פלישת חיידקי enteric של תאי אפיתל במעי<em&gt; במבחנה</em&gt; באופן דרמטי משופר תוך שימוש במודל לשכת דיפוזיה אנכי

Summary

ביצוע מבחני תרבית תאים לחקירת הידבקות ופלישה חיידקים בתנאים אירוביים הוא בדרך כלל בלתי מייצג של In vivo איכות סביבה. מודל קאמרי דיפוזיה אנכית מאפשר מחקר של אינטראקציות של הפתוגן האנושי קמפילובקטר jejuni עם תאי אפיתל במעי תחת יותר In vivo תנאים, וכתוצאה מפלישת חיידקים משופרת.

Abstract

האינטראקציות של חיידקים פתוגנים עם תאי מארח נחקרו בהרחבה שימוש בשיטות תרבות תאים במבחנה. עם זאת כמבחני תרבית תאים מסוג זה מבוצעים בתנאים אירוביים, אלה במודלים חוץ גופית עשויים שלא לייצג במדויק בסביבת vivo שבאינטראקציות בין המאכסן לפתוגן תתקיים. פיתחנו מודל חוץ גופית בזיהום המאפשר coculture של חיידקים ותאים מארחים בתנאי גז בינוני ושונה. לשכת דיפוזיה אנכית (VDC) מודל מחקה את התנאים במעי האנושי שבו חיידקים יהיו בתנאים של רקמות תוך חמצן נמוכים מאוד יהיה מסופק עם חמצן מזרם הדם. הצבת מקוטבת סלולרי (IEC) monolayers אפיתל במעי גדלה במוסיף Snapwell לVDC יוצרת תאי apical וbasolateral נפרדים. תא basolateral מלא בתרבית תאים בינונית, אטום וperfused עם החמצן whilst תא הפסגה מלא במרק, כל הזמן פתוח וטופחו בתנאי microaerobic. יכול להישמר גם קאקו-2 וT84 IECs בVDC בתנאים אלה ללא כל השפעות מזיקות לכאורה על הישרדות תא או שלמות שכבה. ניסויי Coculturing הופיעו עם ג שונה זני הבר מסוג jejuni וקווים שונים של חברת חשמל במודל VDC עם תנאי microaerobic בתא הפסגה לגרום reproducibly בעלייה במספר של אינטראקציה (כמעט פי 10) והתאיים (חיידקים כמעט פי 100) בהשוואה לתנאי תרבות אירוביות ^1. הסביבה שנוצרה במודל VDC מחקה את הסביבה נתקל על ידי C. באופן הדוק יותר jejuni במעי האנושי, ומדגיש את החשיבות של ביצוע מבחני בזיהום חוץ גופית בתנאים המחקים באופן הדוק יותר במציאות vivo. אנו מציעים כי השימוש במודל VDC יאפשר פרשנויות חדשות של יחסי הגומלין מתערבתWeen חיידקים פתוגנים ותאי מארח.

Introduction

האינטראקציות של חיידקים פתוגנים עם תאי מארח נחקרו בהרחבה שימוש בשיטות תרבות תאים במבחנה. באמצעות מבחני כאלה סלולריים תרבות, הידבקות חיידקים לתאי מארח, זיהוי של קולטני תא מארח, תא מארח מסלולי איתות ופלישת חיידקים של תאי מארח כל נחקרו בפירוט, וכתוצאה מתצפיות רבות וחשובות. עם זאת מבחני תרבית תאים מסוג זה מבוצע בתנאים אירוביים כי לא יכול להיות נציג בסביבת vivo. מגבלה עיקרית של שימוש במודלים חוץ גופית ללמוד זיהומים במערכת העיכול היא שתנאי תרבות רמות חמצן גבוהים, כולל בדרך כלל מעדיפים הישרדות תא אוקריוטים. עם זאת תנאים בחלל המעי יהיו כמעט אנאירובי. פתוגנים מעיים בסביבת חמצן נמוכה מאוד לבטא גנים ארסיות ביטוי שינויים ² בתנאים אירוביים. ככזה, נתונים שהושגו באמצעות תקן תא תרבות מודלים מ 'איי לתת אינדיקציה מדויקת של יחסי גומלין עם חיידקי תאי מארח.

קמפילובקטר jejuni הוא סוכן הסיבה המוביל של קיבה ומעיים חריפות חיידקים ברחבי העולם, עם תסמינים שנעו בין שלשול קל עד מעיים דלקתיים קשים. רוב ג תוצאת זיהומים במערכת העיכול jejuni לא מסובכת, עם זאת ג jejuni הוא גם הגורם המדבק המזוהה לרוב בנוירופתיה היקפית כולל תסמונת גייךבאךה (GBS). בבריטניה, הערכה הוא כי ישנם מעל 500,000 מקרים של דלקת מעיים הנגרמים על ידי C. jejuni זיהום בכל שנה עם עלות צפויה לכלכלת בריטניה של 580,000,000 £. בעולם המתפתח, ג jejuni הוא גורם מוביל לתמותה בקרב ילדים. למרות החשיבות המוטלת בספק של זיהום קמפילובקטר ועשרות שנים של מחקר, כולל ניתוח המבוסס על גנומיקה יסודי, ג פתוגנזה jejuni עדיין גרוע understOOD, בניגוד לפתוגנים אחרים מעיים כגון סלמונלה, Escherichia coli, Shigella, וVibrio cholerae. חוסר מודל חיה קטן נוח הוא אחת סיבות עיקרית לזה ^3. גם בשימוש נרחב במודלים של זיהום מבחנה אינם מתאימים יותר ללימוד ג microaerophilic jejuni מאשר לפתוגנים מעיים אחרים, כי הם אנאירוביים הפקולטטיביים. בעוד ג jejuni מוכר כמחולל מחלה פולשנית, את המנגנונים של ג פלישת jejuni של תאי אפיתל במעי (IECs) עדיין אינה ברורה ^4,5. ג פלישת jejuni הוכח להיות תלויה משני סיבים מיקרוסקופים, Microtubules, שילוב של שניהם או אף אחד ^5. הבלבול בתחום זה הוא ככל הנראה בשל השימוש בלתי הולם בתנאים של assay חוץ גופית.

מספר מבחני תרבית תאים השונים היה בשימוש כדי לחקור את האינטראקציות של ג jejuniעם תאי מארח. קאקו-2 ^6, כולם היו בשימוש 407 ^7, וT84 ⁸ שורות תאי INT ללמוד את ההידבקות ופלישה היכולות של ג שונה זני jejuni. עם זאת, ברמות של הידבקות ופלישה חיידקים לג jejuni עם IECs נמוך יותר באופן משמעותי מאשר לפתוגנים מעיים ⁹ אחרים. Coculturing של ג jejuni עם IECs בדרך כלל מתבצע בCO ₂ באינקובטור בתנאים קרובים לרמות חמצן באטמוספרה, הנדרש להישרדותו של IECs. ג ביטוי גני jejuni יהיה שונה מאוד בסביבת החמצן הנמוכה של חלל המעי בהשוואה לתנאי חמצן אטמוספרי.

השימוש במערכת קאמרית דיפוזיה אנכית (VDC) פותח המאפשרת coculture של חיידקים ותאים מארחים בתנאי גז ^1,10,11 בינוניות ושונה. מערכת זו מחקה את התנאים במעי האנושי שבו חיידקים יהיו בלתיתנאי דר ושל רקמות תוך חמצן נמוכים מאוד יסופקו עם חמצן מזרם הדם. monolayers חברת החשמל מקוטבות שגודלו במסנני מיקרומטר 0.4 מיוחדים הושמו לVDC יצירת תא הפסגה וbasolateral, שהיו מלא באופן אישי עם מרק חיידקים ותרבית תאים בינוני בהתאמה (איור 1). VDC הוצב לאטמוספרה משתנה חממה המכילה 85% N _2, 5% O _2, ו-CO ₂ 10% על 37 מעלות צלזיוס, המייצגת את התנאים אופטימליים לג jejuni. תא הפסגה נותר פתוח וחשוף לאווירת microaerobic בתוך אווירת החממה משתנה, בעוד שהתא האטום basolateral סופק עם חמצן על ידי ממשל קבוע של 5% CO _2/95% O ₂ תערובת גז עם צינור מוצא מניעת הצטברות של לחץ . קאקו-2 הישרדות תא והיושרה monolayer בתנאים אלה אושרו על ידי ניטור ele transepithelialהתנגדות ctrical (TEER) על פני monolayer מעל 24 שעות כדי להוכיח קיומו של קאקו-2 monolayer התא וההפרדה הפיסית של תאי apical וbasolateral בתנאי חמצן נמוכים בתא הפסגה. TEER של monolayers בVDCs נשמר באווירת החממה משתנה (תנאי microaerobic) וברמת תא תרבות CO ₂ באינקובטור (תנאים אירוביים) לא הראה הבדלים משמעותיים, המצביע על יושרה של monolayer התא בתנאים אטמוספריים שונים ^1. בתנאי microaerobic, צמתים הדוקים נותרו בהווה ובמתחלק באופן שווה בין גבולות תאים עם דפוס מכתים occludin דומה לתאי קיומם תחת תנאים אירוביים ^1.

האינטראקציות של ג jejuni עם קאקו-2 וT84 תאים בVDC נחקרו על ידי בחינת אינטראקציה חיידקים (הידבקות ופלישה) ופלישה. שניים ג שונה jejuni פראי סוג straiNS שמשו ^1. ג jejuni 11168H הוא נגזר של hypermotile רצף הזן המקורי NCTC11168. זן 11168H מראה רמות גבוהות הרבה יותר קולוניזציה במודל הקולוניזציה אפרוח, והוא נחשב למתח מתאים לשימוש במחקרי אינטראקציה בין מאכסן לפתוגן וכך. 81-176 הוא אדם בודד והוא אחד מזני המעבדה למדו נרחב ביותר פולשניים. ג זני jejuni נוספו לתא apical של VDC או תחת תנאי microaerobic או אירוביים. אנו נצפו שיעור גבוה יותר עבור שניהם אינטראקציה ופלישה נרשמו לג jejuni בתנאי microaerobic ^1. ג המוגבר אינטראקציות jejuni לא היו כתוצאה מגידול במספרי חיידקים בתנאי microaerobic ^1. הנתונים אלה תומך בהשערה שלנו שסביבת החמצן הנמוכה בתא apical של VDC משפרת אינטראקציות חיידקים מארחות ומצביעה על כך שהמאפיינים פולשני של ג jejuni הוא incrהקל בתנאים אלה. זה היה הדו"ח הראשון של השימוש במודל VDC ללמוד פתוגן חיידקים חודרני ומדגיש את החשיבות של ביצוע מבחני בזיהום חוץ גופית בתנאים המחקים במצב vivo באופן הדוק יותר. מודל VDC יכול לשמש כדי לחקור את יחסי הגומלין בין מאכסן לפתוגן למיני חיידקים רבים ושונים.

Protocol

1. צמיחה של חברת החשמל monolayers על 0.4 מיקרומטר מסננים מיוחדים

1. -2 קאקו תרבות תאים בתקשורת של Dulbecco חיוני שונה (DMEM) בתוספת 10% (V / V) עוברי עגל בסרום, 100 U / ml פניצילין, סטרפטומיצין מיקרוגרם / מ"ל ​​100 ו 1% (V / V) חומצות אמינו חיוניות ב סטנדרטי תרבות רקמות חממה ב 37 ° C ב 5% CO ₂ ו 95% אוויר. זרע 4 x 10 ⁵ קאקו-2 IECs ל0.4 מיקרומטר לסנן ולגדול לקיטוב מעל 21 ימים, שינוי בתקשורת כל 2-3 ימים.
2. מדוד את TEER כדי לאשר מצב קיטוב של monolayer באמצעות מד התנגדות וולט אוהם. במחקרים שלנו, של 21 יום TEER קאקו-2 תאים שגודלו 0.4 מיקרומטר מסננים אלה הוא 700-800 Ωcm ^2.

2. הכנת ג jejuni והבינוני בקטריאלי עבור assay Coculturing

1. 24 שעות לפני נקודת התחלה רצויה של assay coculturing VDC, להכין צלחת אגר דם טרי של ג. jejuni ולדגור על 37 מעלות צלזיוס בתנאי microaerobic (85% N _2, 5% O _2, ו-CO ₂ 10%) בחממת האווירה משתנה.
2. במקביל, preincubate 30 מ"ל של מרק Brucella על 37 מעלות צלזיוס בתנאי microaerobic באווירת חממה משתנה.

3. הכנה ועיקור של צ'יימברס חצי VDC לפני Assay

1. מחצית תאים לחלוטין לטבול VDC, כמו גם את O-טבעות והתקעים בפתרון העיקור.
2. באמצעות מזרק מ"ל 20 סטרילי, שטוף את פתרון העיקור דרך פתחי הכניסה הגז בשני חצאי תאים. הימנעות מלעשות זאת עלולה לגרום לזיהום של הדגימות במהלך coculturing.
3. השאר את כל הרכיבים שקועים בפתרון העיקור ל> 1 שעה.
4. יש לשטוף את כל המרכיבים עם מים סטריליים טריים, באמצעות מזרק מיליליטר סטרילי עוד 20 כדי לשטוף את פתחי הכניסה הגז.

4. הכנהשל הבידוד החיידקים

1. קציר חצי צלחת של ג צמיחת jejuni מהצלחת אגר הדם שהוכנה היום קודם לכן לתוך 1 מ"ל של מרק Brucella preincubated. זה אמור להניב ~ 10 ¹⁰ CFU / מ"ל.
2. למדוד את הצפיפות האופטית של ההשעיה החיידקים ב 600 ננומטר כדי semiquantify יחידות מושבה להרכיב חיידקים (CFUs).
3. התאם את ההשעיה החיידקים לרמת הבידוד הרצויה ב4 מ"ל של מרק Brucella preincubated.
4. ביצוע דילול סדרתי מהשעית חיידקים זה סופי ואחריו ציפוי של דילולים המתאימים על צלחות אגר דם בשלושה עותקים, אז לדגור על 37 מעלות צלזיוס באווירת החממה משתנה עבור 48 שעות לכמת את מספר CFUs חיידקים הנמצאים בבידוד.

5. הגדרת VDC

1. מניחים את החצי התחתון של התא שטוח VDC על הספסל. Fit O-טבעת על מחצית התא התחתונה.
2. ניתוק מסנן אחד הנושאים את IECs מלאהוא המנשא ולשטוף שלוש פעמים עם 400 μl של PBS סטרילי. הנח את המסנן על מחצית התא התחתון, כדי לוודא שטבעת O נשארה במקום.
3. בעדינות להוריד את מחצית חדר העליון למקומו. ברגע ששני חצאי התאים הם התאספו, מהדקים יחד באמצעות טבעת מלחציים. הנח את VDC אופקי על גבי הספסל, עם שני הפתחים פונים כלפי מעלה.
4. הוסף 4 מ"ל של הבידוד חיידקים לתוך המחצית הקאמרית הפסגה.
5. הוסף 4 מ"ל של מדיום תרבות תא למחצית הקאמרית basolateral.
6. מניחים את החתיכות בסוף לתוך הפתחים משני חצאי תאים.

6. מצרף VDC לסעפת הגז בתוך אווירת החממה משתנה

1. הנח את VDC החממה לאטמוספרה משתנה בסמיכות לסעפת הגז.
2. פתח את רגולטור אספקת הגז המחובר לסעפת הגז. צרף את הצינור מהסעפת לכניסת הגז במחצית הקאמרית basolateral של VDC. צרף gaהשקע של הצינור מוביל אל מחוץ לאטמוספרה משתנה חממה לאחת מהחנויות בסוף הכתבה על המחצית הקאמרית basolateral.
3. סגור את השקע האחר בסוף הכתבה על המחצית הקאמרית basolateral. פתח את זרימת הגז בסעפת הגז, מקפיד לפתוח אותו באיטיות רבה, כדי למנוע לחץ גז עודף, כמו זה יכול להוביל לגירושו של מדיום basolateral.
4. המטרה היא זרימת גז של בועת 1 כל 2-5 שניות. מעת לעת לבדוק את זרימת הגז במהלך הניסוי ולהתאים במידת צורך.

7. פירוק VDC לאחר Coculture

1. לאחר תקופת coculture המתאימה, לסגור את רגולטור אספקת הגז המחובר לסעפת הגז. לסגור את זרימת הגז לVDC בסעפת. נתק את כניסת הגז, גז ולשקע את הפקק מVDC.
2. הסר VDC מאווירת חממה משתנה. הסר את supernatants apical וbasolateral ולאחסן ב -80 ° C לsubsequenניתוח לא.
3. הסר את מהדק הטבעת ובעדינות לפרק VDC. הסר את המסנן מהמחצית הקאמרית וההעברה לצלחת תרבית תאי 6 גם סטרילי. שטוף את שלוש הפעמים IECs עם 400 μl של PBS סטרילי.
4. לספירה של המספר הכולל של חיידקי אינטראקציה, להוסיף 400 μl של PBS סטרילי המכיל 0.1% (V / V) טריטון X-100 לIECs ודגירה במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר לlyse חברת החשמל. ביצוע דילול סדרתי מlysate התא הזה ואחריו ציפוי של דילולים המתאימים על צלחות אגר דם בשלושה עותקים, אז לדגור על 37 מעלות צלזיוס באווירת החממה משתנה עבור 48 שעות לכמת את מספר האינטראקציה CFUs חיידקיים.
5. לספירה של המספר הכולל של חיידקים פולשים, להוסיף 400 μl של מדיום DMEM תרבית תאים המכילים 150 מיקרוגרם / מיליליטר גנטמיצין לIECs ודגירה עבור שעה 2 בתרבות תקן רקמות חממה ב 37 ° C ב 5% CO ₂ ו 95% אוויר כדי להרוג חיידקים תאיים,לאחר מכן פעל כצעד ל7.4 לעיל.

8. ניקוי VDC לאחר Coculture

לשטוף עם מים וVDC חנות סטרילי לסיבוב של ניסויים הבאים.

תוצאות

ניסויי Coculturing הופיעו עם ג זן פראי סוג jejuni וIECs במודל VDC עם תנאי microaerobic בתא הפסגה הראו עלייה במספר של אינטראקציה (כמעט פי 10) ותאיים (חיידקים כמעט פי 100) בהשוואה לתנאי תרבות אירוביות בזמן אופן תלוי ^1. תצפית זו הייתה לשעתק באמצעות שני ג שונה זני jejuni פ?...

Discussion

השימוש בשיטות תרבות תאים במבחנה כדי לחקור את יחסי הגומלין של חיידקים פתוגנים עם תאי מארח הוא טכניקה מועסקות באופן נרחב במעבדות מחקר רבות. עם זאת כמבחני תרבית תאים מסוג זה מבוצעים בתנאים אירוביים, אלה במודלים חוץ גופית עשויים שלא לייצג במדויק בסביבת v...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Speciality vertical diffusion system for use with Snapwell inserts	Harvard Apparatus	66-0001	Manifold & six Snapwell chambers
Caps	Harvard Apparatus	66-0020
O-rings	Harvard Apparatus	66-0007
Clamps	Harvard Apparatus	66-0012
Snapwell filters (pore size 0.4 μm)	Corning Costar	3407
Millicell ERS-2 Volt-Ohm resistance meter	Millipore	MERS00002
WPA Lightwave II spectrophotometer	Biochrom	80-3003-72