בדיקת רגישות אנטיביוטית הנגרמת על ידי מתח על שבב

Summary

פיתחנו פלטפורמה מיקרופלואידית לבדיקות רגישות לאנטיביוטיקה במהירות. נוזל מועבר במהירויות גבוהות על חיידקים משותקים בתחתית ערוץ מיקרופלואידי. בנוכחות מתח ואנטיביוטיקה, זנים רגישים של חיידקים מתים במהירות. עם זאת, חיידקים עמידים יכולים לשרוד את התנאים מלחיצים אלה.

Abstract

פיתחנו שיטה מיקרופלואידית מהירה לבדיקות רגישות לאנטיביוטיקה בסביבה מבוססת מתח. נוזל מועבר במהירויות גבוהות על חיידקים משותקים בתחתית ערוץ מיקרופלואידי. בנוכחות מתח ואנטיביוטיקה, זנים רגישים של חיידקים מתים במהירות. עם זאת, חיידקים עמידים לשרוד אלה תנאים מלחיצים. ההשערה מאחורי שיטה זו היא חדשה: הפעלת מתח של מסלולים ביוכימיים, שהם מטרות של אנטיביוטיקה, יכול להאיץ בדיקות רגישות לאנטיביוטיקה. בהשוואה לשיטות סטנדרטיות לבדיקת רגישות לאנטיביוטיקה, הצעד המגביל את הקצב - צמיחת חיידקים - מושמט במהלך יישום אנטיביוטי. היישום הטכני של השיטה הוא בשילוב של טכניקות סטנדרטיות וגישות חדשניות. החלקים הסטנדרטיים של השיטה כוללים פרוטוקולי תרבות חיידקים, הגדרת ערוצים מיקרופלואידיים בפולידימתילסילוקסן (PDMS), ניטור כדאיות התא עם פלואורסצנטיות ועיבוד תמונת אצווה לספירת חיידקים. חלקים חדשניים של השיטה נמצאים בשימוש בזרימת מדיה תרבותית ליישום מתח מכני, שימוש באנזימים לנזק אך לא להרוג את החיידקים, ושימוש במצעים microarray עבור התקשרות חיידקית. הפלטפורמה המפותחת יכולה לשמש בפיתוח ובדיקות של תרופות אנטיביוטיות ולא אנטיביוטיות. בהשוואה לניסויים הסטנדרטיים בהשעיית חיידקים, ניתן להדליק ולכבות את השפעת התרופה שוב ושוב על פני תקופות זמן מבוקרות. התבוננות חוזרת ונשנית באותה אוכלוסיית חיידקים אפשרית במהלך אותו ניסוי.

Introduction

עליית ההתנגדות החיידקית מגבירה את הצורך בבדיקות רגישות אנטיביוטיות מבוססות פנוטיפ מהירות על מנת להגן על התרופות שלנו של המוצא האחרון. בדיקות רגישות סטנדרטיות מבוססות על עיכוב גדילה חיידקית בנוכחות אנטיביוטיקה שלוקח כמה (8-24) שעות כדי להשלים. פיתחנו בדיקת רגישות אנטיביוטית חדשנית על פלטפורמה מיקרופלואידית המסתמכת על הפעלת מתח של מסלולים ביוסינתטיים כדי להאיץ את פעולת האנטיביוטיקה.

בדיקות רגישות לאנטיביוטיקה בקנה מידה microfluidic לשאת את היתרון של שימוש יעיל מדגם, שכן הם דורשים מספר קטן של חיידקים. בנוסף, התקנים microfluidic ניתן multiplexed על מנת לבדוק דגימות מרובות בתנאים מרובים^1,2. לאחרונה, מספר שיטות microfluidic עבור בדיקות רגישות לאנטיביוטיקה דווחו^3-9. בשיטות אלה, חיידקים גדלים בתוך טיפות ננו ופיקוליטר^3,7, בנפח המלא של הערוץ המיקרופלואידי^4-6,8, או כמו חיידקים בודדים מקומיים חשמלית על פני השטח התחתון של^{הערוץ 9}. למרות בדיקות אלה מתבצעות בערוצים microfluidic, כולם לפקח על צמיחה מיקרוביאלית בנוכחות והיעדר אנטיביוטיקה דומה לשיטות מסורתיות. מדידות צמיחה מתבצעות באמצעות צפיפות אופטית, צבעים רגישים ל- pH או תמונות ניגודיות או פלואורסצנטיות בהירות של שדה/פאזה. למרות שחלק מבדיקות אלה מהירות יותר משיטות מסורתיות, כל אחת מהן מזהה באופן פסיבי עמידות לאנטיביוטיקה. במילים אחרות, שיטות אלה עדיין דורשות מהמשתמש לחכות לצמיחת חיידקים כמו הקריאה הסופית.

לעומת זאת, פיתחנו שיטה המשתמשת בשילוב של גזירה ומתח אנזימטי כדי להפעיל מסלולים ביוכימיים רגישים לאנטיביוטיקה¹⁰. קריאת תיגר על החיידקים הדגיש עם אנטיביוטיקה אלה יוצרת בדיקת רגישות מהירה יותר. חיידקים עמידים לאנטיביוטיקה מסוגלים לעמוד בתנאים מלחיצים. חיידקים רגישים, לעומת זאת, נהרגים במהירות על ידי הלחצים המשולבים. אחוז המוות של תאים לאחר שעה אחת, הנמדד על ידי מיקרוסקופיה באמצעות כתם תא מת פלואורסצנטי, מגדיר את הפנוטיפ של החיידקים (עמיד לעומת רגיש).

ליישום מוצלח של השיטה שלנו, חיידקים חייבים להיות משותקים על המשטח התחתון של הערוץ המיקרופלואידי. בדרך זו, חיידקים יכולים להיות נתונים ללחצים שונים ובמקביל להדמית תחת מיקרוסקופ במישור אחד. שקופית זכוכית מיקרוסקופ מצופה משמשת לשיתוק חיידקים. השקופית היא precoated על ידי היצרן עם קבוצות אפוקסיד עבור מחייב חלבון לא ספציפי. הכריכה הלא ספציפית של אפוקסידים אלה לחלבוני פני השטח החיידקיים מחברת את החיידקים למשטח השקופית.

זנים נבדקים בתנאים זהים (גזירה + מתח אנזימטי) בהיעדר (שליטה) ונוכחות (ניסוי) של אנטיביוטיקה. תמונות מיקרוסקופ של ניגודיות פאזה ופלואורסצנטיות של כל ערוץ נלקחות באופן אוטומטי כל שתי דקות למשך שעה אחת. כינויי התנגדות נעשים לאחר מכן על ידי השוואת אחוז החיידקים המתים בערוץ הניסוי לאלה הנמצאים בערוץ הבקרה. לאחר שעה אחת, מדגם עם אחוז מוות של תא גדול מ -1% נחשב רגיש, בעוד פחות מ 0.5% מוות מעיד על התנגדות. אחוזים הנכללים בין שני ניתוקים אלה נחשבים לא מוגדרים ויש לבדוק שוב את המדגם.

ערוצים מיקרופלואידיים מוגדרים ב- PDMS, שהוא חומר המועדף על מכשירים מיקרופלואידיים¹¹. PDMS שקוף אופטית במגוון רחב של אורכי גל, תואמים ביולוגית, אינרטיים, חדירים לגזים ויש לו חדירות נמוכה לנוזלים; לכן הוא מתאים היטב לניסויים אלה.

מתח מכני/גזירה נוצר על ידי זרימת מדיית טמפרטורת החדר על פני החיידקים משותקים. (הערה: התחממות המדיה ל 37 °C (69 °F) אין השפעה משמעותית על תוצאת התסעפות.) משאבות מזרק אוטומטיות מאלצות מדיה (המכילה כתם תא מת +/- אנטיביוטי, כמו גם גורמי לחץ אנזימטיים אופציונליים) דרך הערוצים המיקרופלואידיים (200 מיקרומטר x 400 מיקרומטר) בקצב זרימה של 1 מ"ל / דקה כדי לתת 6.25 kPa של כוח גזירה או קצב גזירה של 6,000 שניות^-1. שיעור זה שווה או עולה על הלחצים גזירה שנחקרו בעבר על Staphylococci.

האנזים, lysostaphin, נבחר לניסויים ראשוניים כי זה גורם נזק ישיר לקיר התא סטפילוקוקוס. הריכוז של lysostaphin (0.7 ng/ml) הספיק כדי לגרום נזק לקיר התא החיידקי, אך לא מספיק כדי לגרום למוות של תאים חיידקיים ללא אנטיביוטיקה במסגרת הזמן של הניסוי. Lysostaphin אינו נדרש לייעוד הנכון של רגישות חיידקית אבל זה להגדיל את התוצאה, המוביל מוות תאי מוגבר זנים רגישים. לעומת זאת, לחץ גזירה הוא קריטי לתפקוד מבחנים. כאשר זני סטפילוקוקוס אוראוס רגישים למתיצילין מטופלים בליזוזאפין ובאוקסצילין בהעדר זרימה, לא נרשם מוות תאי במהלך הניסוי.

הכדאיות של התא מנוטרת עם כתם תא מת פלואורסצנטי¹². בחירת הצבע התבססה על יכולתו להכתים באופן סלקטיבי רק תאים פגומים, על אי-ציותו לתאים חיים ועל פלואורסצנטיות הרקע הנמוכה שלו, שאפשרה את הוספתו הישירה למדיית התאים ללא צעדים נוספים. הבחירה של ריכוז צבע פלואורסצנטי של 0.25 מיקרומטר הייתה להשיג רמות אות מקובלות במהלך זמן חשיפה של 1.6 שניות לאור עירור פלואורסצנטי.

הבטא-לקטם, אוקסצילין, שימש במחקרים הראשוניים שלנו. מינים עמידים בפני מתיצילין S. aureus (MRSA) עמידים בפני אוקסצילין ולא יראו מוות תאי ניכר במסגרת הזמן של הניסוי. הריכוז של 50 מיקרוגרם / מיליליטר נקבע במחקרים הראשוניים. ריכוזים נמוכים יותר של אנטיביוטיקה נתנו פחות הפרדה בין זנים עמידים רגישים, בעוד ריכוזים גבוהים יותר לא גרמו להבדל ניכר בתוצאות הניסוי.

דיווחנו בעבר על פיתוח מוצלח של בדיקה המשלבת לחצים מכניים ואנזימטיים המשפיעים ישירות על דופן התא החיידקי¹³ עם אנטיביוטיקה המעכבת את הביוסינתזה של דופן התא^14,15. ניסויים אלה הוכחת העיקרון בוצעו על פאנל של MRSA ומתיצילין רגיש S. aureus (MSSA). עם זאת, עם הבחירה של פרמטרים ניסיוניים נאותים, השיטה שלנו צריכה להיות ישימה על מינים מרובים של חיידקים ומחלקות מרובות של אנטיביוטיקה.

Protocol

1. הפוך את שכבת PDMS (איור 1)

1. מערבבים במרץ PDMS וסוכן ריפוי ביחס של 10:1. כדי להסיר בועות, degas את התערובת צמיג בתא ואקום במשך 1 שעה בטמפרטורת החדר.
2. בקנה מידה, יוצקים את PDMS לאט על תבנית האלומיניום. יוצקים מהמרכז ושומרים על התבנית מאוזנת. הקפד להשאיר את הפינים חשופים. להפסיק לשפוך פעם אחת משקל היעד מושגת.
   התבנית שלנו דורשת 4 גרם של PDMS ו 0.4 גרם של ריאגנט ריפוי.
3. מיישרים את התבנית בתוך תנור, ומרפאים ב-37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
   זמני ריפוי חלופיים הם 2 שעות ב 60 מעלות צלזיוס או 1 שעה ב 90 מעלות צלזיוס.
4. לנתח את שכבת PDMS נרפא לאורך קצה התבנית בזהירות לקלף אותו משטח עובש עם זוג מלקחיים. נקה את משטח התבנית עם 70% אתנול וקצה Q.

2. להרכיב את תא הזרימה לפי איור 2

הרכבה סטנדרטית של PDMS עם מגלשות זכוכית נעשית באמצעות טיפול בפלזמת חמצן בשני המשטחים, המבטיח חיבור ללא דליפה בין PDMS ומגלשת זכוכית מיקרוסקופ. בפרוטוקול שהוצג, טיפול הפלזמה יהרוס את הציפוי הכימי במגלשת הזכוכית. לכן המגלשה אטומה בלחץ ולא פלזמה מטופלת.

1. מניחים את חלון הזכוכית בכיס תא הזרימה.
2. הנח שקופית זכוכית מצופה מעל חלון הזכוכית בתוך הכיס של תא הזרימה כאשר הצד הפעיל למעלה, והנח את שכבת ה- PDMS עם ערוצים הפונים כלפי מטה מעליה. מקם את שקופית ה- PDMS באופן כזה שכניסות הערוצים יתיישרו עם חורי הכניסה בלוח המתכת. בעדינות לדחוף את האוויר מתוך בין השכבות.
3. הפוך את מכלול שקופית הזכוכית/PDMS כך שה- PDMS יפונה לחלון הזכוכית. חפף את כניסות ערוץ PDMS עם חורי הכניסה בלוח המתכת.
4. מניחים את לוחית הלחץ למעלה ומהדקים את הברגים.
5. הנח את תא הזרימה המורכב מתחת למיקרוסקופ. הגדר את הגדלת המיקרוסקופ ל- 60X ויישר מראש את מיקומי הערוצים.

3. הכן חיידקי שלב יומן

1. יום לפני הניסוי: לחסן 50 מ"ל של מרק מולר הינטון המכיל 2% NaCl (MH2) עם מושבת חיידקים. לנער ב 250 סל"ד לילה ב 37 מעלות צלזיוס.
   זן חיידקי אחד או שניים ניתן ללמוד בניסוי אחד עבור ההגדרה המתוארת.
2. לפני הניסוי: מערבבים 50 מיקרוליטר של תרבות חיידקים לילה לתוך 50 מ"ל של מדיה MH2. לנער ב 250 סל"ד במשך 3 שעות ב 37 מעלות צלזיוס כדי להבטיח את החיידקים נמצאים בשלב יומן.

4. לחמם את רכיבי הפתרון הניסיוני לפחות 10 דקות לפני שהם נדרשים

1. להפשיר את הצבע הפלואורסצנטי (5 מ"מ מלאי) ו lysostaphin (10 מיקרוגרם / מיליליטר מלאי) בטמפרטורת החדר.
2. מחממים את אבקת האוקסצילין לטמפרטורת החדר.

5. להכין ולטעון את ההשעיה החיידקית

1. לאחר סיום תת-תרבות של 3 שעות: יש ליטול 10 מ"ל של תרבות חיידקים וצנטריפוגה ב-1,650 x גרם למשך 2 דקות.
2. הסר את החיידקים supernatant ו resuspend ב 1 מ"ל של מדיה MH2 טרי.
3. חבר אורך קצר של צינורות למזרק מנעול Luer 1 מ"ל. לשטוף את צינורות המזרק עם 1 מ"ל של מדיה. השאירו קצת מדיה בצינורות כדי למנוע בועות אוויר בעת ציור ההשעיה חיידקי.
4. טען 0.7 מ"ל של חיידקים מסוג 1 לתוך המזרק. למלא שני ערוצים של תא הזרימה עם סוג חיידקים 1. צפה עבור הנוזל להופיע בצד השני של הערוץ לאחר ca. 150 μl.
   השקיפות של הערוץ משתנה כפי שהוא מלא חיידקים.
5. אם אתם מתנסים בסוגי חיידקים מרובים, חזרו על הליך הטעינה של חיידקים מסוג 2 לשני הערוצים הנותרים של תא הזרימה.
6. מניחים את תא הזרימה בתוך האינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות כדי לאפשר התיישבות חיידקית והחזקה למשטח השקופית.

6. להכין ולטעון את הפתרונות הניסיוניים

1. הכן 140 μl של 0.5 מ"מ פתרון צבע פלואורסצנטי על ידי ערבוב 14 μl של מלאי צבע פלואורסצנטי (5 mM) ו 126 μl של מדיה MH2.
2. לדלל 10 מ"ג של אוקסצילין ב 40 מ"ל של מדיה MH2 כדי לקבל ריכוז סופי של 250 מיקרוגרם / מ"ל oxacillin.
3. הכן 130 מ"ל של פתרון בקרה עם ריכוזים סופיים של 0.25 μM צבע פלואורסצנטי ו 0.7 ng/ml של lysostaphin. כדי לעשות זאת, לערבב 65 μl של צבע פלואורסצנטי (0.5 מ"מ), 9.12 μl של מלאי lysostaphin (10 מיקרוגרם / מיליליטר) ו 130 מ"ל של מדיה MH2.
4. הכן 130 מ"ל של פתרון אנטיביוטי עם ריכוזים סופיים של צבע פלואורסצנטי 0.25 מיקרומטר, 0.7 ng/ml של lysostaphin, ו 50 מיקרוגרם / מיליליטר אוקסצילין. כדי לעשות זאת, לערבב 65 μl של צבע פלואורסצנטי (0.5 מ"מ), 9.12 μl של מלאי lysostaphin (10 מיקרוגרם / מיליליטר), 26 מ"ל של אוקסצילין (250 מיקרוגרם / מיליליטר) ו 104 מ"ל של מדיה MH2.
5. ממלאים שני מזרקים 60 מ"ל עם פתרון בקרה ושני מזרקים 60 מ"ל עם פתרון אנטיביוטי. שמור על פתרונות עטופים בנייר אלומיניום כדי למנוע השפלה הנגרמת על ידי אור של ריאגנטים.
   למלא יתר על הים את המזרקים כדי להסביר את ההפסד עקב שטיפה של צינורות.
6. הסר בועות אוויר מהמזרקים על-ידי החלקה. חבר ומלא צינורות קלט לקצה עם הפתרון הניסיוני.
7. הר מזרקים על המשאבה. מקם תחילה את המזרק עם הנפח הקטן ביותר ולאחר מכן נעל את מיקום הבוכנה. להתאים את שאר המזרקים על המשאבה, לסחוט את הבוכנות שלהם לפי הצורך.
8. הגדר את מהירות המשאבה ל 1 מיליליטר / דקה ואת נפח המשאבה ל 60 מ"ל. לעשות סומק עם המשאבה עד זרם קבוע של נוזל נראה מכל המזרקים.

7. הגדרת תא הזרימה מתחת למיקרוסקופ

1. הסירו את תא הזרימה מהצנטריפוגה והרכיבו אותו על במת המיקרוסקופ (איור 3).
2. חבר צינורות קלט/פלט לכל אחד מתעלות תא הזרימה (פלט קלט/פלט אחד לערוץ).
   איסוף פלט לארבעה גורמים מכילים שונים מאפשר מדידה של אמצעי אחסון בודדים של פלט ערוץ.

8. הפעל את הניסוי בן 60 הדקות

1. בדוק את העמדות החתונות מראש משלב 2.5. אם שדה התצוגה של המיקרוסקופ אינו ממורכז בערוץ ו/או נמצא מחוץ למוקד, התאם את ההגדרות ושמור את המיקומים החדשים.
   התמקדות מדויקת לא יכולה להיות אפשרית לפני תחילת הזרימה בשל הצפיפות הגבוהה של חיידקים טעונים.
2. הגדר את זמן הרכישה של ניגודיות הפאזה ל- 10 msec ואת זמן רכישת הפלואורסצנטיות ל- 1,600 msec.
3. השג תמונות ניגודיות פאזה ופלואורסצנטיות עבור כל מיקום לפני התחלת הזרימה.
   זה נותן הערכה איכותית של צפיפות החיידקים הטעונים.
4. התחל את זרימת הנוזלים ומיד לבדוק כי המיקרוסקופ מתמקד בתחתית הערוצים.
5. קח תמונות ניגודיות פאזה ופלואורסצנטיות של אזורי היעד בתוך הדקה הראשונה של הזרימה.
6. רכוש תמונות כל 2 דקות לאחר קבוצת התמונות הראשונה עד שתתרחש זרימה של 60 דקות. התמקד מחדש לפי הצורך.

9. לחטא את תא הזרימה

1. הפוך פתרון אקונומיקה 10% ב כיף (100 מ"ל). ממלאים 4 x 20 מ"ל מזרקים עם 10 מ"ל של התערובת. לרוקן את המזרקים ולחבר אותם לתא הזרימה.
   זה ייקח ~ 1-2 דקות עבור הערוצים כדי להיות ברור של חיידקים.
2. הגדר את מהירות המשאבה ל 1 מיליליטר / דקה ואת נפח המשאבה ל 3 מ"ל. לרוץ במשך 3 דקות.
3. מלאו 4 x 60 מ"ל מזרקים עם 60 מ"ל של מים DI. לרוקן את המזרקים ולחבר אותם לתא הזרימה.
4. הגדר את מהירות המשאבה ל 1 מיליליטר / דקה ואת נפח המשאבה ל 30 מ"ל. לרוץ במשך 30 דקות.
5. לפקח על ניקוי הערוצים מתחת למיקרוסקופ.
6. לפרק את תא הזרימה. בטל את שקופית האפוקסי הנמצאת בשימוש. משרים את רכיבי תא הזרימה במים DI במשך 20 דקות.

10. לנתח תמונות וליצור נתונים

1. ספור את מספר החיידקים בכל תמונה.
   תוכנת הגישה הפתוחה, CellProfiler משמשת לביצוע עיבוד תמונת^{אצווה 16}. חלוקה לרמות גבוהה של רוטינות CellProfiler מסוכמת בטבלה 1. מספר החיידקים הנמצאים בתמונת ניגודיות הפאזה (N_p)נותן את ספירת החיידקים הכוללת. מספר החיידקים הנראים בתמונת הפלואורסצנטיות (N_f)נותן את מספר החיידקים המתים.
2. לחשב את אחוז התמותה של תאי חיידקים מנורמלים כפונקציה של זמן.
   1. יבא N_f ו- N_p עבור תמונות בודדות לתוכנת ניתוח הנתונים.
   2. לחשב את השבר של חיידקים מתים בכל ערוץ בנקודת זמן ספציפית שניתנה על ידי השבר (N_f / N_p) ב t = T.
   3. הפחת את שבר החיידקים המתים הנמצאים בתחילת הניסוי (t = 1 min) הן עבור הבקרה והן עבור ערוצי הניסוי.
   4. הפחת את השבר של חיידקים מתים הנמצאים בערוץ הבקרה מזה שנמצא בערוץ הניסוי בכל נקודת זמן עם המשוואה הבאה:
      
      
   
   
   5. _{גרף DP נורמה} לעומת t במהלך הניסוי.
      שים לב כי מדגם עם אחוז מוות של תא גדול מ 1% נחשב רגישים, בעוד פחות מ 0.5% מוות מעיד על התנגדות. אחוזים הנכללים בין שני ניתוקים אלה נחשבים לא מוגדרים ויש לבדוק שוב את המדגם.
   6. השתמש בגיליון אלקטרוני כדי לסכם ולנתח תוצאות מניסויים שונים.

תוצאות

הנתונים המוצגים באיור 4 מראים את התגובה של זן סטפילוקוקוס אוראוס רגיש לאורך זמן בערוץ מיקרופלואידי המכיל אנטיביוטיקה. תמונות ניגודיות פאזה שנרכשו בשעה ובסוף הניסוי של שעה מוצגות באיורים 4A ו- B. הנתונים המנותחים של שעה מוצגים באיור 4C כאשר החיי...

Discussion

הפרוטוקול שהוצג אומת ואופטימיזציה בסדרה של ניסויים עם זני סטפילוקוקוס אוראוס רגישים למתיצילין ועמידים במתיצילין¹⁰. לכן, פרוטוקול זה ללא שינוי צריך להיות ישים ישירות זנים אחרים של S. aureus ואנטיביוטיקה אחרים עם מנגנונים של פעולה המשפיעים על ביוסינתזה של דופן התא החיידקי. סוגי...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
SYTOX Green	Invitrogen Corporation	S7020	Dead cell fluorescence stain
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma Aldrich, Inc	A9418-5G	Used for lysostaphin storage
Sodium Acetate	Sigma Aldrich, Inc	S8750-500G	Used for lysostaphin storage
Lysostaphin	Cell Sciences	CRL309A	Arrives as 1 mg solid. For storage: Dissolve in 20 mM sodium acetate. Mix with BSA solution to final concentration of 1% BSA and 100 µg/ml  lysostaphin for storage
Oxacillin salt	Sigma Aldrich, Inc	28221-1G	Antibiotic
Mueller Hinton Broth	Fisher Scientific	DF0757-17-6
Sodium chloride	Sigma Aldrixh	S3014-500G	2% added to Mueller-Hilton broth prior to autoclaving
1 ml, Luer-lock syringe	BD (Beckton, Dickinson and Comp.)	14-823-2F
2 oz, Luer-lock syringe	BD (Beckton, Dickinson and Comp.)	309653 - 60 mL	Overfill to ~65 ml
Microscope
Inverted Fluoresccence Microscope Olympus IX-70	Cambridge Scientific	9349
60X, Fluorescence/Phase contrast objective	Olympus Corp.	LCPlan F1 60x/0.70 Ph2
Retiga 12-bit monochrome CCD camera	QImaging	RET-4000R-F-M-12-C
Microscope automation
Shutters phase contrast/fluorescence	PRIOR Scientific	H204/H202
X/Y Stage	PRIOR Scientific	H107AENN
Focus motor	PRIOR Scientific	H122
Joystick for XYZ control	PRIOR Scientific	CS152EF
Proscan Controller	PRIOR Scientific	H3-XY2
Image Acquisition Software	Fraunhofer CMI
Flow Cell Assembly and PDMS
Flow Cell	BU Scientific Instruments Facility/Fraunhofer CMI	3333-1044	Engineering drawings were produced by Fraunhofer CMI
Glass window	Fraunhofer CMI	3333-1054	Glass window was cut to the proper size at Fraunhofer CMI
BOROFLOAT Window 50 mm x 50 mm	Edmund Optics Inc.	NT48-543
Sealing plate	BU Scientific Instruments Facility	3333-1045
Epoxide glass slide	Arrayit Corporation	SuperEpoxy 2
PDMS master	Fraunhofer CMI	3333-1053	Master machined in aluminum or brass with UPM-0005 (ultrapresicion fly-cutting machine)
PDMS slide design	Fraunhofer CMI	3333-1053
Tubing
Nut, Super flangeless Tinytight, headless, 1/16 in, PEEK, green	IDEX Health Science	M-644-03	Flow cell inputs/outputs are tapped for this ferrule
Ferrule, Tinytight, 1/16 in, 6-40, .030 in TH, PEEK w/ SS lock ring, black	IDEX Health Science	M-657
Nut, Super flangeless Tinytight, headless, 1/16-1/32 in, 1/4-28, PEEK, natural	IDEX Health Science	P-255
Ferrule, Super Falngeless, 1/16 in, Tefzel (ETFE), yellow	IDEX Health Science	P-259	Fits Luer-lock adapter
Tubing, Teflon FEP, .030 in x 1/16 in x 20 ft, green	IDEX Health Science	1520G
Adapter, quick connect female Luer to female 1/4-28, PEEK, red	IDEX Health Science	P-658