זיהוי אופטי של<em&gt; א coli</em&gt; חיידקים על ידי Biosensors הסיליקון Mesoporous

Summary

Biosensor אופטי ללא תווית לזיהוי חיידקים מהירים הוא הציג. Biosensor מבוסס על Si הנקבובי nanostructured, שנועד ללכוד באופן ישיר את תאי חיידקי היעד על פני השטח שלו. אנו משתמשים בנוגדנים חד שבטיים, משותקים על המתמר הנקבובי, כמו הבדיקות ללכוד. המחקרים שלנו מראים את הישימות של biosensors אלה לצורך זיהוי של ריכוזי חיידקים נמוכים תוך דקות ללא עיבוד לפני מדגם (כגון תמוגה תא).

Abstract

Biosensor אופטי ללא תווית המבוסס על Si הנקבובי nanostructured מיועד ללכידה וזיהוי מהירים של חיידקי Escherichia coli K12, כמיקרואורגניזם מודל. Biosensor מסתמך על כריכה ישירה של תאי חיידקי היעד על פני השטח שלו, בעוד שאף טיפול מקדים (למשל על ידי תמוגה תא) של המדגם למד נדרשת. סרט דק Si mesoporous משמש כאלמנט מתמר האופטי של biosensor. תחת תאורת אור לבנה, השכבה נקבובית מציגה דפוסי שוליים פברי פרו-נפתרו היטב בספקטרום רפלקטיביות שלה. החלת Fast Fourier Transform (FFT) לתוצאות נתוני רפלקטיביות בשיא אחד. שינויים בעוצמת שיא FFT נמצאים תחת פיקוח. לפיכך, חיידקי היעד ללכוד על גבי משטח biosensor, דרך אינטראקציות נוגדן אנטיגן, גורם לשינויים מדידים באינטנסיביות של פסגות FFT, המאפשרים תצפית "בזמן אמת" של קובץ מצורף חיידקים. NT "> סרט Si mesoporous, מיוצר על ידי תהליך anodization אלקטרוכימיים, הוא מצומדת עם נוגדנים חד שבטיים, ספציפיים לחיידקי היעד. חוסר התנועה, immunoactivity והספציפיות של הנוגדנים אושר על ידי ניסויי תיוג ניאון. רגע biosensor חשוף ל חיידקי יעד, התאים שנתפסו ישירות על גבי משטח Si הנקבובי-הותאם נוגדן. אירועי לכידה ספציפיים אלה לגרום לשינויים בעוצמה בספקטרום ההפרעות אופטיות סרט דק של biosensor. אנו מדגימים כי biosensors אלה יכולים לזהות ריכוזי חיידקים נמוכים יחסית (זיהוי מגבלה של 10 ⁴ תאים / מיליליטר) בפחות משעה.

Introduction

מוקדם ומדויק זיהוי של חיידקים פתוגניים הוא חשוב ביותר עבור מזון ובטיחות מים, ניטור סביבתי, ואבחון נקודה של טיפול ^1. כמו טכניקות מיקרוביולוגיה מסורתיות הן זמן רב, מייגע, ואין להם את היכולת לזהות מיקרואורגניזמים ב" בזמן אמת ", או מחוץ לסביבת המעבדה, biosensors מתפתח כדי לעמוד באתגרים אלה ^2-5.

בשנים האחרונות, סי נקבובית (PSI) התפתחה כפלטפורמה מבטיחה לעיצוב של חיישנים וbiosensors ^6-20. בעשור האחרון מחקרים רבים בנוגע לחיישנים אופטיים המבוסס על PSI וbiosensors פורסמו ^21,22. שכבת PSI nanostructured היא מפוברק בדרך כלל על ידי תחריט anodic אלקטרוכימיים מSi רקיק יחיד גביש. ננו PSI כתוצאה תערוכה רבים מאפייני יתרון, כגון פנים גדול ונפח חופשי, להתעמק בגדלים שניתן לשלוט וopti מתכונןמאפייני קאל ^10,16. התכונות אופטיות של שכבת PSI, כגון photoluminescence ^8,11 ואינטרפרומטריה מבוססת החזרה אור הלבן ^7,19, מושפעות במידה רבה על ידי תנאים סביבתיים. לכידתו של analytes מולקולות / יעד אורחים בתוך תוצאות השכבה נקבוביות בשינוי במקדם השבירה הממוצעת של הסרט, כפי שנצפה אפנון בספקטרום photoluminescence או כשינוי באורך גל בספקטרום רפלקטיביות ^10.

למרות החדשנות העצומה בתחום טכנולוגית biosensor האופטי PSI, יש רק כמה דיווחים על פלטפורמות מבוססות PSI לגילוי חיידקים ^{6,8,20,23-29.} בנוסף, רוב מחקרי הוכחה של קונספט אלה הוכיחו זיהוי "עקיף" חיידקים. לכן, בדרך כלל תמוגה המוקדמת של התאים נדרשת כדי לחלץ את שברי החלבון / DNA הממוקד, אופייניים לחיידקים למדו ^29. הגישה שלנו היא ללכוד ישירות חיידקי היעדתאים על גבי biosensor PSI. לפיכך, נוגדנים חד שבטיים, שהם ספציפיים כדי למקד חיידקים, הם משותקים על פני השטח הנקבובי. כריכה של תאי חיידקים, דרך אינטראקציות נוגדן אנטיגן, על פני השטח של biosensor לגרום לשינויים באמפליטודה (עוצמה) של ספקטרום רפלקטיביות ^24-26.

בעבודה זו, אנו מדווחים על הבנייה של biosensor מבוסס PSI אופטי ולהדגים היישום שלה כפלטפורמת biosensing ללא תווית לזיהוי של Escherichia coli (E. coli) חיידקי K12 (המשמשים כמודל מיקרואורגניזם). פיקוח אות אופטי הוא האור מוחזר מnanostructure psi עקב ההפרעה פברי פרו-סרט דק (איור 1 א). שינויים במשרעת / עוצמת האור מתואמים לקיבוע מסוים של תאי חיידקי היעד על גבי משטח biosensor, המאפשרים איתור וכימות של החיידקים מהירים.

Protocol

1. הכנת החמצון הנקבובי SiO ₂

1. הוופלים לחרוט סי (צד אחד מלוטש ב< 100> פנים ומסוממים בכבדות, מסוג p, 0.0008 Ω · ס"מ) בתמיסה 03:01 (V / V) של HF מימיים ואתנול מוחלט ל30 שניות בזרם קבוע צפיפות של 385 mA / ² סנטימטר. שים לב שHF הוא נוזל מאכל מאוד, וזה צריך להיות מטופל בזהירות רבה.
2. יש לשטוף את פני השטח של סרט סי (PSI) הנקבובי וכתוצאה מכך עם אתנול מוחלט מספר פעמים; לייבש את הסרטים תחת גז חנקן יבש.
3. חמצן דגימות PSI הטרי החרוטות בתנור צינור ב800 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 באוויר הסביבה (למקם את המדגם בתנור בטמפרטורת חדר, לחמם את התנור ל800 מעלות צלזיוס, להשאיר בתנור במשך שעה 1, כבה את תנור ולהסיר את הדגימות מהתנור רק בטמפרטורת חדר).

2. Biofunctionalization של ₂ פיגומים PSiO

1. דגירה PSI חמצון (PSIO ₂ מדגם) במשך שעה 1 בmercaptopropyl (פתרון trimethoxysilane-3) 95% (MPTS) (108 מ"מ בטולואן).
2. יש לשטוף את מדגם PSiO ₂ שטופלו silane עם טולואן, מתנול, אצטון ו; יבש מתחת לגז חנקן יבש.
3. דגירה מדגם PSiO _2-הותאם silane ל30 דקות ב 1 מיליליטר של 100 פתרון ביוטין PEO-iodoacetyl מ"מ.
4. יש לשטוף את מדגם PSiO ₂ שטופלו ביוטין עם 0.1 פוספט M שנאגרו פתרון (PBS) מספר פעמים.
5. דגירה מדגם PSiO _2-הותאם ביוטין ל30 דקות ב 1 מיליליטר של מיקרוגרם / מיליליטר streptavidin פתרון 100 (SA).
6. יש לשטוף את המדגם שטופל ב-SA PSiO ₂ עם 0.1 פתרון M PBS מספר פעמים.
7. דגירה PSiO ₂ מדגם הותאם-SA וכתוצאה מכך ל30 דקות ב 1 מיליליטר של 100 מיקרוגרם / ה biotinylated מיליליטר פתרון נוגדן חד שבטי coli (אימונוגלובולין G, IgG) או עם 100 מיקרוגרם / IgG biotinylated ארנב מיליליטר (כמודל לנוגדנים חד שבטיים).

3. תיוג פלורסנט ומיקרוסקופ פלואורסצנטי

1. דגירה המשטחים שונה-IgG עם 15 מיקרוגרם / מיליליטר והעמסת (FITC) מתויג ארנב IgG נגד ל40 דקות ועם 15 מיקרוגרם / מיליליטר והעמסת (FITC) מתויג IgG עכבר אנטי כביקורת.
2. יש לשטוף את הדגימות שונה עם 0.1 פתרון M PBS מספר פעמים.
3. לבחון את הדגימות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

4. תרבות חיידקים

1. לטפח E. חיידקי coli K12 בצינור 10 מיליליטר עם 5 מיליליטר של לוריא Bertani בינוני (LB) (הרכב בינוני ב1 ליטר של מים deionized: 5 גרם של NaCl, 5 גרם של תמצית שמרים, ו10 גרם של tryptone). דגירה החיידקים רועדים לילה בשעה 37 ° C.
2. לנטר את ריכוז חיידקים על ידי קריאת הצפיפות האופטית (OD) באורך גל של 600 ננומטר. לאחר צמיחת הלילה במדיום LB, קרא את OD ₆₀₀ באמצעות ספקטרופוטומטר כדי לקבוע את ריכוז החיידקים. מספר התאים הוא קשהctly פרופורציונאלי לOD ₆₀₀ מדידות (OD 1 ₆₀₀ = 10 ⁸ תאים / מיליליטר).

5. חיידקי חישה

1. הנח את PSiO הותאם-IgG ₂ ומסודרים PSiO ₂ (כמו השליטה) דגימות בתא זרימת פרספקס בהזמנה אישית. תקן את תא הזרימה כדי להבטיח שרפלקטיביות המדגם נמדדה באותה הנקודה במשך כל המדידות.
2. דגירה הדגימות עם א ' ההשעיה coli K12 (10 ⁴ תאים / מיליליטר) ל30 דקות בטמפרטורת חדר. ואז להסיר את ההשעיה חיידקים על ידי שטיפת התא עם 0.85% w / תמיסת מלח v ל30 דקות.
3. לעקוב אחר השינויים בנתונים רפלקטיביות לאורך כל הניסוי. כל המדידות אופטיות צריכה להתבצע במימי שמסביב. ספקטרום צריך להיות שנאסף באמצעות ספקטרומטר CCD ונותח על ידי יישום Fast Fourier Transform (FFT), כפי שתואר ^25,26 בעבר.
4. לאשר את קיומו של החיידקים עלמשטח biosensor, על ידי תצפית של הדגימות תחת מיקרוסקופ אור זקופה מייד לאחר ניסוי biosensing.

תוצאות

סרטי PSI חמצון (PSiO ₂₎ מוכנים כפי שתוארו בסעיף טקסט הפרוטוקול. 1B איור מראה מיקרוסקופ אלקטרונים סורק ברזולוציה גבוהה של סרט PSI וכתוצאה מכך לאחר חמצון תרמי. PSiO ₂ השכבה מאופיינת בנקבוביות גליליות מוגדרות היטב בקוטר בטווח של 30-80 ננומטר.

Discussion

Immunosensor אופטי ללא תווית, המבוסס על nanostructure PSiO ₂ (סרט דק פברי פרו-) הוא מפוברק, ותחולתה הפוטנציאלית כbiosensor לגילוי חיידקים הוא אישרה.

שינויים ופתרון בעיות

אחד החששות הגדולים בעת תכנון immunosensor ה?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Si wafer	Siltronix Corp.		Highly-B-doped, p-type, 0.0008 Ω-cm resistivity, <100> oriented
Aqueous HF (48%)	Merck	101513
Ethanol absolute	Merck	818760
PBS buffer solution (pH 7.4)			prepared by dissolving 50 mM Na2HPO4, 17 mM NaH2PO4, and 68 mM NaCl in Milli-Q water (18.2 MΩ)
Saline 0.85% w/v			prepared by dissolving 0.85 g NaCl in 100 ml Milli-Q water (18.2 MΩ)
95% (3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane (MPTS)	Sigma Aldrich Chemicals	175617
PEO-iodoacetyl biotin	Sigma Aldrich Chemicals	B2059
Streptavidin (SA)	Jackson ImmunoResearch Labs Inc.	016-000-114
Fluorescein (DTAF)-streptavidin	Jackson ImmunoResearch Labs Inc.	016-010-084
Biotinylated-rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch Labs Inc.	011-060-003
Fluorescently tagged anti-rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch Labs Inc.	111-095-003
Fluorescently tagged anti-mouse IgG	Jackson ImmunoResearch Labs Inc.	115-095-003
Biotinylated E. coli antibody	Jackson ImmunoResearch Labs Inc.	1007
E. coli (K-12)			was generously supplied by Prof. Sima Yaron, Technion