בידוד, תרבות והשתלה של תאי לווין שריר

Summary

הבידוד והתרבות של אוכלוסייה טהורה של תאי לווין שקטים, אוכלוסיית תאי גזע שריר, הוא חיוני להבנה של ביולוגיה שרירים תאי גזע והתחדשות, כמו גם בתאי גזע להשתלה עבור טיפולים בניוון שרירים ומחלות ניווניות אחרות.

Abstract

תאי לווין בשרירים הם אוכלוסייה של תאי גזע הנדרשת לפיתוח שרירי שלד לאחר לידה והתחדשות, והיוו 2-5% מגרעיני sublaminal בסיבי שריר. בשריר בוגר, תאי לווין הם בדרך כלל mitotically שקטים. בעקבות פציעה, לעומת זאת, תאי לווין ליזום התרבות תאים לייצר myoblasts, progenies, לתווך ההתחדשות של שריר. השתלה של myoblasts תאים שמקורם בלווין נחקרה באופן נרחב כטיפול אפשרי למחל משובי כוללים ניוון שרירים, אי ספיקת לב, ובעיות בתפקוד אורולוגים. השתלת myoblast לתוך שריר dystrophic שלד, לב infarcted, וצינוריות שתן dysfunctioning הוכיחה כי myoblasts engrafted יכולה להתמיין לסיבי שריר ברקמות המארח ולהציג שיפור תפקודי חלקי במחלות אלה. לכן, הפיתוח של שיטות טיהור יעילה של תאי לווין רדומים מmuscl השלדדואר, כמו גם את הקמתה של תרבויות בלווין שמקורן בתאים והיצמדות למנגנון ושיטות השתלה לmyoblasts, הם חיוניים להבנת המנגנונים המולקולריים מאחורי התחדשות העצמית של תאי לווין, הפעלה, והבחנה. בנוסף, פיתוח הטיפולים מבוססי תאים לניוון שרירים ומחלות אחרות משובי תלויים גם בגורמים אלה.

עם זאת, שיטות טיהור פוטנציאלי הנוכחיות של תאי לווין שקטים דורשות שימוש במיון הקרינה המופעל יקר תא מכונות (FACS). כאן, אנו מציגים שיטה חדשה לטיהור המהירה, חסכונית, ואמינה של תאי לווין רדומים משרירי שלד עכבר מבוגרים ידי ניתוק האנזימטית ואחריו תא הופעל מגנטי מיון (MACS). בעקבות בידוד של תאי לווין שקטים טהורים, יכולים להיות מתורבת תאים אלה כדי להשיג מספר גדול של myoblasts אחרי כמה קטעים. טרי מבודד אלהתאי לווין רדומים או myoblasts לשעבר הרחיבה vivo ניתן להשתיל לתוך cardiotoxin (CTX) המושרה התחדשות שריר שלד עכבר כדי לבחון את התרומה של תאים שמקורם בתורם להתחדשות סיבי שריר, כמו גם לתאי תאי לווין לבחינת עצמית והתחדשות פעילויות.

Introduction

תאי לווין בשרירים הם אוכלוסייה קטנה של תאי גזע myogenic ממוקמים מתחת lamina הבסיס של סיבי שריר שלד. הם מאופיינים על ידי הביטוי של Pax7, PAX3, c-Met, M-cadherin, CD34, Syndecan-3, וקלציטונין ^{3 - 1.} תאי לווין הוכיחו להיות אחראי להתחדשות שרירים כמו שריר בתאי גזע. בשריר בוגר, תאי לווין הם בדרך כלל mitotically שקטים ^4-8. בעקבות פציעה, תאי לווין מופעלים, ליזום ביטוי של MyoD, והזן את מחזור התא להרחבת צאצאיהם, המכונה תאים מבשר myogenic או myoblasts ^3. לאחר כמה סיבובים של חלוקת תא, myoblasts לצאת ממחזור התא ונתיך אחד לשני כדי לעבור התמיינות לmyotubes רב גרעיני, ואחריו סיבי שריר בוגר. בקלות ניתן להרחיב Myoblasts מבודד משרירי מבוגרים vivo לשעבר. יכולת myoblasts להפוך לסיבי שריר בהתחדשות שריר ולצורת סיבי שריר מחוץ לרחם ברקמות nonmuscle מנוצלים על ידי השתלת היצמדות למנגנון, גישה טיפולית פוטנציאלית בניוון שרירים דושן (DMD) ^4, חוסר תפקוד אורולוגית ^9, ואי ספיקת לב ^10. ואכן, myoblasts הושתלה בהצלחה בשרירים של שני עכברי MDX (מודל DMD) וחולי DMD ^11-14. Myoblasts הנורמלית הזריקו הפתיל עם סיבי שריר מארח כדי לשפר את ההיסטולוגיה ותפקוד של השריר הפגוע. עבודות קודמות הראו כי אוכלוסיות של myoblasts הם יותר גזע דמוי תא ולהישאר במצב מובחן יותר בשריר במהלך התחדשות שרירים ^5. מחקר שנערך לאחרונה הראה כי תאי לווין מבודדים טרי משרירים בוגרים להכיל אוכלוסייה כמו תא גזע שמפגינה engraftment יעיל יותר ופעילות התחדשות עצמית בהתחדשות השריר ^5-8. לכן, טיהור של אוכלוסייה טהורה של תאי לווין רדומים מmu שלד המבוגרscle הוא חיוני להבנת הביולוגיה של תאי לווין, myoblasts והתחדשות שרירים, ולפיתוח טיפולים מבוססי תאים.

עם זאת, שיטות טיהור פוטנציאלי הנוכחיות של תאי לווין שקטים דורשות שימוש במיון הקרינה המופעל תא מכונה יקר (FACS) ^1,2,6-8. בנוסף, חשיפת לייזר FACS נוטה לגרום למוות של תאים בהפרדה, מה שגורם לתשואה נמוכה של תאי לווין שקטים ^15. כאן, אנו מציגים שיטה חדשה לטיהור המהירה, חסכונית, ואמינה של תאי לווין רדומים משרירי שלד עכבר מבוגר. בשיטה זו משתמשת דיסוציאציה האנזימטית ואחריו תא הופעל מגנטי מיון (MACS). בעקבות בידוד של תאי לווין שקטים טהורים, יכולים להיות מתורבת תאים אלה כדי להשיג מספר גדול של myoblasts אחרי כמה קטעים. כמו כן, אנו מראים כי זריקה תוך שרירית של תאים אלה מבודדים טריים שקטים לווין או לשעבר viניתן להשתיל myoblasts vo התרחבה לcardiotoxin (CTX) המושרה התחדשות שריר שלד עכבר כדי לבחון את התרומה של תאים שמקורם בתורם להתחדשות סיבי שריר, כמו גם לתאי תאי לווין לבחינת פעילות התחדשות עצמית.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

החיות שוכנו בסביבת SPF והיו במעקב על ידי המשאבים בבעלי חיים למחקר (RAR) של אוניברסיטת מינסוטה. . החיות מורדמים באמצעים מתאימים (משאיפת CO ₂ או הזרקת KCl לאחר שהרדים עם זריקת ה-IP של Avertin (250 מ"ג / קילוגרם) כל הפרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC, מספר קוד: 1,304-30,492 ) מאוניברסיטת מינסוטה.

1. בידוד של תאי mononuclear משרירי שלד עכבר

1. כראוי להקריב 1 או 2 עכברים בוגרים צעירים (3-8 שבועות).
   1. לצבוט ושסף את העור של הבטן במספריים חדים. לקלף את העור כדי להראות לחלוטין זרוע אחורית ושרירים גפיים אחוריות (למשוך את העור בכיוונים מנוגדים).
   2. הסר את כל שרירי הרגליים בשלד (שוקה קדמית, הגסטרוקנמיוס, והארבעה ראשיות) וזרוע האחורית לאורך העצמות במספריים. לאחר מכן להעביר לשרירים קרים כקרח, סטרילי PBS בצלחת 10 סנטימטר.
2. שטוף דם משרירים בPBS ושרירים העברה לצלחת 6 סנטימטר סטרילי חדש: צלחת 1 ל1-2 עכברים.
3. הסרת רקמת חיבור, כלי דם, צרורות עצבים ורקמות adipogenic תחת מיקרוסקופ לנתיחה.
4. בעזרת מספריים לרפואת עיניים, לחתוך ולקצץ את הרקמה לתוך עיסה חלקה (איורים 1 א ו 1 ב '). נסה לא להשאיר חתיכות גדולות, כפי שהם לא מתפרקים בקלות על ידי פתרון האנזים.
5. העבר את השרירים טחונים לתוך צינור מיליליטר פלקון 50, ולהוסיף 5 מיליליטר של תמיסת collagenase (0.2% סוג collagenase FBS 2 ב10% בDMEM). לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות.
6. Triturate (למעלה ולמטה עם G מחט 18) לhomogenize תערובת (תרשים 1C). ואז עוד יותר דגירה את התערובת על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
7. Triturate שוב לhomogenize תערובת להתפרקה להשעית תא בודדת. להוסיף 2% FBS בDMEM עד 50 מיליליטר לתוך ההשעיה התא בודדת ומערבביםכן.
8. הנח מסננת תא (70 מיקרומטר) על גבי צינור מיליליטר פלקון 50 (1D איור). מעביר את supernatant המכיל את התאים ניתקו על גבי מסננת תא, ופיפטה ההשעיה התא למעלה ולמטה על המסנן עד שזה עובר.
9. ספירת מספר תאים על ידי hemocytometer. צנטריפוגה הצינורות ב 2,000 סל"ד ב-C ° 4 למשך 5 דקות; לשאוב וזורקים supernatant.
10. Resuspend עם FBS 10 מיליליטר של 2% בDMEM. צנטריפוגה הצינורות ב 2,000 סל"ד ב-C ° 4 למשך 5 דקות; לשאוב וזורקים supernatant.
11. Resuspend עם 200 μl של 2% FBS DMEM ובהשעית תא העברה ל1.5 מיליליטר microcentrifuge צינורות. בדרך כלל, צריכים להיות שנקטפו על 2 x 10 ⁶ תאים משרירים של עכבר 1. תאים יהיו מדוללים לריכוז של 1 x 10 ⁶ תאים בשיעור של 2% FBS 100 μl DMEM.

2. נוגדן מכתים והפרדה עם MACS

במהלך יחסי הציבור הבאיםocedures, לשמור על תנאים סטריליים באמצעות מאגרי סטרילי. כל כרך של נוגדנים הוסיף ובינוני השעיה התא מחושב עבור תאים משרירים של עכבר 1 כולה. אם תאים נקצרים מן 2 או יותר עכברים, כמות של חומרים כימיים צריכה להיות מותאמת.

1. הוסף 1 μl כל אחד מCD31-PE, CD45-PE, SCA-1-PE, והנוגדן α7 Integrin ל200 μl של ההשעיה התא. לדגור על קרח במשך 30 דקות.
2. שטוף תאים: לאחר דגירה, להוסיף FBS 1 מיליליטר של 2% בDMEM לתוך ההשעיה תא צינור 1.5 מיליליטר, ו צנטריפוגות ב 2,000 סל"ד ב 4 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות. חזור על פעולה זו פעמיים.
3. לשאוב וזורקים supernatant.
4. תאי resuspend עם 200 μl של 2% FBS בDMEM, ולהוסיף 10 μl של חרוזים מגנטיים Anti-PE. לדגור על קרח במשך 30 דקות.
5. שטוף תאים: לאחר דגירה, להוסיף 1 מיליליטר של חיץ MACS להשעית תא צינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge, ואז צנטריפוגות ב 2,000 סל"ד ב 4 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות. חזור על צעד זה TWקרח. שים לב שהתאים צריכים להיות נשטפו על ידי חיץ MACS לפני שמופרדים על ידי עמודה מגנטית.
6. לשאוב וזורקים supernatant. Resuspend התאים עם 1.0 מיליליטר של חיץ MACS.
7. הגדר את עמודת LD על לוח מגנטי, ולשטוף את העמודה עם 2.0 מיליליטר של חיץ MACS (איור 1E).
8. מעביר את ההשעיה התא על טור LD, ולאסוף את החלק יחסי זרימה דרך לתוך צינור 1.5 מיליליטר. חלק זה מכיל תאי PE-שלילי.
9. צנטריפוגה ב 2,000 סל"ד ב-C ° 4 במשך 3 דקות, לשאוב וזורקים supernatant.
10. תאי resuspend עם 200 μl של 2% FBS בDMEM, ולהוסיף 10 μl של חרוזים מגנטיים אנטי העכבר IgG. לדגור על קרח במשך 30 דקות.
11. שטוף תאים: לאחר דגירה, להוסיף 1 מיליליטר של חיץ MACS לתוך ההשעיה תא צינור 1.5 מיליליטר, ואז צנטריפוגות ב 2,000 סל"ד ב 4 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות. לשאוב וזורקים supernatant. חזור על פעולה זו פעמיים. Resuspend תאים עם 500 μl של חיץ MACS.
12. הגדר את עמודת MS על לוח מגנטי, ולשטוף את העמודה עם 500 μl של חיץ MACS (איור 1F).
13. העברה מושעה פתרון תא על הטור בטרשת הנפוץ, וזורקים את החלק יחסי זרימת דרך (תאי α7 שליליים Integrin).
14. לשטוף עם 1 מיליליטר של חיץ MACS, ולחזור על פעולה זו פעמיים.
15. לאחר השטיפה, להסיר עמודה מהשדה המגנטי של מפריד. החל 1.0 מיליליטר של חיץ MACS על הטור, וelute תאי שכותרתו המגנטי (תאי α7 חיוביים Integrin) לתוך צינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge ידי דוחף את בוכנת המזרק מהחלק העליון של העמודה. לאסוף את הזרימה דרך לתוך צינור 1.5 מיליליטר. חזור על elution עם 1.5 מיליליטר של חיץ MACS ולאסוף את זרימת הדרך.
16. צנטריפוגה ב 2,000 סל"ד ב-C ° 4 במשך 3 דקות, לשאוב וזורקים supernatant.
17. Resuspend תאים מטוהרים עם 1 מיליליטר של היצמדות למנגנון בינוני (20% FBS הכיל כרעיים F-10 עם bFGF), ותאי צלחת על 10 סנטימטר Matrigel מצופהצלחת עם 8 מיליליטר של היצמדות למנגנון בינוני (5 מיליליטר ב6 צלחת סנטימטר) (איור 1G). שים לב שיכולים להיות מבודדים 1-2 x 10 ⁵ תאים שעלולים להיות מיום 1 בשריר עכבר ללא פגע.

3. תחזוקה

1. להאכיל את תאים בכל יום אחר עם מדיום והיצמדות למנגנון. המראה של myoblasts הגוברת הוא של צורה קטנה ועגולה המבטאת MyoD (איור 2) וPax7 (מידע לא מוצג) בגרעין שלהם.
2. Myoblasts צריך להיות passaged לפני מפגש 50% או כאשר מתחילים איחוי תאים. לאחר שטיפת פעם עם PBS, דגירה תאים עם 0.25% פתרון טריפסין על 37 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות בCO ₂ באינקובטור ולאסוף תאים ניתק עם מדיום והיצמדות למנגנון. לאחר תאי צנטריפוגה (1,000 סל"ד במשך 5 דקות), להשעות עם מדיום והיצמדות למנגנון וreplate תאים על צלחות Matrigel מצופים חדשות. ניתן להשתמש בו צלחות מצופים קולגן לאחר חלוף 3. צלחת אחת בדרך כלל ניתן לפצל לשלוש עד חמש צלחות.

4. Differentiation

1. Refeed עם בידול בינוני בכל יום אחר.
2. ביום 1 בבידול בינוני, myoblasts לצאת ממחזור התא ולעבור התמיינות לשרשרת שרירן כבדה (MHC) חיובית myocytes. myoctyes אלה מתחילים איחוי תאים אחד עם השני כדי ליצור myotubes multinucleated. בדרך כלל, רוב myoblasts הפכה myocytes MHC-החיובי המבדיל מונונוקלארים או myotubes (איור 2) ביום 3-5 בבידול בינוני.

5. והיצמדות למנגנון השתלה לעכבר להתחדשות שריר שלד

1. לטשטש את העכבר עם Avertin (250 מ"ג / קילוגרם) על ידי זריקת intraperitoneal (IP).
2. לגלח את שיער העור סביב על שריר שוקה הקדמי (ת"א). עשרים וארבע שעות לפני ההשתלה והיצמדות למנגנון 10 מיקרומטר CTX (50 μl) מוזרק לתוך שריר לנוד / השרירים SCID עכבר ת"א כדי לגרום להתחדשות שריר באמצעות מזרק אינסולין ביום 31 בG דרך עור מגולח (איור60: 3).
3. myoblasts מתרבות הם ניתקו עם 0.25% פתרון טריפסין, וcentrifuged ב 1,000 סל"ד למשך 5 דקות. לשאוב וזורקים supernatant. Resuspend 1 x 10 ⁶ תאים עם 50 μl של 2% FBS DMEM. להעביר את התאים מושעים לתוך מזרק אינסולין ביום 31 G.
4. עכברי נמען יהיו מורדמים עם Avertin (250 מ"ג / קילוגרם) על ידי הזרקת ה-IP, ו1 x 10 ⁶ myoblasts (איור 2) מוזרקות לתוך שריר תוך התחדשות השרירים ת"א.
5. קציר ת"א שריר על ידי 1-4 שבועות לאחר הזרקת תאים לניתוח היסטולוגית (איור 3).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

תאי לווין שקטים מבודדים טרי להציג צורה קטנה ועגולה (איור 1G), וPax7 מפורש כסמן מובהק לתאי לווין שקטים. יותר מ 90% מתאים מבודדים טרי להביע Pax7 (איור 1H ו1I). תאים המזוהמים ביותר הם מתאי דם שאינו גדלים ביעילות במבחנה הבאה תנאי תרבות והיצמדות למנגנון. לפיכך,...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

בפרוטוקול זה, יכול להיות מטוהר תאי לווין רדומים בקלות משרירי שלד מבוגרים של עכברים על ידי עיכול collagenase והפרדת MACS בתיווך נוגדני פני השטח. שיטה זו לוקחת בערך 6 שעות ולא צריכה שום ציוד יקר כגון מכונה FACS. בנוסף, שיטה זו היא זולה יחסית בהשוואה להפרדת FACS בתיווך נוגדני פני השט?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
Collagenase Type 2	Worthington	CLS-2	100 mg
Marigel	BD Biosciences	356234	5 ml
DMEM	Gibco-Invitrogen	10569010	500 ml
Collagen (Rat Tail)	BD Biosciences	354236	100 mg (3-4 mg/ml)
Acetic Acid	Sigma-Aldrich	320099-500ML	500 ml
bFGF, human, Recombinant	Gibco-Invitrogen	PHG0263	1 mg
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A5611-1G	1 g
Ham’s F10 Medium	Gibco-Invitrogen	11550-043	500 ml
Fetal Bovine Serum (FBS)	Fisher Scientific	3600511	500 ml
Horse Serum	Gibco-Invitrogen	26050088	500 ml
Penicillin/Streptmycin	Gibco-Invitrogen	15640055	100 ml
Phosphate Buffered Saline	Gibco-Invitrogen	14190144	500 ml
0.25% Trypsin/EDTA	Gibco-Invitrogen	25200072	500 ml
18 G needle with 12 ml Syringe	Fisher Scientific	22-256-563
Cell strainer (70 μm)	Fisher Scientific	22-363-548
Falcon 50 ml tube	BD Biosciences	352098
Falcon 15 ml tube	BD Biosciences	352097
10 cm Tissue culture plate	BD Biosciences	353003
6 cm Tissue culture plate	BD Biosciences	353004
Falcon 10 ml disposable pipette	BD Biosciences	357551
Anti-CD31 antibody-PE	eBiosciences	12-0311
Anti-CD45 antibody-PE	eBiosciences	30-F11
Anti-Sca1 antibody-PE	eBiosciences	Dec-81
Anti-Integrin α7 antibody	MBL International	ABIN487462
Anti-PE MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-048-801
Anti-Mouse IgG MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-048-402
Mini & MidiMACS Starting Kit	Miltenyi Biotec	130-091-632
MS Column	Miltenyi Biotec	130-042-201
LD Column	Miltenyi Biotec	130-042-901
Cardiotoxin	Sigma Aldrich	C9759-1MG	Stock 10 μM in PBS
31 G Insulin syringe	BD Biosciences	328438
Refrigerated Microcentrifuge (Microfuge 22R)	Beckman Coulter	368826
S241.5 Swinging Bucket Rotor	Beckman Coulter	368882
Refrigerated Centrifuge (Allegra X-22R)	Beckman Coulter	392187
Nod/Scid immunodeficient mice	Charles River Laboratories	Strain Code 394	Use 2 months old mice
Reagents			Recipe
10% and 2% FBS DMEM			DMEM (Gibco-Invitrogen #10569010) with 10% or 2% FBS (Fisher Scientific #03600511) and 1% Penicillin/Streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055).
0.2% Collagenase solution			Collagenase Type 2 (Worthington, #CLS-2), Stock: 50 ml: 100 mg Collagenase Type 2 in 10% FBS DMEM.
10% Matrigel solution			Matrigel (BD Biosciences: #356234) is placed on ice for thawing overnight. Five ml Matrigel is dilute by 45 ml DMEM and 5 ml aliquots are stored at -20 °C until use.
Matrigel-coated plate			Five ml of 10% Matrigel solution is placed on ice for thawing and is used for coating 10 cm plate at room temperature for 1 min. The plate is placed in 5% CO2 incubator at 37 °C for 30 min after removing Matrigel solution, and let the plate dry in culture hood for another 30 min. Removed 10% Matrigel solution is stored at -20 °C for reuse.
0.01% Collagen solution			Mix to final: 0.01% Collagen (Collagen, Rat Tail: BD Biosciences #354236) in 0.2% acetic acid (320099-500ML) in ddH2O.
Collagen-coated plate			Add 5 ml or 2 ml of Collagen solution to a 10 cm or 6 cm tissue culture plate and let sit at room temperature for three hours. Then, aspirate off liquid and allow to dry in culture hood for 30 min to overnight. Plates can be stored at room temperature for several months.
bFGF stock solution			bFGF, Human, Recombinant (Gibco-Invitrogen #PHG0263, 1 mg) is dissolved with 0.1% BSA solution consisting of 1 mg BSA (Sigma-Aldrich #A5611-1G) and 2 ml ddH2O (0.5 mg/ml bFGF). Aliquot 20 μl in 500 μl microcentrifuge tubes and kept in -80 °C.
Myoblast medium			500 ml HAM’S F10 Medium (Gibco-Invitrogen #11550-043) supplemented with 20% FBS (Fisher Scientific #03600511), Penicillin/streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055), and 10 μg of bFGF (20 μl of bFGF stock).
Differentiation medium			500 ml DMEM (Gibco-Invitrogen #10569010) supplemented with 5% Horse serum (Gibco-Invitrogen #26050088) and 1% Penicillin/streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055).
10 μM Cardiotoxin stock			1 mg Cardiotoxin (EMD Millipore #217504-1MG) is dissolved with 13.9 ml PBS.