוליות מספיק עבור ELISA אינם זמינים, ניתוח כתם מערבי עשוי להיות נחוץ. במקרה זה, immunoprecipitation של כמות גדולה של lysate יכולה להיות שימושית לזיהוי של מטרות שנמצאות בשפע נמוך. גישה זו היא רלוונטית במיוחד למדידת phospho-חלבונים, אשר עשוי להיות זמן מחצית חיים קצרים, כדי לאפשר לשינויים מהירים באיתות בתגובה לגירויים סביבתיים. כמה חלבוני פוספורילציה הם יציבים מאוד, סביר להניח כתוצאה מהיווצרות מורכבת עם phosphatases. לגילוי חזק ועקבי של חלבוני פוספורילציה האלה, זה יכול להיות גם אפשרי לטיפול בתאים עם pervanadate, מעכב החלבון phosphatase-טירוזין בלתי הפיך ^6, כדי לייצב את phospho החלבון לפני הכנת lysates תא כולו.

אללקבוע אם פעילות ביוכימית תוצאות בהשפעות אנטי סרטניים, ניתן לנטר תהליכים ביולוגיים היעד תלוי בניסויים מבוססי תאים. לשורות תאי סרטן דם, פעילות אנטי לוקמיה בתיווכו של TKIs ניתן להעריך באמצעות מבחני הקמת המושבה בוצעו בmethylcellulose או רך אגר ^7. אגר רך עשויים להיות מועדף כמו זה הוא מדיום מוצק כי הוא יותר נוח למניפולציה אם טיפול חוזר ונשנה עם TKI הוא הכרחי. בעוד רבים שורות תאים לוקמיה myloid (AML) חריפות תהווה מושבות באגר רך, רוב כל שורות תאים רק ליצור מושבות בmethylcellulose, שהיא מדיום מוצק למחצה. למרות שניתן לרענן בינוני ו / או TKIs בתרבויות methylcellulose, ניתן להשתמש בם רק בנפחים קטנים ובתדירות מוגבלת. כמו כן, קשה יותר כדי להכתים מושבות מבלי לשבש אותם בmethylcellulose. מחקרים ראשוניים צריכים להגדיר את היכולת של שורות תאים מתאימות כדי ליצור מושבות בmethylcellulose ו / או אגר ולא רכיםהוא צפיפות אופטימלית של תאים בתרבית כך שהמושבות הן שאינן חופפות ובמספר מספיק כדי להשיג סטטיסטי הנתונים רלוונטיים (בדרך כלל 50-200 מושבות בכל צלחת 35 מ"מ).

בעוד שבמבחני חוץ גופית הם חזקים וחסכוניים, ויש פחות השלכות אתיות מאשר ניסויים בבעלי חיים כולו, קידום של תרכובות טיפוליות דורשת הוכחת היעילות ובטיחות במודלים של בעלי חיים. במחקרי vivo, שורות תאים לוקמיה חריפות אנושיות ניתן להשתיל orthotopically ^לSCID NOD.Cg-Prkdc אני l2rg ^tm1Wjl / SzJ עכברים (NSG) וTKIs יכולים להינתן בקלות על ידי הזרקה או gavage האוראלי. שורות תאים מסוימות עשויות לדרוש חשיפה של עכברי NSG למנת שורה תלויה נמוכה של קרינה סלולרי על מנת שxenografts להקים, ובמקרה הזה עכברים לא יכולים לסבול gavage האוראלי ללא תקופת ההחלמה 5-10 יום שלאחר הקרנה. כתב יד זה מתאר דור של B-ALL ו-T-ALL xenografts באמצעותקווי תאים ספציפיים (697 וJurkat) כדוגמאות אבל xenografts ניתן להקים בעכברי NSG תוך שימוש במגוון רחב של שורות תאים. במקרה ששורות תאים אחרים הן ישימות יותר, הדרישה להקרנה, מספר אופטימלי של תאים להשתלה, ועיתוי של תחילת מחלה והתקדמות צריכה להיקבע באופן ניסיוני. באופן אידיאלי, דגמים אלה יהיו penetrance מלאה (כל בעל חיים המושתלים מתפתח לוקמיה), קינטיקה העקבית (לוקמיה מתקדמת באופן דומה בכל בעלי החיים), וחלון טיפול סביר (באופן אידיאלי 20-30 ימים שבין תחילת טיפול וההסרה ממחקר בשל מחלה) . מספר התאים המושתלים יכול להיות מוגבר כדי לשפר penetrance ועקביות קינטית או ירד כדי לשפר את חלון הטיפול במידת צורך.

כדי לקבוע אם TKIs לתווך עיכוב יעד in vivo, דגימות שנאספו מעכברים עם xenografts לוקמיה לאחר טיפול עם TKI או כלי רכב בלבד. באופן אידיאלי, במינוןלוח הזמנים של ד של ממשל לניסויים אלה מודרכים על ידי מחקרי פרמקוקינטיקה, אשר לעתים קרובות יכול להיות מבוצעים על ידי מעבדות מסחריות ומחוץ להיקף של מאמר זה. אם הנתונים הפרמקוקינטי זמינים, הריכוז של תרכובת הנדרשת לעיכוב יעיל יעד בתרבית תאים והריכוז בסרום המרבי הבאים מנה בודדת של TKI ניתן להשתמש כדי להגדיר את המינון ההתחלתי למחקרים בבעלי חיים. מחקרי פרמקוקינטיקה גם יכולים ליידע את העיתוי של איסוף דגימה לאחר טיפול ללימודי pharmacodynamic והתוואי של ממשל. עיכוב של היעד ניתן להעריך בכל איבר מושפע אך רקמות שנאספות בקלות ומעובד עדיפות. שורות תאים לוקמיה חריפות ביותר להקים בכבד, מח עצם, במערכת העצבים המרכזית הטחול, דם היקפי, ואף האיברים הספציפיים השפיעו ואת מידת קליטתם באיברים אלה משתנה בין דגמים. הפרוטוקול המובא כאן מעריך phosphעיכוב o-חלבון במח עצם באמצעות ניתוח כתם מערבי, אבל איברים מוצקים עשוי להיות קל יותר למסוק באופן עקבי ודורש עיבוד מינימאלי או לא לפני ההקפאה, ומאפשר פחות הזדמנויות לשפלה של phospho-חלבונים במהלך איסוף דגימה ועיבוד. גם אימונוהיסטוכימיה ניתן להשתמש כדי להעריך את גידולים או איברים מושפעים מלוקמיה מוצקים.

לבסוף, היעילות הטיפולית של TKI (ים) נקבעה במודלי xenograft לוקמיה orthotopic. למחקרים אלה, התזמון של תחילת טיפול יכול להיות מגוון, כך שהמחלה היא מבוססת יותר או פחות. טיפול עשוי להתחיל מייד לאחר השתלה למחקרים ראשוניים ולאחר מכן יעוכב במחקרים הבאים עד נטל מחלה משמעותית מזוהה משוער מודל טיפול אבחון באופן הדוק יותר. באופן אידיאלי, יש גם מודלים של בעלי החיים אלה את היכולת למדידה לא פולשנית של נטל מחלה. יש לנו אופטימיזציה שיטות לכניסתה של לוציפר הגחליליתגן ASE לתוך שורות תאים לוקמיה באמצעות חלקיקים כמו וירוס, המאפשר ניתוח לא פולשני, אורך של התפרצות מחלה והתקדמות והערכה של נטל מחלה במח עצם ובאיברים מוצקים. קריטי לגישה זו הוא השימוש בשורות תאים מתויג לוציפראז חד שבטיים למניעת שונות בהתפתחות של לוקמיה-להביע לוציפראז הקשורים לשימוש של שורות תאי polyclonal ואינו קשור לטיפול בTKI ^8.

יחדיו, יכולים לשמש את השלבים הבאים להערכת TKI בודד או להשוואה ודירוג ישירים של TKIs מרובה. בעוד הפרוטוקולים שהוצגו כאן מתמקדים בפיתוח של TKIs, ניתן להתאים שיטות אלה למטרות אחרות ושיקולים לפיתוח assay מתוארים. לפיכך, אסטרטגיה זו עשויה להיות רחבה יותר ישים להערכה טרום הקלינית של סוכנים ממוקדים מולקולריים לטיפול בלוקמיה חריפה.

Protocol

כל הניסויים מעורבים חיות בעקבות תקני הרגולציה אושרו על ידי האוניברסיטה של ​​ועדת טיפול בבעלי חיים ושימוש המוסדי קולורדו. הפרוטוקול הפגין אושר על ידי האוניברסיטה של ​​ועדת טיפול בבעלי חיים ושימוש המוסדי קולורדו.

1. Phospho חלבון כתם המערבי

1. הכנת lysates
   1. שורות תאים המבטאות את תרבות טירוזין קינאז רצפטור של עניין. קציר תאים וצלחת 3-5 x 10 ⁶ תאים / מדגם ב400 מדיום גידול μl בצלחת תרבית רקמה 48 היטב. לדגור על 37 ° C ב 5% CO ₂ למשך 2-3 שעות.
   2. הוספה של פתרון 5x TKI 100 μl במדיום גידול ודגירה של 60 דקות.
   3. הכן מאגר תמוגה עם 50 HEPES מ"מ (pH 7.5), 150 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10% (v / v) גליצרול, 1% (v / v) טריטון X-100, ומעכבי פרוטאז. אם תרבויות לא יטופלו עם pervanadate לפני הקציר, להוסיף מעכבי phosphatase (orthova נתרן 1 מ"מmolybdate nadate ו0.1 מ"מ נתרן) למאגר תמוגה.
   4. הכן pervanadate (PV) פתרון מעכב phosphatase מייד לפני השימוש. הכן פתרון 0.3% של מי חמצן (זהירות) בפוספט שנאגרו מלוח קר (PBS) בצינור כהה על קרח (1:100 דילול של מניות פתרון 30%). מרתיחים aliquot של 0.2 M orthovanadate נתרן פתרון מניות (OV, זהירות) במשך 5 דקות. לדלל 1:10 ב PBS לעשות 20 פתרון מ"מ OV בטמפרטורת חדר (RT). מערבבים 0.3% מי חמצן ו20 מ"מ OV 1:1 ו דגירה בחושך ב RT עבור 20 דקות.
   5. לדלל PV לבינוני מלא (60 PV μl + 940 בינוני μl). הוספה של PV בדילול מלא / 100 μl כן. לדגור על 37 ° C ב 5% CO ₂ למשך 3 דקות ולאחר מכן למקם את הצלחת על קרח.
   6. קציר התאים בצינורות microfuge קרים ב2,500 סל"ד במשך 5 דקות. לשאוב supernatant ותאי resuspend ב 120 μl של חיץ תמוגה. לדגור על קרח במשך 15 דקות. להבהיר את lysate בmicrofuge קרים ב6,000 סל"ד למשך 3 דקות. העבר supernatant לצינור קר טרי. חנות ב -80 ° C.
2. Immunoprecipitation
   1. ספין למטה חרוזים sepharose G חלבון בmicrofuge ב1,000 סל"ד דקות 1. הסר supernatant ולשטוף את חרוזים 2x עם 1 מיליליטר PBS הקר. הוסף נפח שווה של PBS לעשות slurry 50%. הוספת נוגדן ראשוני ו20 μl חרוזים G חלבון 50% לכל דגימה. דגירה עבור שעה 2 - O / N ב 4 ° C על הכתף.
   2. דופק את חרוזים בmicrofuge קרים ב9,000 סל"ד. הסר supernatant ולשטוף את חרוזים 2x עם 150 μl מאגר תמוגה הקרה. ספין בmicrofuge הקרים ב1,000 סל"ד דקות 1. הסר supernatant וגלול resuspend ב 20 לדוגמא 2X SDS μl הצפת עם 2-mercaptoethanol (זהירות). השתמש באופן מיידי או בחנות ב -80 ° C.
   3. דגימות מרתיחים במשך 5 דקות ולרוץ על ג'ל טריס-גליצין-SDS. מעביר את החלבונים לממברנה ניטרוצלולוזה ולזהות phospho-חלבון על ידי כתם מערבי.
   4. יש לשטוף את הכתם עם מים ולאחר מכן לדגור ב2% SDS, 62.5 מ"מ טריס (pH 6.8), 0.M 1 β-mercaptoethanol (זהירות) ל30 דקות ב50 ° C. יש לשטוף 2x עם מים ולאחר מכן לשטוף ל60-90 דקות ב5-6 שינויים של TBS-T כדי להסיר הפשטת פתרון.
   5. זיהוי מוחלט של חלבון על ידי כתם מערבי.

2. Assay methylcellulose

1. Aliquot 4 מיליליטר של מדיום בסיס האנושי methylcellulose ל50 מיליליטר צינורות חרוטי באמצעות מחט סטרילית סוף גדול נשא בוטה. (הערה:. ניתן aliquoted Methylcellulose ומאוחסן ב -20 ° C. הפשירו ב RT O / N לפני השימוש)
2. הוסף 500 μl של 10x TKI או רכב במדיום גידול ל4 מיליליטר של methylcellulose ותערובת מערבולת 10 שניות.
3. קציר ותאי ספירה. הכן את ההשעיה תא במדיום גידול בריכוז, שהוא גבוה יותר מאשר 10x ריכוז התא הסופי. הוסף השעיה תא 500 μl לתערובת methylcellulose. ורטקס עבור 10 שניות ולתת לשבת במשך 10 דקות כדי להסיר בועות.
4. צייר את 4 מיליליטר של תערובת methylcellulose באמצעות מזרק 5 מיליליטר וlarg סטריליהדואר נשא מחט הסוף בוטה. הימנע מעריכת בועות. לוותר על 1 מיליליטר של תערובת methylcellulose למרכז שלוש צלחות תרבית רקמת 35 מ"מ. לערבל את המנות עד שהתחתית מכוסה לחלוטין עם methylcellulose.
5. לכל צלחת methylcellulose, להכין צלחת תרבות 10 סנטימטר סטרילי רקמות עם שתי צלחות נוספות 35 מ"מ רקמת תרבות מלאים במים סטריליים כדי להבטיח סביבה לחה. תרבויות מקום במים במעייל החממה ב 37 ° C ב 5% CO _{2 למשך} 10-14 יום.
6. ספירת מושבות לאחר 1-2 שבועות. מושבות צריכים להיות יותר מ 20 תאים ולא חופפים. ניתן לספור מושבות באמצעות מיקרוסקופ הפוכה מצוידת בבמה מיקרוסקופ עם רשת או באמצעות דלפק מושבה אוטומטית. שינויים בגודל מושבה או במורפולוגיה בתגובה לטיפול עם TKI גם צריכים להיות מוערכים. כדי לשפר את זיהוי על ידי מונה מושבה, מושבות כתם על ידי הוספת 60-100 μl של (3 - (4,5-דימתיל-2-thiazolyl) -2,5-diphenyl-2H-tetrazolium סול ברומידution (MTT, 5 מ"ג / מיליליטר H ₂ O, החנות ב -20 ° C, להגן מפני אור, זהירות) טיפה חכמה על פני כל צלחת ודוגר במשך 8 שעות ב 37 ° C ב 5% CO _2.

3. רך אגר Assay

1. הכן 1% אגר אצילי לשכבת תחתונה, 0.7% אגר אצילי לשכבת עליונה ו2x מדיום גידול. לאזן מדיום גידול 2x באמבט מים 42 מעלות צלזיוס. מחממים 1% ו0.7% אגר אצילי במיקרוגל (כ 1 מיליליטר min/100) ולאזן באמבט מים 42 מעלות צלזיוס. לערבב חלקים שווים של אגר 1% ובינוניים 2x ובנפרד אגר 0.7% ובינוניים 2x ב50 conicals מיליליטר. תכנית 10 מיליליטר של תערובת / צלחת שש היטב אגר רכה לכל שכבה.
2. צלחות תרבית רקמת 6 גם לייבל. ממלא כל היטב עם 1.5 מיליליטר 1% תערובת אגר רכה. למנוע בועות בציפוי. צלחות יבשים עם מכסים מעל במכסת מנוע סטרילית ל30 דקות.
3. ספירת תאים. הכן את ההשעיה תא במדיום גידול בריכוז, שהוא גבוה יותר מאשר 500x concentrati התא הסופיהלאה. הוסף השעיה תא ל0.7% תערובת אגר, מערבב היטב ולוותר 1.5 מיליליטר של תערובת התאים אגר על החלק העליון של השכבה אגר 1%. בואו לחזק את השכבה העליונה ל30 דקות.
4. הכן את מדיום גידול המכיל 1x TKI או שליטה ברכב. הוסף 2 מיליליטר של מדיום עם ריכוז רצוי של TKI על גבי השכבה אגר העליון.
5. דגירה תרבויות ל10 ימים ב 37 ° C ב 5% CO _2. להסיר ולהחליף את המדיום שכיסה כל 3 ימים.
6. כאשר מושבות הם גלויים לעין בלתי מזוינת, הבינוני לשאוב כיסה ולהוסיף פתרון 200 μl ניטרו-tetrazolium הכחול (1 מ"ג / מיליליטר NBT בH ₂ O, לאחסן ב 4 ° C, להגן מפני אור, זהירות). לחזור חממה ל24-48 שעה. מעבר ל4 מעלות צלזיוס לפחות 2 שעות לפני הספירה. ניתן לאחסן את הצלחות ויטראז על 4 מעלות צלזיוס למשך חודש אחד. ספירת מושבות באמצעות מיקרוסקופ או דלפק מושבה אוטומטית.

4. הערכה של עיכוב phospho חלבון בvivo

1. לאסוף גאמות גוברת בשלב יומן על ידי צנטריפוגה בצנטריפוגה בראש הטבלה ב1,500 סל"ד במשך 5 דקות. לשטוף את התאים פעם עם PBS סטרילי ו resuspend ב PBS בריכוז מתאים (בדרך כלל 1-5 x 10 ⁷ תאים / מיליליטר). תאים להשתלות בהיקף של 100 μl ל6-12 עכברי NSG ישנים שבוע על ידי הזרקה תוך ורידית לזנב וריד באמצעות מזרק אינסולין 28 G. מניחים את החיה בעוצר, מחמם את הזנב בכוס של מים חמים כדי להרחיב את הוורידים, ולנקות את הזנב עם ספוגית כלורהקסידין לפני הזריקה. לאחר הזרקה, יפעיל לחץ על אזור ההזרקה באמצעות גזה סטרילית עד שדימום ייפסק. השתלה לפחות 3 חיות / קבוצה. לשמור על העכברים במים המכילים 1 מ"ג / סולפט gentamycin מיליליטר.
2. ארבע עשרה ימים לאחר השתלה, טיפול בבעלים חיים עם TKI או כלי רכב בלבד, ודגימות קציר לניתוח של עיכוב היעד. שוקלים בעלי חיים ולטפל במינון מתאים (מ"ג / ק"ג משקל גוף) של TKI או רכב. לנהל טיפול בנפח של 5 מיליליטר / kמשקל גוף גרם בזריקה (IP) intraperitoneal או 10 מיליליטר / קילוגרם משקל גוף על ידי gavage האוראלי. להזרקת ה-IP, לרסן את העכבר באופן ידני ולהזריק ברבע הימני התחתון של הבטן באמצעות מחט G 29. לgavage האוראלי, לרסן את העכבר באופן ידני ולהחזיק את בעלי החיים זקופים. מניחים את צינור gavage בפה על הלשון ולחלק האחורי של הפה. להפעיל לחץ קל כדי להעביר את הצינור דרך הוושט ולתוך הקיבה. לוחץ על המתג המזרק כדי לנהל טיפול. אם הבוכנה לא לדכא בקלות את מחט gavage יש להסיר ומיקומו. הכן את הניסוחים TKI מייד לפני השימוש.
3. אם טיפול pervanadate הוא רצוי, להכין פתרון PV 20 דקות לפני הקציר כפי שתואר לעיל (שלב 1.1.4) ולדלל לבינוני עם 1 מיקרומטר MgCl ² ו100 U / ml DNase (120 PV μl + 880 בינוני μl). הערה: PV הוא יציב במשך שעה לפחות 1 לאחר דילול.
4. להקריב את בעלי חיים על ידי CO ₂ הרדמה בapזמן propriate (ים) שלאחר טיפול. לנתח עצמות ירך על ידי הסרת פרווה, עור ושרירים מהרגל כולה, כך שהעצמות חשופות לחלוטין. הסר את עצמות הירך על ידי גזירה עם מספריים לנתח ממש מתחת למפרק הירך ושוב מעל למפרק הברך. מעביר לצלחת פטרי ומח עצם מיושר עם 1 מיליליטר PBS הקר או פתרון PV מדולל באמצעות מזרק ומחט G 27. אם טיפול עם PV, לדגור על RT בחושך במשך 10 דקות.
5. הכן lysates ולנתח רמות phospho חלבון וסך הכל החלבון כפי שצוין לעיל (צעדים 1.1.6-1.2.5).
6. לכמת phospho חלבון יחסית ורמות כולל של החלבון עבור כל דגימה באמצעות צפיפות. חישוב יחסי phospho-protein/total-protein לערך phospho-protein/total-protein הממוצע לבעלי חיים שטופלו ברכב.

5. הערכה של פעילות נגד לוקמיה של TKIs בכל דגמי xenograft

1. במידת צורך, לחשוף את העכברים ל200 cGy של קרינה בirradiator RS-2000 prio יום אחדr להשתלה. עכברי השתלה עם שורות תאים לוקמיה כפי שתואר לעיל (שלב 4.1). השתלת עכברים לפחות 6 לכל קבוצה. זהה את העכברים על ידי ניקוב אוזן. לחלופין, טוש שחור יכול לשמש כדי לזהות עכברים עם סימני חשיש על זנבותיהם. להוסיף העשרה לכלובים כדי להפחית את הפוטנציאל לתוקפנות בן זוג בכלוב במהלך תקופת המחקר.
2. טיפול בעכברים עם TKI או רכב רק כפי שתוארו לעיל (שלב 4.2). לנטר את מצב בריאותם של עכברים יומיים באמצעות בדיקה גופנית ונחישות במשקל. סימפטומים צפויים של לוקמיה (הקטין את רמת פעילות, ירידה במשקל, שיתוק גפיים האחורי, ודלקות עיניים). ירידה במשקל יותר מ -10% -15% מזוהים בדרך כלל עם מותו של העכבר בתוך יומיים, והוא בדרך כלל נקודות קצה פונדקאיות למוות בהתאם לדרישות IACUC סטנדרטיות.
3. לפקח על קליטתם והתפתחות של לוקמיה באמצעות מערכת vivo בפליטת אור הדמיה עד 2x שבועי. הכן פתרון 200x D-וציפרין המניה (30 מ"ג / מיליליטר) בsteriמים le. מערבבים בעדינות על ידי היפוך עד D-וציפרין הוא נמס לגמרי. השתמש באופן מיידי, או aliquot והקפאה ב -20 ° C. לפני ההדמיה באמצעות vivo מערכת הדמיה פליטת אור ב, להפשיר aliquots של D-luciferin ב RT ולדלל 1:02 ב PBS לריכוז סופי של 15 מ"ג / מיליליטר ולסנן לעקר דרך פילטר 0.2 מיקרומטר.
4. להרדים את העכברים לפני ההדמיה עם 1.5% isoflurane בשאיפה בחמצן. לפקח הרדמה מספיק, מאופיינת בהרפיית שרירים, אובדן התנועה, ואובדן של תגובה לגירוי הבוהן קמצוץ.
5. מייד לפני ההדמיה, לנהל 150 מ"ג / D-וציפרין קילוגרם משקל גוף על ידי הזרקת ה-IP (10 μl של 15 מ"ג / מיליליטר וציפרין / גרם של משקל גוף).
6. השתמש במערכת הדמיה פליטת אור in vivo ל2 סדרה של תמונות עם חשיפות רציפה 30, 60 ו90 שניות ותמונה סופית עם חשיפת שניות 120 ללכוד. לאחר הדמיה, להחזיר עכברים לכלובים ולפקח על התאוששות מהרדמה. בהתאםעוצמת פליטת אור, יכולים להיות מגוונים זמני חשיפה. זמני חשיפה אופטימליים צריכים להיות קבועים מראש למודל נתון וכל זמן עולה בקנה אחד כזה שעוצמות האות לנקודות זמן בודדות הן השוואה על פני כל המחקר.
7. קביעת עוצמת פליטת אור לכל עכבר באמצעות תמונת Living תוכנת רכישה וניתוח 3.2. לקבוע ערכי שטף כולל שנמדדו בפוטונים / שני על ידי ציור אזורים של עניין (ROI) בגודל זהה על כל עכבר.
8. להקריב את העכברים על ידי CO ₂ חשיפה ונקע בצוואר הרחם אם ננטש, מציג שיתוק, במקרה של יותר מ 15% ירידה במשקל, או בסוף המחקר. לנתח עכברים ותצפיות שיא (למשל הגדלה של בלוטות לטחול, בכבד, או הלימפה; חיוור מח עצם). לנתח עצמות ירך ומח עצם לשטוף עם PBS הקר באמצעות מחט G 27.
9. איסוף תאים בmicrofuge ב2,500 סל"ד במשך 5 דקות. Resuspend תאי PBS המכילים 2% FBS ו דגירה במשך 5 דקות ב RT.איסוף תאים ואת כתם עם 20 מ"ג / מיליליטר DAPI (dihydrochloride 4,6-diamidino-2-phenylindole, 1:1,000) וα-hCD45 FITC-מצומדת (1:100) או נוגדן שליטת אלוטיפ ₁ העכבר IgG (1:100) . להעריך engraftment לוקמיה באמצעות cytometry זרימה. שער על האוכלוסייה בת קיימא (DAPI שלילי) ולקבוע אחוז CD45 + התאים (תקיעות מח עצם%).

תוצאות

מבחני שהוצגו כאן להעריך את ההשפעות ביוכימיות ופונקציונליות בתיווכו של TKIs וניתן להשתמש בם לדרגת תרכובות רומן המבוססות על המידה של עיכוב היעד במבחנה in vivo, הפחתה של הקמת מושבה, ועיכוב בleukemogenesis בעכברים מושתל עם NSG לוציפראז- מתויג תאים לוקמיה.

Discussion

כתב יד זה מתאר אסטרטגיה יעילה להערכה של מעכבי טירוזין קינאז רומן בטיפול בלוקמיה חריפה. שימוש בגישה זו, פעילויות ביוכימיות ונגד לוקמיה מוערכות ראשונה במבחנים מבוססי תאים במבחנה ולאחר מכן במודלי xenograft in vivo. ניתוח immunoblot נוצל בהצלחה כדי להדגים עיכוב של טירוזין ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Reagent/Material
Hydrogen Peroxide	MP Biomedicals	#02194057	GHS05, GHS07, H302-H318
Sodium Orthovanadate	Sigma	#S6508	GHS07, H302+ H312+H332
2-Mercaptoethanol	Sigma	#M7522	GHS05, GHS06, GHS08, GHS09, H301 + H331-H310-H315-H317-H318-H373-H410
ColonyGel Human Base Medium	ReachBio	#1101
3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT)	Sigma	#M5655	GHS07, GHS08, H315-H319-H335-H341
Difco Noble Agar	BD Biosciences	#214883
Nitrotetrazolium Blue Chloride	Sigma	#N6639	GHS07, H302
D-Luciferin Firefly, Potassium Salt	PerkinElmer	#122796
4',6- Diamidino-2-phenylindole dihydochloride	Sigma	#D9542
FITC CD45	BD Bioscience	#347463
FITC Mouse IgG1 Isotype control	BD Bioscience	#51-35404X-2
Gentamycin Sulfate	Sparhawk	#NDC58005-633-04
Protease Inhibitors	Roche	#11836153001
DNase	Sigma	#D4263
Protein G Beads	Invitrogen	#10-1242
Isofluran	VETONE	#NDC13985-030-60
			Equipment
Cell culture dishes, diam. 35 mm × H 10 mm	Nunclon	#D7804-500EA
Cell culture dishes, diam. 100 mm x  H 20 mm	Nunclon	#D8429-1CS
6-well plates	BD Bioscience	#353046
14 gauge x 4 inch blunt-end needles	Cadence science	#7956
5 ml syringe with luer-lok	BD Bioscience	#309646
GelCount automated colony counter	Oxford Optronix
In vivo bioluminescence imaging system	PerkinElmer	#IVIS200
Scout pro portable balances, scale	Ohaus	#SP202
Broome style rodent restrainer	Plas-labs	#551-BSRR
Ear punch, punch diameter: 2 mm	FST	#24210-02
Chlorhexidine swabs, Prevantics	PDI	#B10800
Insulin syringe 1 mL (40 Units) 29 G x 1/2	Monoject	#8881500042
Plastic feeding needles for rodents (disposable) 20 ga x 38 mm, sterile	Instech	#FTP-20-38
1 mL Luer-Lok disposable syringe	BD Bioscience	#309628
Lo-Dose U-100 insulin syringe with 28 G x ½, permanently attached needle	BD Bioscience	#329465
Extra fine bonn scissors	FST	#14084-08
Student fine scissors	FST	#91460-11
Moria ultra fine forceps	FST	#11370-40
Extra fine graefe forceps	FST	#11150-10
Scalpel handle	FST	#10003-12
Scalpel blades	FST	#10011-00