JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מאמר זה מתאר בפרוטוקול הכלאה באתר מותאם לגילוי colormetric ביטוי microRNA בסעיפי כליות קבועים פורמלין.

Abstract

במאמר זה אנו מתארים שיטה לגילוי colorimetric של מירנה בכליות באמצעות הכלאה באתר עם ​​digoxigenin מתויגים בדיקות microRNA. פרוטוקול זה, שפותח במקור על ידי קלוסטרמן ועמיתיו לשימוש רחב בבדיקות Exiqon מירנה 1, כבר שונה כדי להתגבר על אתגרים הכרוכים בניתוח מירנה ברקמות כליה. אלה כוללים נושאים כמו זיהוי מבנה וקשה להסיר בדיקה ונוגדן שיורית. שימוש בדק יחסית, 5 מ"מ עובי, חלקי רקמות אפשרו להדמיה ברורה של מבנים בכליות, ואילו אות בדיקה חזקה נשמרה בתאים. בנוסף, תנאי ריכוז בדיקה ודגירה היו מותאמים כדי להקל על ויזואליזציה של ביטוי microRNA עם רקע נמוך ואות ספציפיות. הנה, בפרוטוקול מותאם מתואר, המכסה את אוסף רקמות הראשוני והכנה דרך ההרכבה של שקופיות בסוף ההליך. Compone הבסיסילילות של פרוטוקול זה יכול להיות שונה ליישום לרקמות אחרות ומודלי תרבית תאים.

Introduction

MicroRNA הם קטנים (אורכו כ -22 נוקלאוטידים) noncoding RNAs שמיוצרים באופן אנדוגני. הם בדרך כלל לתפקד לדכא ביטוי חלבון באמצעות דיכוי translational או השפלה mRNA. לאגד miRNAs למטרות mRNA עם השלמה שלמה, מה שמאפשר למירנה אחת כדי לדכא את המטרות מרובות.

הבנה שסוגי תאים ומבנים להביע miRNAs היא חלק חשוב בהבנת המנגנונים שבאמצעותם שינויים בתא השפעת ביטוי מירנה ופנוטיפים רקמות. בעוד שיטות כגון רצף של מירנה, qPCR וסופג צפון יכולות לשמש לזיהוי של miRNAs בכל רקמות, גישה זו אינה מאפשרת אחד כדי לקבוע איזה סוג תא מסוים שממנו באו בתוך רקמה מסוימת. Dissection של רכיבים סלולריים ומבניים לפני הניתוח באמצעות שיטות אלה יכול להיות מאוד קשה והתנאים הדרושים להשגת בידודים נאותים יכולים להוביל לאלterations בביטוי גנים או השפלה של RNAs. microRNA הכלאה באתר הוא שיטה המשמשת כדי להמחיש מיקום microRNA ורמות ביטוי ברקמות. טכניקה זו היא חשובה במיוחד ברקמות מורכבות של מבנים שונים, כמו למשל בכליות.

מיקרו RNA הוכח לשחק תפקיד רגולציה ב2,3 פיתוח כליות ופיזיולוגיה 4. שינויי ביטוי microRNA יש גם הוכח להיות מעורבים בפתולוגיה של כליות כמו סיסטיק 5-10, נפרופתיה סוכרתית 7, קרצינומה של הכליה 11,12, וניזק כלייתי חריף 13. במחקר שלנו, מצאנו כי אופטימיזציה של microRNA הכלאה באתרו לרקמות כליה הייתה בעל ערך לקביעת המיקומים המבניים המדויקים של ביטוי מירנה בבריאות והן במחלה 14. קביעת הביטוי צינורי וסלולרי של מיקרו RNA השונים היא חשובה משום שהרגולציה שלהם targets עשוי להיות תלוי בתפקודים תאיים. במדינות חולות חשוב גם כדי לקבוע כיצד שינויים בביטוי מירנה עלולים להיות השפעה על תפקוד.

המטרה של השיטה שתוארה כאן הייתה לבנות על מתודולוגיות ISH קיימות שפותחו על ידי קלוסטרמן et al. 15, חוקרים אחרים 16,17, ואלה שהוצעו על ידי 1 Exiqon ולייעל את השיטה לרקמות כליה קבועה פורמלין. אנחנו השתמשנו בהצלחה בשיטה זו כדי לזהות הבדלים אזוריים מובהקים בביטוי כליות microRNA miR-382 עם חסימה בשופכן חד צדדית 18. גישה זו יכולה לשמש גם עם רקמות אחרות, עם אופטימיזציה נוספת.

Protocol

1. סעיפים רקמת כליה

  1. סעיפי כליות מוטבעים פרפין קבוע פורמלין (10%) נחתכים על גבי שקופיות מיקרוסקופ ב5 מ"מ עובי באמצעות ס microM HM 355 השקופיות יכולות להיות מאוחסנות במשך מספר חודשים לפני הניתוח.

2. פתרון הכנה

  1. הכן 1 ליטר של 1x PBS בDDH 2 O בבקבוק בראש בורג autoclavable. מלא עוד בקבוק עם 1 ליטר של DDH 2 O. הוסף 1 מיליליטר של DEPC לכל בקבוק, מכסים ולנער במרץ. תן הפתרונות לשבת לילה בטמפרטורת חדר כדי להרוס RNases ולאחר מכן חיטוי. להוסיף 400 מיליליטר 20-Tween עד 1 ליטר של 1x PBS לעשות PBS-T.
  2. הכן proteinase חיץ K (50 mMTris-HCl, pH 8.0 ו1 מ"מ CaCl 2 בDEPC מים מטופלים).
  3. הכן פתרון של גליצין 0.2% ב-PBS-T.

3. הכנת רקמה

  1. הכן כמות גדולה של חיץ הכלאה (50-100 מיליליטר) המורכב מFormamide 50%, 5x SSC, Tween 0.1%, 9.2חומצת לימון מ"מ להתאמה ל-pH 6, 50 מיקרוגרם / מיליליטר הפרין, ו500 מיקרוגרם / מיליליטר RNA שמרים בDEPC טופלה DDH 2 O. מחלקים ל 1 מיליליטר aliquots ולאחסן ב -80 º C.
  2. הסר את פרפין מהרקמה על ידי שטיפת 3x בקסילן הטרי במשך 5 דקות כל אחד.
  3. רעננותם סעיפי רקמות על ידי 5 incubations דקות בהפחתת ריכוזים של אתנול (100%, 75%, 50%, ו25%) בDDH 2 O.
  4. פנק את השקופיות עם מספיק DEPC כדי לכסות לחלוטין את סעיפי רקמות (כ 0.4-0.5 מיליליטר) דקות 1. רקמות בטוחים הפוך לא יתייבשו.
  5. יש לשטוף את השקופיות בDEPC טופלו PBS-T פעמיים במשך 5 דקות, איסוף פסולת DEPC מכילים לסילוק נאות. צריכים DEPC יטופלו כל ריאגנטים לחסל RNases מנקודה זו והלאה.
  6. Prewarm proteinase K חיץ ולהוסיף K proteinase לריכוז סופי של 10 מיקרוגרם / מיליליטר. כסה סעיפי רקמות עם פתרון K proteinase ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
  7. להסיר במהירות את proteinasפתרון e K ולהוסיף גליצין 0.2% ב-PBS-T ל30 שניות.
  8. מגלשות יש לשטוף בDEPC טופלו PBS-T פעמיים ל30 שניות כל אחד.
  9. לתקן סעיפים בparaformaldehyde 4% טריים ל10 דקות.

4. הכלאה

  1. הוסף 50 μl של חיץ הכלאה (Formamide 50%, 5x SSC, Tween 0.1%, חומצת לימון 9.2 מ"מ להתאמה ל-pH 6, 50 מיקרוגרם / מיליליטר הפרין, 500 מיקרוגרם / שמרים RNA מיליליטר) לכל קטע רקמה ומכסים בHybriSlips RNase ללא לחתוך פשוט גדול מסעיפי הרקמות.
  2. סעיפי Prehybridize בתנור הכלאת לחות מבוקרת במשך שעה 2 בטמפרטורת הכלאה שנקבעה לבדיקת 3 'שכותרתו digoxigenin (בדרך כלל DNA Tm של החללית -21 ° C, (כלומר 54 מעלות צלזיוס במשך miR-382, הבדיקה DNA Tm = 75 ° C ), תוך שימוש במעבדת רקמת מגבונים ספוגים ב50% formamide/50% SSC 5x כדי לשמור על התא humidified.
  3. לדלל את הבדיקה מירנה, בקרה חיובית (U6, RNA הגרעיני קטן) ובקרה שלילית (מקושקשתרצף) ל40 ננומטר במאגר הכלאה (75 μl של חיץ נחוץ לכל סעיף).
  4. מחממים את הבדיקה במאגר הכלאה ב65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
  5. הסר את השקופיות מתנור הכלאה ולהסיר coverslips וחיץ הכלאה עודף מprehybridization.
  6. הוסף 75 μl של חללית המכילה חיץ לכל קטע רקמה, ישירות לרקמות. כסה רקמות עם HybriSlips פשוט גדול מספיק כדי לכסות את חלקי רקמות.
  7. שמירה על רמת מחזיק שקופיות, לחזור לתנור הכלאה לדגירת הלילה בטמפרטורה מהשלב 4.2 (כ 16 hr).

5. החמרת שטפי

  1. הוסף 200 μl 2x SSC, מחומם לטמפרטורת ההכלאה, רק תחת קצה אחד של coverslips כדי לעזור לשחרר את coverslip מהרקמות. הסר את coverslip על ידי הטיית השקופיות.
  2. שטוף את השקופיות ב200 μl של פוראמיד 50%, SSC 2x 50% ב3x טמפרטורת ההכלאה ל30 דקות כל אחד.
  3. לשטוףשקופיות 5x ב-PBS-T בטמפרטורת חדר במשך 5 דקות כל אחד בייקר מסלולית במהירות נמוכה.

6. איתור

  1. דגירה שקופיות בחסימת המאגר (עז 2% או בסרום סוס, 2 מ"ג / מיליליטר BSA ב PBS-T) במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר בייקר מסלולית במהירות נמוכה.
  2. לדלל ברים אנטי DIG-AP Fab בחסימת מאגר ב1:100. להוסיף לקטע רקמה 100 μl ומכסים בHybriSlips לחתוך פשוט גדול מספיק כדי לכסות את הסעיף.
  3. דגירה נוגדן בתא humidified על 4 מעלות צלזיוס (כ 16 שעה) למשך הלילה.
  4. שטוף את שקופיות PBS-T 7x, במשך 5 דקות כל אחד בייקר מסלולית במהירות נמוכה.
  5. שטוף את השקופיות במאגר AP (100 מ"מ TrisHCl pH 9.5, 50 מ"מ MgCl 2, 100mm NaCl, 0.1% Tween 20) 3x, במשך 5 דקות כל אחד.
  6. הוספת פתרון NBT / BCIP לחיץ AP (200 חיץ מיליליטר μl/10)
  7. להוסיף 400-500 מיליליטר של תמיסת NBT / BCIP מדולל לכל שקופית כדי לכסות את כל חלקי הרקמות לחלוטין. לפתח בחושך, ברמה, humidifתא מטען ל4-5 שעות.

7. שקופיות הרכבה

  1. מייבש את החלקים בהגדלת ריכוזים של אתנול (25%, 50%, 75%, 100%) במשך 5 דקות כל אחד.
  2. דגירה ב5x קסילן כדי לנקות את החלקים.
  3. הר שקופיות בהרכבה הבינוני Permount ולילה יבש.

תוצאות

האזורים של קטע רקמה שהופכים התייבש במהלך ההכלאות, incubations או לשטוף צעדים בדרך כלל בסופו של הכתמה כהה יותר במהלך פיתוח NBT / BCIP. איור 1 מציג חלק מסעיף בכליות שבי HybriSlip החליק מהקצה הרקמות, שמאפשרים לו להתייבש באופן חלקי. למרות החזרת נוזלים וכיסוי בשלבים הנותרים, האו...

Discussion

מטרתו של מאמר זה הייתה לתאר את הפרוטוקול למירנה הכלאה באתרו שפועל היטב ברקמות כליה קבועות פורמלין. תוך כדי העבודה בחוץ פרוטוקול זה כמה מקורות חשובים של חפץ מכתים זוהו. תשומת לב רבה לנקודות אלה יכולים לסייע במניעת חפץ מכתים ומעלה את הסבירות לריצה ISH מוצלחת.

Disclosures

אין מה לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי מכוני בריאות הלאומיים של ארה"ב מעניק HL082798 וHL111580.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
ParaformaldehydeSigmaP6148
PBSGibco70011044
Diethyl PyrocarbonateSigmaD5758
Tween-20SigmaP1379
XylenesSigma534056
EthanolUltra Pure200CSPTP
Tris-HClLife Technologies15506-017
CaCl2SigmaC2536
GlycineJ.T. Baker4059-00
Citric AcidSigmaC2404
FormamideSigmaF9037
20x SSC BufferLife Technologies15557-044
HeparinSAGENT25021-400-30
Yeast RNALife TechnologiesAM7118
MgCl2SigmaM8266-1004
NaClJ.T. Baker4058-01
Proteinase KFermentasEO0491
3’ DIG- miRNA probeExiqonmiR dependent-05
3’ DIG- Scrambled miR probeExiqon99004-05
3’ DIG- U6 miR probeExiqon99002-05
Anti-Digoxigenin-Ab FabRoche11093274910
NBT/BCIPRoche11681451001
PermountFisherSP15-500
CoverslipsFisherFit to tissue size
Microtom HM 355 SThermo Scientific23-900-672
In-slide Out Hybridization OvenBoekel241000
Aluminum Tray AssemblyBoekelC2403973
Stainless Steel Rack InsertBoekelC2403754

References

  1. Nagalakshmi, V. K., Ren, Q., Pugh, M. M., Valerius, M. T., McMahon, A. P., Yu, J. Dicer regulates thedevelopment of nephrogenic and ureteric compartments in the mammalian kidney. Kidney Int. 79 (3), 317-330 (2011).
  2. Ho, J., Pandey, P., Schatton, T., Sims-Lucas, S., Khalid, M., Frank, M. H., Hartwig, S., Kreidberg, J. A. The pro-apoptotic protein Bim is a MicroRNA target in kidney progenitors. J. Am. Soc. Neph. 22 (6), 1053-1063 (2011).
  3. Tian, Z., Greene, A. S., Pietrusz, J. L., Matus, I. R., Liang, M. MicroRNA-target pairs in the rat kidney identified by microRNA microarray, proteomic, and bioinformaticanalysis. Genome Res. 18 (3), 404-411 (2008).
  4. Mladinov, D., Liu, Y., Mattson, D. L., Liang, M. MicroRNAs contribute to the maintenance of cell-type-specific physiological characteristics: miR-192 targets Na+/K+-ATPase β1. Nucleic Acids Res. 41 (2), 1273-1283 (2013).
  5. Liu, Y., Taylor, N. E., Lu, L., Usa, K., Cowley, A. W., Ferreri, N. R., Yeo, N. C., Liang, M. Renal medullary microRNAs in Dahl salt-sensitive rats: miR-29b regulates several collagens and related genes. Hypertension. 55 (4), 974-982 (2010).
  6. Kato, M., Zhang, J., Wang, M., Lanting, L., Yuan, H., Rossi, J. J., Natarajan, R. MicroRNA-192 in diabetic kidney glomeruliand its function in TGF-b-induced collagen expression via inhibition of E-box repressors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (4), 3432-3437 (2007).
  7. Krupa, A., Jenkins, R., Luo, D. D., Lewis, A., Phillips, A., Fraser, D. Loss of microRNA-192 promotes fibrogenesis in diabetic nephropathy. J. Am. Soc. Neph. 21 (3), 438-447 (2010).
  8. Wang, B., Herman-Edelstein, M., Koh, P., Burns, W., Jandeleit-Dahm, K., Watson, A., Saleem, M., Goodall, G. J., Twigg, S. M., Cooper, M. E., Kantharidis, P. E-cadherin expression is regulated by miR-192/215 by a mechanism that is independent of the profibrotic effects of transforming growth factor-β. Diabetes. 59 (7), 1794-1802 (2010).
  9. Kato, M., Arce, L., Wang, M., Putta, S., Lanting, L., Natarajan, R. A microRNA circuit mediates transforming growth factor-β1 autoregulation in renal glomerular mesangial cells. Kidney Int. 80 (4), 358-368 (2011).
  10. Gottardo, F., Liu, C. G., Ferracin, M., Calin, G. A., Fassan, M., Bassi, P., Sevignani, C., Byrne, D., Negrini, M., Pagano, F., Gomella, L. G., Croce, C. M., Baffa, R. Micro-RNA profiling in kidney and bladder cancers. Urol. Oncol. 25 (5), 387-392 (2007).
  11. Juan, D., Alexe, G., Antes, T., Liu, H., Madabhushi, A., Delisi, C., Ganesan, S., Bhanot, G., Liou, L. S. Identification of a microRNA panel for clear-cell kidney cancer. Urol. 75 (4), 835-841 (2010).
  12. Xu, X., Kriegel, A. J., Liu, Y., Usa, K., Mladinov, D., Liu, H., Fang, Y., Ding, X., Liang, M. Delayed ischemic preconditioning contributes to renal protection by upregulation of miR-21. Kidney Int. 82 (11), 1167-1175 (2012).
  13. Kriegel, A. J., Mladinov, D., Liang, M. Translational study of microRNAs and its application in kidney disease and hypertension. 122 (10), 439-447 (2012).
  14. Kloosterman, W. P., Wienholds, E., de Bruijn, E., Kauppinen, S., Plasterk, R. H. In situ detection of miRNAs in animal embryos using LNA-moidified oligonucleotide probes. Nat. Methods. 3 (1), 27-29 (2006).
  15. Nelson, P. T., Baldwin, D. A., Kloosterman, W. P., Kauppinen, S., Plasterk, R. H., Mourelatos, Z. RAKE and LNA-ISH reveal microRNA expression and localization in archival human brain tissue. RNA. 12 (2), 187-191 (2006).
  16. Obernosterer, G., Martinez, J., Alenius, M. Locked nucleic acid-based in situ detection of microRNAs in mouse tissue sections. Nat. Protocols. 2 (6), 1508-1514 (2007).
  17. Kriegel, A. J., Liu, Y., Cohen, B., Usa, K., Liu, Y., Liang, M. MiR-382 targeting of kallikrein 5 contributes to renal inner medullary interstitial fibrosis. Physiol. Genomics. 44 (4), 259-267 (2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

81microRNAmicroRNA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved