במקום TEM של מכלולים ביולוגיים בנוזל

Summary

כאן אנו מתארים הליך כדי לדמיין מתחמים ויראליים בנוזל ברזולוציית ננומטר באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים שידור.

Abstract

חוקרים משתמשים באופן קבוע במיקרוסקופים אלקטרונים (TEMs) כדי לבחון ישויות ביולוגיות ולהעריך חומרים חדשים. כאן, אנו מתארים יישום נוסף עבור מכשירים אלה- צפייה במכלולים ויראליים בסביבה נוזלית. שיטה מרגשת וחדשנית זו של הדמיה של מבנים ביולוגיים מנצלת מחזיק דגימה מיקרופלואידית שפותחה לאחרונה. מאמר הווידאו שלנו מדגים כיצד להרכיב ולהשתמש במחזיק מיקרופלואידי כדי לדמות דגימות נוזליות בתוך TEM. בפרט, אנו משתמשים בחלקיקים דו שכבתיים simian rotavirus (DLPs) כמערכת המודל שלנו. אנו מתארים גם צעדים לציפוי פני השטח של התא הנוזלי בביופילמים של זיקה הקושרים DLPs לחלון הצפייה. זה מאפשר לנו לצלם הרכבות באופן שמתאים לקביעת מבנה תלת מימדי. לכן, אנו מציגים הצצה ראשונה של חלקיקים תת-ויראליים בסביבה נוזלית מקומית.

Introduction

מטרה נפוצה של ביולוגים ומהנדסים היא להבין את הפעילות הפנימית של מכונות מולקולריות. מיקרוסקופי אלקטרוני שידור (TEMs) הם מכשירים אידיאליים כדי לדמיין את הפרטים המורכבים האלה ברזולוציה כמעט אטומית^1-2. על מנת לקיים את מערכת ואקום גבוהה של TEM, דגימות ביולוגיות מוטבעות בדרך כלל בסרטים דקים של קרח זגוגי³, סוכרים⁴, מלחי מתכת כבדה⁵, או שילוב כלשהו של⁶. כתוצאה מכך, תמונות של דגימות מוטבעות עשויות לחשוף רק תמונות מוגבלות של תהליכים דינמיים.

ניסיונות מוקדמים לשמור על דגימות ביולוגיות hydrated בתאי נוזלים סביבתיים בוצעו על ידי פרסונס ועמיתיו באמצעות שלבי שאיבה דיפרנציאליים. דפוסי עקיפת אלקטרונים של גבישי קטלאז לא מוכתמים נרשמו בהצלחה לרזולוציה של 3 Å במצב hydrated^7-8. בנוסף, תחומי השומנים מופרדים פאזה ניתן לבדוק קרום hydrated של אריתרוציטים אנושיים^9-10. עם זאת, תנועה הנגרמת על ידי פיזור נוזל והפרעתו לקרן האלקטרונים, גרמה לאובדן רזולוציה חמור וניסויים נוספים באמצעות דגימות ביולוגיות לא נוסו עד לאחרונה.

לאחרונה פותחו מחזיקי דגימה מיקרופלואידית שמשתמשים בשבבים מוליכים למחצה כדי ליצור תא סביבתי בקנה מידה זעיר. התקנים אלה יכולים לשמור דגימות בנוזל בזמן שהם ממוקמים בעמודה TEM^11-12. פריצת דרך טכנית זו בהדמיית TEM אפשרה לחוקרים להציג, לראשונה, אירועים מתקדמים ברמה המולקולרית¹³. אנו מתייחסים לאופן חדש זה כמו " במיקרוסקופיה מולקולריתsitu " כמו ניסויים יכולים להתבצע כעת "בתוך" עמוד EM^14-15. המטרה הכוללת של שיטה זו היא לדמיין מכלולים ביולוגיים בנוזל כדי להתבונן בהתנהגויות הדינמיות שלהם ברזולוציית ננומטר. הרציונל מאחורי הטכניקה המפותחת הוא לתעד תצפיות בזמן אמת ולבחון תכונות חדשות של מכונות ביולוגיות בתמיסה. מתודולוגיה זו מרחיבה את השימוש ב- TEMs למטרות רחבות יותר בביולוגיה תאית ומולקולרית^12-16.

במאמר הווידאו הנוכחי, אנו מציגים פרוטוקול מקיף להרכבה ושימוש במחזיק דגימה מיקרופלואידית זמינה מסחרית. מחזיקים מיוחדים אלה משתמשים שבבי סיליקון ניטריד המיוצרים עם מרווחים משולבים כדי ליצור תא נוזלי המקיף כמויות זעירות של פתרון. חלונות דקים ושקופים חרוטים בשבבים למטרות הדמיה¹². אנו מדגימים את השימוש הנכון של מחזיק microfluidic לבחון חלקיקים דו שכבתיים simian rotavirus (DLPs) בנוזל באמצעות TEM. כדי להבטיח כי מכלולים ביולוגיים, כגון DLPs, לא להתפזר במהירות על פני מרחקים גדולים בעת הדמיה, אנו משתמשים בגישה לכידת אהדה לקשור אותם אל פני השטח של התא microfluidic¹⁶. שלב לכידה מולקולרית זה יש יתרון גדול על פני טכניקות חלופיות להדמיית דגימות ביולוגיות בנוזל מכיוון שהוא מאפשר רכישת תמונות שישמשו לשגרות עיבוד במורד הזרם. שלב לכידה זה המשמש בשילוב עם הדמיה מיקרופלואידית הוא ייחודי להליכים שלנו¹⁷. קוראים המשתמשים ביישומים ביולוגיים מבניים באמצעות TEM או תאי הדמיה מיקרופלואידיים עשויים לשקול את השימוש בטכניקות לכידת אהדה כאשר תצפיות דינמיות ברמה המולקולרית הן המטרה הסופית.

Protocol

1. הכן התקני לכידת קירבות¹⁶

1. נקו את שבבי הסיליקון nitride E על ידי דגירה שלהם ב 15 מ"ל של אצטון במשך 2 דקות ואחריו 15 מ"ל של מתנול במשך 2 דקות(איור 1A). אפשר לשבבים להתייבש תחת זרימת אוויר למינארית.
2. דגירה את השבבים המיובשים על צלחת ערבוב מחוממת (ללא ערבוב) במשך 1.5 שעות ב 150 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן לאפשר להם להתקרר לטמפרטורת החדר לפני השימוש.
3. השתמש מזרקים המילטון להלחין תערובות שומנים בצינורות זכוכית קטנים כדי להכיל 25% כלורופורם, 55% DLPC (1,2-דילאורויל-פוספוצ'ולן) בכלורופורם (1 מ"ג/מ"ל) ו-20% שומנים Ni-NTA (1,2-דיאולויל-אימינודיאקטי חומצה-סוציניל-ניקל מלח) בכלורופורם (1 מ"ג/מ"ל) בנפח כולל של 40 מיקרוגרם.
4. החל 1 μl aliquot של התערובת על כל טיפה 15 μl של מים מילי-Q על חתיכת Parafilm בצלחת פטרי לחה(איור 1B). דגימות דגירה על קרח לפחות 60 דקות.

2. לכידת מקרומולקולות¹⁷

1. הניחו שבב E עם מרווח משולב של 150 ננומטר מעל דגימת מונולאייר והדגירה למשך דקה(איור 1C).
2. הרימו בעדינות את השבב מהדגימה והוסיפו אליקאוט של 3 מיקרומטר של חלבון A. דגירה למשך דקה בטמפרטורת החדר(איור 1D).
3. כתם את הירידה העודפת באמצעות Whatman #1 נייר סינון ומיד להוסיף aliquot 3 μl של פתרון נוגדנים. דגירה במשך דקה בטמפרטורת החדר.
4. הסר את הפתרון העודף באמצעות מזרק המילטון ומיד להוסיף 1 μl aliquot של DLPs rotavirus (0.1 מ"ג / מ"ל) בתמיסת חיץ המכיל 50 מ"מ HEPES (pH 7.5), 150 mM NaCl, 10 mM MgCl₂ ו 10 mM CaCl₂. דגירה לפחות 2 דקות בטמפרטורת החדר. הכנת DLPs תוארה בעבר¹⁸.

3. להרכיב את התא המיקרופלואידי ולטעון את מחזיק דגימת in situ

1. טען את שבב ה-E הרטוב המכיל את הדגימה הנגיפית לקצה מחזיק הדגימה המיקרופלואידית. פריקה זוהרת של שבב E שטוח שני למשך דקה אחת ולאחר מכן נטענת על גבי שבב המרווח(איור 2, לוחות 1.5).
2. לחלופין, כדי להגדיל את הניגודיות של מקרומולקולות ביולוגיות, ניתן להוסיף כתם מתכת כבדה(למשל 0.2% אורניל) לדגימות רטובות לפני הנחת השבב האלקטרוני השני על הדגימה הרטובה. עם זאת, שבב E המכיל את הדגימה יהיה צורך לשטוף עם מים מילי-Q לפני הוספת ריאגנט ניגודיות.
3. כריך את ההרכבה כולה יחד כדי ליצור מארז אטום, מוחזק במקום מכני בתוך המחזיק על ידי 3 ברגים פליז(איור 2,לוחות 6-8).
4. לאחר ההרכבה, קצה המחזיק נשאב ל-10-6 טור באמצעות^תחנת שאיבה יבשה עם משאבת טורבו לפני הנחת המחזיק בתוך ה-TEM.

4. הדמיה בנוזל באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים שידור

1. טען את מחזיק הדגימה במקום למיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (FEI Company) המצויד בסיבי LaB₆ ופועל במהירות של 120 kV.
2. הפעל את חוט ה- TEM והתאם את הגובה האוצנטרי של שלב המיקרוסקופ ביחס לדגימה באמצעות פונקציית הרטט כדי להטות את המדגם מ- -15° ל- +15° הלוך ושוב בעמודה. הליך זה מתאים את השלב בכיוון z כדי לסייע להסביר את העובי הנכון של התא הנוזלי. שלב זה גם מבטיח שנעשה שימוש בהגדלה מדויקת בעת הקלטת תמונות.
3. הקלט תמונות לאורך הקצוות ובאזורים הפינתיים של התא המיקרופלואידי תחילה. אזורים אלה מכילים בדרך כלל את הפתרון הדק ביותר. הקלט תמונות של דגימות בתנאים במינון נמוך (1-3 אלקטרונים / Ų) באמצעות מצלמת CCD. השתמש בהגדלות נומינליות של 6,000X - 30,000X.
4. קבע את ערך ההיתוך הנכון על-ידי התמקדות בקצה התא הנוזלי. השתמש בערך של -1.5 מיקרומטר כדי להקליט תמונות בהגדלה של פי 30,000. אם יתקל בתמיסה עבה או אם לא נעשה שימוש בסוכן ניגודיות בהכנת הדגימה, השתמש בערכי defocus גבוהים יותר בטווח של -2 עד -4 מיקרומטר.
5. כדי להבטיח שהפתרון ייכלל בתא המיקרופלואידי לאורך כל הניסויים, מקד את קרן האלקטרונים עד שהבועות ייווצרו בנוזל שבתוך המכשיר.

תוצאות

תמונות מייצגות של DLPs בנוזל באמצעות שבבי E ששוחררו בזוהר (איור 3A) מציגות פחות DLPs באזור צפייה נתון, ככל הנראה עקב דיפוזיה, בהשוואה ל- DLPs המועשרים במכשירי לכידת קירבה (איור 3B). התוספת של אורניל מתא ההדמיה משפרת את הניגודיות של הדגימה ומכאן את הנראות של DLPs בודדים בתמיסה (איו...

Discussion

בעבודה המוצגת שלנו, השתמשנו בגישת לכידת הזיקה לקשור DLPs rotavirus לפלטפורמה מיקרופלואידית. זה איפשר הדמיה situ של קומפלקסים מקרומולקולריים במיקרו-וירוס נוזלי. גישת הלכידה היא משמעותית ביחס לטכניקות הדמיה מיקרופלואידיות אחרות מכיוון שהיא ממקמת דגימות ביולוגיות לחלון ההדמיה כדי לש...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
E-chips, spacer chip	Protochips, Inc.	EPB-52TBD	400 μm x 50 μm window
E-chip, top chip	Protochips, Inc.	EPT-45W	400 μm x 50 μm window
Ni-NTA lipid	Avanti Polar Lipids	790404P	Powder form
DLPC (12:0) lipid	Avanti Polar Lipids	850335P	Powder form
Volumetric flasks	Fisher Scientific	20-812A; 20-812C	1 ml; 5 ml
Hamilton Syringes	Hamilton Co.	80300, 80400	1-10 μl; 1-25 μl
Whatman #1 filter paper	Whatman	1001 090	100 pieces, 90 mm
Glass Petri dishes	Corning	70165-101	100 mm x 15 mm
Glass Pasteur pipettes	VWR	14673-010	14673-010
Glass culture tubes	VWR	47729-566	6 mm x 50 mm
Acetone	Fisher Scientific	A11-1	1 L
Methanol	Fisher Scientific	A412-1	1 L
Chloroform	Electron Microcopy Sciences	12550	100 ml
His-tagged Protein A	Abcam, Inc.	ab52953	10 mg
Milli-Q water system	EMD Millipore Corp.	Z00QSV001	Ultrapure Water
HEPES	Fisher Scientific	BP310-500	500 g
Equipment
Poseidon In situ specimen holder	Protochips, Inc.		FEI compatible
FEI Spirit BioTwin TEM	FEI Co.		120 kV
Eagle 2k HS CCD camera	FEI Co.		10 Å/pixel sampling at 30,000X
Gatan 655 Dry pump station	Gatan, Inc.		Pump holder tip to 10-6 range
PELCO easiGlow, glow discharge unit	Ted Pella, Inc.		Negative polarity mode
Isotemp heated stir plate	Fisher Scientific		Heat to 150 ºC for 1.5 hr