הזרקת בלוטות תוך-לימפתיות של חלקיקי פולימר מתכלים

Summary

בלוטות הלימפה הן הרקמות החיסוניות המתזמרות את התגובה החיסונית והן יעד קריטי לחיסונים. Biomaterials הועסקו כדי למקד טוב יותר בלוטות הלימפה כדי לשלוט על משלוח של אנטיגנים או אדג'ובנטים. מאמר זה מתאר טכניקה המשלבת רעיונות אלה כדי להזריק חלקיקי פולימר תואמים ביולוגית לתוך בלוטות הלימפה.

Abstract

הדור של תגובה חיסונית אדפטיבית מסתמך על ניקוז יעיל או סחר של אנטיגן לבלוטות הלימפה לעיבוד והצגת מולקולות זרות אלה לימפוציטים T ו- B. בלוטות הלימפה הפכו אפוא למטרות קריטיות עבור חיסונים חדשים immunotherapies. אסטרטגיה עדכנית למיקוד רקמות אלה היא הזרקת בלוטות לימפה ישירה של רכיבי חיסון מסיסים, וניסויים קליניים הקשורים לטכניקה זו היו מבטיחים. מספר אסטרטגיות ביו-חומריות נחקרו גם כדי לשפר את פילוח בלוטות הלימפה, למשל, כוונון גודל החלקיקים לניקוז אופטימלי של חלקיקי חיסון ביו-חומריים. במאמר זה אנו מציגים שיטה חדשה המשלבת הזרקת בלוטות לימפה ישירה עם חלקיקי פולימר מתכלים שיכולים להיות עמוסים ברכיבי אנטיגן, אדג'ובנט או חיסון אחר. בשיטה זו מיקרו-חלקיקים פולימריים או חלקיקים מסונתזים על ידי פרוטוקול אמולסיה כפול שונה המשלב מייצבי שומנים. תכונות חלקיקים(למשל גודל, טעינת מטען) מאושרות על ידי עקיפת לייזר ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית, בהתאמה. בלוטות לימפה עכבר מזוהים לאחר מכן על ידי הזרקה היקפית של צבע מעקב nontoxic המאפשר הדמיה של אתר הזרקת היעד ותצהיר הבא של חלקיקי פולימר בלוטות הלימפה. טכניקה זו מאפשרת שליטה ישירה על המינונים והשילובים של ביו-חומרים ורכיבי חיסון המועברים לבלוטות הלימפה וניתן לרתום אותם בפיתוח חיסונים חדשים מבוססי ביו-חומרים.

Introduction

בלוטות הלימפה (LNs) הם מרכזי הפיקוד של המערכת החיסונית. באתר אימונולוגי זה, תאים המציגים אנטיגן פריים לימפוציטים נאיביים נגד אנטיגנים זרים ספציפיים כדי להפעיל תגובות חיסוניות הסלולר הומוריסטי. LNs הפכו אפוא למטרה אטרקטיבית לאספקת חיסונים ואימונותרפיות. למרבה הצער, רוב אסטרטגיות החיסון לגרום לא יעיל, משלוח חולף של אנטיגן ואדג'ובאנטים לרקמת הלימפה¹. גישות המשפרות את המיקוד והשימור של רכיבי חיסון ב- LNs יכולות אפוא להשפיע באופן משמעותי על העוצמה והיעילות של חיסונים חדשים.

אסטרטגיה אחת לעקוף את האתגר של פילוח LN שהוכיח עניין רב בניסויים קליניים חדשים היא ישירה, תוך LN (i.LN.) הזרקה^2-4. ניסויים אלה השתמשו הדרכה אולטרסאונד כדי לספק חיסונים LNs כהליך אשפוז פשוט. בהשוואה למסלולי הזרקה היקפיים מסורתיים, גישה זו הביאה לחסכוך משמעותי במינון וליעילות משופרת בהקשרים טיפוליים כולל אלרגיות וסרטן^2-4. מחקרים אלה השתמשו בהזרקת חיסונים מסיסים(כלומר נטולי ביו-חומרים) אשר נוקו במהירות על ידי ניקוז לימפתי. לכן, זריקות מרובות- או מחזורים של זריקות מרובות - ניתנו כדי להשיג את ההשפעות הטיפוליות המרשימות האלה. שמירה משופרת ב- LN יכולה לשפר את האינטראקציה בין אנטיגן ו/או אדג'ובנטי לתאי החיסון, ולשפר עוד יותר את העוצמה של הפרימינג של תאי החיסון. פוטנציאל זה נתמך על ידי מחקרים אחרונים המראים קינטיקה של משלוח אנטיגן ואדג'ובנטי לשחק תפקיד קריטי בקביעת התגובה החיסונית הספציפית^{שנוצרה 5-7}. יתר על כן, לוקליזציה ומזעור מינונים של תרופות וחיסונים יכולים להפחית או למנוע השפעות מערכתיות, כגון דלקת כרונית.

ביו-חומרים נחקרו בהרחבה כדי לשפר את העוצמה והיעילות של^{חיסונים 1,8,9}. אנקפסולציה או ספיחה על נושאות ביו-חומריות יכולות להגן פיזית על המטען מפני השפלה ולהתגבר על מגבלות המסיסות. תכונה בולטת נוספת של נושאות מטוסים ביו-חומריות, כגון מיקרו פולימרי או חלקיקים, היא היכולת לטעון מספר סוגים של מטענים, ולאחר מכן לשחרר מטענים אלה על פני מרווחי זמן מבוקרים. עם זאת, מגבלה משמעותית שממשיכה לעכב חיסונים ביו-חומריים ואימונותרפיות ב- vivo אינה יעילה לפילוח של תאים חיסוניים וסחר מוגבל לבלוטות לימפה. לדוגמה, הזרקה היקפית של חיסונים ביו-חומריים דרך מסלולים קונבנציונליים(למשל תוך-עורית, תוך שרירית) מציגה בדרך כלל פילוח LN לקוי, כאשר עד 99% מהחומר המוזרק נותר באתר ההזרקה^4,10. לאחרונה, הגודל של נשאי חיסון ביו-חומריים כבר מכוון כדי לשפר סחר מועדף או ניקוז של חיסונים אלה LNs באמצעות זרימה ביניים^8,10. התקדמות זו הובילה לתגובות חיסוניות משופרות תאיות והומוריסטיות, והדגישה את החשיבות של מיקוד והנדסת סביבת LN לחיסונים חדשים.

נייר זה מציג פרוטוקול חיסון המשלב חלקיקי פולימר מיוצבים שומנים ומשלוח i.LN. כדי ליצור מחסני חיסון בשחרור מבוקר^5,11. בונים על מחקרים שנעשו לאחרונה באמצעות טכניקות כירורגיות עבור i.LN. בעכברים^6,7,12,13, פיתחנו אסטרטגיה מהירה, לא כירורגית להזרקת חיסונים ביו-חומריים בבעלי^חייםקטנים 5 . שילוב של משלוח i.LN. עם נשאי חיסון ביו-חומריים שיפרה בעוצמה את תגובת תאי CD8 T תוך 7 ימים לאחר זריקה אחת של מחסני חיסון בשחרור מבוקר⁵. תגובה הומוריסטית חזקה(כלומר טיטר נוגדנים) נוצרה גם היא; שני השיפורים היו קשורים לשימור מוגבר של רכיבי חיסון בלוטות הלימפה כי היה בתיווך על ידי שחרור מבוקר מן המובילים biomaterial. באופן מעניין, גודלם של חלקיקי החיסון שינה את גורלם של חומרים אלה פעם אחת ב- LNs: חלקיקים ננומטריים הראו ספיגה ישירה מוגברת על ידי תאים, בעוד חלקיקים זעירים גדולים יותר נשארו בסביבת LN חוץ תאית ומטען משוחרר(למשל אדג'ובאנט) שנלקח על ידי אנטיגן תושב LN המציג תאים⁵. נתונים אלה מצביעים על שני מסלולים שניתן לנצל לחיסונים חדשים על ידי שליטה בגודל של ביו-חומרים מוזרקים i.LN.

במאמר זה חלקיקי פולימר מתכלים לייצוב שומנים (מיקרו וננומטריים) מסונתזים באמצעות אסטרטגיית אמולסיה כפולה^{שונה 5,11}. תכונות החלקיקים מתאפיינות בעקיפת לייזר ומיקרוסקופיה. חלקיקים אלה מוזרקים ישירות לתוך LNs מפשעתי מזוהה באופן לא כירורגי באמצעות נפוץ, צבע מעקב nontoxic¹⁴. ניתוח שלאחר הזרקה של LNs על ידי היסטולוגיה או cytometry זרימה ניתן להשתמש כדי לאמת את ההתפלגות של חלקיקים בתוך סביבת LN, כמו גם כדי לפקח על ספיגת הסלולר ושמירה של חלקיקים לאורך זמן. עבור פרוטוקולים המפרטים עיבוד היסטולוגי ו cytometry זרימה, הקוראים מופנים מאמרים JoVE האחרונים ודוחות יומן^15-22. תוצאות אופייניות להדגים מיקוד LN מקומי של מחסנים אלה שניתן לנצל כדי להשיג חזק, תגובות חיסוניות יעילות או כדי להתאים חסינות עבור פתוגנים היעד.

Protocol

כל המחקרים בבעלי חיים בפרוטוקול זה הושלמו בהתאם להנחיות הפדרליות, המדינתיות והמקומיות, ובאמצעות פרוטוקולים שנבדקו ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת מרילנד (IACUC).

1. סינתזה של מיקרו וננו-חלקיקים מיוצבות שומנים

1. בבקבוקון זכוכית 7 מ"ל(ים), לשלב DOPC, DSPE-PEG, ושומנים DOTAP ביחס טוחנת 60:20:20 להכין תערובת שומנים הורים.
   1. כדי לסנתז מדגם יחיד: העבר 242.9 μl, 287.4 μl, ו 71.9 μl, של DOPC, DSPE-PEG, ו DOTAP בהתאמה, לתוך הבקבוקון באמצעות 2 מיליליטר זכוכית פיפטות סרולוגיות.
   2. כדי לסנתז דגימות מרובות: להכפיל כל נפח השומנים לעיל על ידי מספר הדגימות ולשלב לתוך בקבוקון אחד, ולאחר מכן להעביר aliquots שווה של תערובת שומנים זה לתוך בקבוקונים המתאימים לכל מדגם כדי להיות מוכן.
   3. שומנים יבשים תחת זרם עדין של גז חנקן במשך 10 דקות, או מקום בתנור ואקום לילה.
2. בבקבוקון זכוכית יחיד, ריק 20 מ"ל, להמיס 80 מ"ג של PLGA ב 5 מ"ל של dichloromethane עבור כל מדגם חלקיקים כדי ליצור פתרון 16 מ"ג / מ"ל מלאי פולימר.
3. מוסיפים 5 מ"ל של תמיסת פולימר לבקבוקונים המכילים שומנים מיובשים, כובע ומערבולת למשך 30 שניות.
4. לסנתז מיקרו-חלקיקים:
   1. התחל sonicating השלב האורגני המכיל פולימר, שומנים, ומטען מסיס במים אחרים על קרח ב 12 W באמצעות sonicator.
   2. צור את תחליב המים בשמן (w/o) באמצעות פיפטה כדי להוסיף 500 μl של H₂O מזוקק, או H₂O המכיל 1 מ"ג של פפטיד, חלבון, או מטען מסיס במים אחרים.
   3. המשך sonicating במשך 30 שניות ב 12 W על קרח, בעדינות נדנדה הבקבוקון למעלה ולמטה מצד לצד סביב קצה sonicator כדי להבטיח אמולסיה מלאה.
   4. צור את אמולסיה מים בשמן במים (w / o / w) על ידי שפיכת אמולסיה w / o לתוך 40 מל של H₂O ב 150 מל.
   5. הומוגניזציה במשך 3 דקות ב 16,000 סל"ד באמצעות הומוגניזר דיגיטלי.
   6. מוסיפים מוט ערבוב מגנטי, מעבירים את הכף לצלחת ערבוב, ומאפשרים לאמולסיה w/o/w לבחוש בן לילה כדי להסיר את הממס העודף.
5. לסנתז חלקיקים:
   1. התחל sonicating השלב האורגני המכיל פולימר, שומנים, ומטען מסיסים אחרים על הקרח ב 14 W.
   2. צור את אמולסיה w/o באמצעות פיפטה להוסיף 500 μl של H_{מזוקק 2}O, או H₂O המכיל 1 מ"ג של פפטיד, חלבון, או מטען מסיס במים אחרים.
   3. המשך sonicating במשך 30 שניות ב 14 W על קרח.
   4. צור את אמולסיה w / o / w על ידי שפיכת אמולסיה w / o ל 40 מל של H₂O ב 150 מל sonicating במשך 5 דקות ב 16 W על הקרח. בעדינות לנענע את הבקבוקון למעלה ולמטה מצד לצד סביב קצה sonicator כדי להבטיח אמולסיה מלאה.
   5. מוסיפים מוט ערבוב מגנטי, מעבירים את הבקבוק לצלחת ערבוב ומאפשרים לאמולסיה w/o/w לבחוש בן לילה כדי להסיר את הממס העודף.
6. למחרת בבוקר, לשטוף ולאסוף חלקיקים:
   1. יוצקים אמולסיה דרך מסננת תאי רשת ניילון 40 מיקרומטר לתוך צינור חרוט 50 מ"ל.
   2. חלקיקי צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 5,000 x גרם עבור חלקיקים זעירים או 5 דקות ב 24,000 x גרם עבור חלקיקים.
   3. Decant supernatant ולשטוף חלקיקים על ידי שימוש חוזר ב 1 מ"ל של H₂O.
   4. העבר חלקיקים תלויים לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל.
   5. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 5,000 x גרם עבור חלקיקים זעירים או 5 דקות ב 24,500 x גרם עבור חלקיקים.
   6. לשטוף חלקיקים פעמיים יותר על ידי הסרת supernatant, שימוש חוזר 1 מיליליטר H₂O, וצנטריפוגות כמו בשלב 1.6.5. לאחר הכביסה, להשעות חלקיקים 1 מיליליטר H₂O לשימוש מיידי, או lyophilize לאחסון מורחב.

2. מדידת תשואת סינתזה

1. לפני בקבוקון זכוכית ריק 20 מ"ל. הוסף 100 μl של השעיית חלקיקים לבקבוקון preweighed לאחר pipetting למעלה ולמטה עם micropipette לערבב.
2. Lyophilize החלקיקים או יבש תחת זרם עדין של חנקן.
3. שוקלים את הבקבוקון המכיל את הפולימר המיובש. לקבוע את תשואת החלקיקים בבקבוקון על ידי חיסור המשקל המקורי של הבקבוקון ממסת הבקבוקון המכיל את החלקיקים היבשים.
4. קבע את תפוקת החלקיקים הכוללת על-ידי הכפלת מסת החלקיקים בבקבוקון על-ידי גורם הדילול. כדי לקבוע את התשואה באחוזים, חלק את מסת החלקיקים במסת הקלט התיאורטית המרבית והכפל ב- 100%.

3. קביעת גודל החלקיקים

1. נקו את תא שבר הזכוכית בסגנון קובט שסופק על ידי מילוי במים שעברו דה-יון וניגוב עם ספוגית כותנה. להעביר 10 מ"ל של H₂O מזוקק לתא הסיעה ניקה, להוסיף מוט ערבוב מיקרו מגנטי, ולטעון את תא השבר לתוך הרכבה התא של מנתח גודל החלקיקים.
2. כוונן את מהירות הערבוב המגנטית במנתח החלקיקים כדי להשיג ערבוב מלא בתא השבר ולסגור את דלת התא.
3. יישר את הלייזרים לתא השבר באמצעות ממשק תוכנת המכשיר.
4. השתמש בממשק תוכנת המכשיר כדי להקליט קריאה בסיסית כאשר תא השבר מכיל H₂O מזוקק בלבד.
5. פיפט השעיית החלקיקים המקורית למעלה ולמטה עם מיקרופיפט לערבב.
6. פיפטה 10 μl של השעיית חלקיקים (בדרך כלל כ 0.5 מ"ג) לתוך תא השבר. ודא שנפח דגימת החלקיקים שנוספה לתא מספיק כדי ליצור עוצמת אות בטווח המתאים כפי שצוין בממשק תוכנת המכשיר. המסה בפועל של החלקיקים הנדרשת תלויה בתפוקת האחוזים ובתכונות האופטיות של דגימת החלקיקים.
7. סגור את דלת תא מנתח גודל החלקיקים ומדוד את גודל החלקיקים באמצעות אינדקס שבירה של 1.60 עבור PLGA.
8. השתמש בממשק התוכנה כדי לחשב קוטר חלקיקים באמצעות בסיס מספר.

4. הדמיה של חלקיקים

1. השעיית חלקיקי פיפט למעלה ולמטה עם מיקרופיפט לערבב. מדללים את השעיית החלקיקים ל-1 מ"ג/מ"ל במים שעברו דה-יון.
2. הכינו שקופית מיקרוסקופ על ידי הוספת 3 מיקרומטר של מתלה חלקיקים מדולל והרכבת כיסוי בזווית של 45° כדי למנוע היווצרות בועה. מקם את השקופית על במת המיקרוסקופ והתמונה באמצעות ערכות המסננים המתאימות לכל מטען פלואורסצנטי.

5. הכנת עכברים עבור i.LN. זריקה

1. הכן פתרון צבע מעקב:
   1. הכן 0.1% (w / v) פתרון של צבע מעקב על ידי המסת 10 מ"ג של אבקת צבע עם 10 מ"ל של H2O מזוקק.
   2. לעקר את פתרון הצבע לתוך בקבוקון זכוכית באמצעות מסנן מזרק 0.2 מיקרומטר.
2. יום אחד לפני ההזרקה, יש למרדים את העכבר באמצעות isoflurane על פי פרוטוקול בעלי חיים שאושר על ידי IACUC. כדי להעריך את עומק ההרדמה, בצע בדיקת רפלקס קמצוץ בוהן וניטור קצב הנשימה כדי להבטיח קצב נשימה של כ 100-140 נשימות לדקה.
3. לגלח את השיער בבסיס הזנב ואת hindquarter באמצעות קוצץ בעוד העכבר הוא מורדם. הסר את השיער מהצד הגחוני של החיה לרוחב סביב לצד הגבי ממש מעל המפרק של הרגל האחורית (הירך).
4. להזריק צבע מעקב.
   1. עבור כל הזרקת צבע, להשתמש micropipette להעביר 10 μl של פתרון צבע לתוך צינור microcentrifuge, ולשאוף את כל 10 μl לתוך מחט 31G מחובר מזרק 1 מ"ל.
   2. להזריק 10 μl של פתרון צבע תת עורית בכל צד של בסיס הזנב שבו השיער נחתך, טעינה מחדש בין זריקות.
5. הסר את השיער הנותר על ידי החלת קרם depilatory מתון באמצעות צמר גפן. הקפד לצפות את האזור בין הירך האחורית והבטן.
6. אפשר קרם depilatory לדגר על העור במשך 3 דקות. לאחר הדגירה, יד כפפות רטובות עם H₂O חם בעדינות לשפשף קרם depilatory לתוך העור.
7. הסר מיד קרם depilatory על ידי הרטבת יד כפפה עם חם H₂O ובסיס זנב שפשוף ו hindquarter. חוזרים על הפעולה עד להסרת עודפי דפילציה, מקפידים לשמור על יד רטובה כדי למנוע גירוי.
8. הסר שאריות depilatory מן העכבר על ידי הרטבת מטלית רכה או מגבת נייר עם H₂O חם בתנועה אחת, ניגוב החלק התחתון של העכבר. הימנע תנועת שפשוף כדי למנוע שחיקה או נזק לעור לעכבר.
9. אפשר לעכבר להתאושש תחת מנורת חום ולחזור להחזקה.

6. i.LN. הזרקת חלקיקים

1. ביום שלמחרת, יש למרדים את העכבר באמצעות isoflurane על פי פרוטוקול בעלי חיים שאושר על-ידי IACUC.
2. בדוק את העכבר כדי לאשר ניקוז של צבע tracer לתוך כל בלוטת הלימפה מפשעתי. הצומת הלימפה צריך להיות גלוי כנקודה כהה ליד הירך האחורית והבטן.
3. הכן פתרון הזרקת חלקיקים:
   1. Resuspend חלקיקים H_{מזוקק 2}O בריכוז הזרקה הרצוי. עבור כל זריקה, להשתמש micropipette להעביר 10 μl של פתרון חלקיקים לתוך צינור microcentrifuge.
   2. לשאוף את כל 10 μl לתוך מחט אינסולין 31G מחובר מזרק 1 מ"ל.
4. הזרקת מינון חלקיקים:
   1. לאחר הדמיה של LN, הדקו את העור סביב LN באמצעות אגודל, אצבע המורה והאצבע האמצעית כדי למשוך את ההתגרות בעור ולאפשר מיקום מבוקר של נפח ההזרקה.
   2. התקרבו ל-LN עם המחט בזווית של 90° לעור וחדרו את העור מעל ה-LN הצבוע לעומק של 1 מ"מ.
   3. הזרק לאט את כל הנפח. במהלך ההזרקה, להתבונן נפח LN דרך העור כדי לאשר הזרקה על ידי הגדלת LN גלוי.
5. אפשר לעכבר להתאושש תחת מנורת חום ולחזור להחזיק או לבצע בדיקות נוספות.

לטכניקות ניתוח רלוונטיות (למשל היסטולוגיה, ציטומטריית זרימה) ראו מאמרי JoVE 265, 1743 ו- 3054 ופרוטוקולים נוכחיים באימונולוגיה, פרקים 5 ו- 21^15-22.

תוצאות

את התוצאות הצפויות לפרוטוקולים המוצגים בכתב יד זה ניתן לחלק לשלוש קטגוריות: סינתזת חלקיקים, הכנת בעלי חיים והזרקת חלקיקים.

איור 1 מתאר את הסינתזה והאפיון של חלקיקי פולימר מתכלים, המתייצבים על ידי שומנים אמפיפיליים. תוצאות פרוטוקול סינתזת האידוי אמולסיה/ממס (איור 1A) ניתן להעריך באופן איכותי על ידי בדיקה חזותית של אמולסיות הסופי שנוצר; אצוות חלקיקים צריכות להיות אמולסיות הומוגניות ויציבות עם מראה אטום. סיבוכים כוללים אמולסיות כי שמנת או flocculate, לעתים קרובות בשל אחסון לא תקין של מייצבי השומנים. כדי למנוע חוסר יציבות זה, שומנים צריך להיות מאוחסן ב -80 מעלות צלזיוס במצב מיובש או בקבוקון אטום מטוהר עם חנקן. הערכה כמותית של סינתזת חלקיקים יכולה להתבצע באמצעות עקיפת לייזר או פיזור אור דינמי כדי לנתח התפלגות גודל (איור 1B). התוצאות הצפויות כוללות גדלי חלקיקים מונומודאליים מופצים היטב, המצביעים על אוכלוסייה אחידה של חלקיקים. פרמטרי הסינתזה המתוארים בכתב יד זה מייצרים התפלגויות ממוצעות של מספר שבמרכזן כ-100 ננומטר או 3 מיקרומטר עבור חלקיקים ומיקרו-חלקיקים, בהתאמה. הערכה איכותית נוספת של סינתזת חלקיקים ניתן להשיג באמצעות שינוי של הפרוטוקול לעיל לשלב סוגים מרובים של מטען פלואורסצנטי. באיור 1C, תמונות מיקרוסקופיות של מיקרו-חלקיקים עמוסים בפפטיד פלואורסצנטי (FITC, ירוק), צבע ליפופילי (DiD, אדום) ותמונת כיסוי (צהובה) מאשרות יצירת חלקיקים בטווח הגודל הרצוי ואנקפסולציה של פפטיד בתוך נפח החלקיק.

שני הלוחות הראשונים של איור 2 מסכמים את התוצאות הצפויות של הכנת בעלי חיים לאסטרטגיית הזרקת i.LN המתוארת במאמר זה. המתודולוגיה כוללת סימון LNs מפשעתי על ידי הזרקה היקפית של מעקב לא-רעלים כדי לזהות את המיקום להזרקת חלקיקים(איור 2A)⁵. כאמור, ניקוז צבע המעקב לאחר הזרקה תת עורית בבסיס הזנב יאפשר הדמיה של LNs מפשעתי (איור 2B)⁵. בליעה של קרמים depilatory שאושרו יכול להוות סכנות לעכברים. לכן, יש להקפיד להסיר ביסודיות את כל הקרם מיושם, לשים לב במיוחד כפות, ואת הצד הגחוני של העכברים. יש להסיר depilatory באמצעות מטלית רטובה, רכה או מגבת נייר רטובה בתנועה אחת, חלקה. הימנע שפשוף כדי להסיר שמנת, כמו זה יכול להוביל שפשופים על העור החשוף של העכברים.

ניתן להעריך אישור מקומי של מסירה ל- LN המפשעה באמצעות תצפית או היסטולוגיה. ניתן לנטר את עוצמת ה- LN באופן חזותי במהלך ההזרקה כאינדיקטור להזרקה מוצלחת. התוצאות הצפויות כוללות חלוקת מטענים יעילה בכל מבנה ה-LN, ללא דליפה משמעותית לרקמות או לתאים סמוכים. יתר על כן, כמו נוזל מוזרק תזוזות /מדלל את tracer ב LN, ריכוז צבע / צביעה צריך להיות פחות אינטנסיבי לאחר הזרקה. תצפית של הרקמה צריכה לחשוף LN שלם, אבל מוגדל עקב הזרקת נוזלים. אתגרים פוטנציאליים כוללים הזרקה מהירה מדי או חסר LN, שניהם יכולים לגרום elution של נפח לתוך הרקמה התת עורית שמסביב. תוצאות לא רצויות אלה ניתן לאשר על ידי necropsy או היסטולוגיה, שם השעיית החלקיקים תיצפה מתפשטת לתאים ורקמות מרוחקים מצמתים המיועדים להזרקה. לעומת זאת, תוצאה צפויה תהיה זיהוי של LN מפשעתי מוגדל עקב בלימת חלקיקים בתוך מבנה LN. עיבוד היסטולוגי של LNs מגורש יכול לאשר באופן סופי משלוח של מטען לרקמת הלימפה, כפי שמוצג איורים 2C ו 2D. שימו לב שהחלקיקים באיור 2 משלבים מטען פלואורסצנטי כדי לאפשר הדמיה של מטען במהלך ההזרקה, כמו גם במהלך עיבוד היסטולוגי ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

איור 1. סינתזה ואפיון של חלקיקים מיוצב השומנים. A) דיאגרמה סכמטית המתארת את הסינתזה של חלקיקים מיוצב השומנים שהוכן על ידי אידוי אמולסיה / ממס. B) חלוקות גודל של מיקרו-חלקיקים (קו מוצק, קוטר = 2.8 מיקרומטר) וננו-חלקיקים (קו מקווקו, קוטר = 113 ננומטר). C) תמונות מיקרוסקופיות פלואורסצנטיות של חלקיקים עמוסים בפפטיד בעל תווית פלואורסצנטית וצבע חלקיקים פלואורסצנטי. תוויות: פפטיד (ירוק) וחלקיקים (אדום). לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.

איור 2. איי.אל.אל.ן. הזרקה והפצה של חלקיקים מתכלים בתוך LN. A)מתודולוגיה להזרקת i.LN. B) תצוגה חזותית של LNs בעכבר דרך העור (תמונה עליונה) ובעקבות necropsy (תמונה תחתונה)^5. C) כתמים היסטולוגיים של LN המאשר תצהיר והפצה של חלקיקי פולימר בעלי תווית פלואורסצנטית (חלקיקים, ירוק; תאי T, אדום; תאי B, כחול). D) חלקיקים בעלי תווית פלואורסצנטית (50 ננומטר, תמונה שמאלית) ומיקרו-חלקיקים (6 מיקרומטר, תמונה ימנית) ב- LNs 24 שעות לאחר ההזרקה. לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר. 

Discussion

הטכניקה המתוארת בפרוטוקול זה מאפשרת אספקה מבוקרת של חיסונים ל- LNs ולאנטיגן תושב LN המציג תאים. מטען אנקפסולציה ביו-חומרית יכול להיות מקומי בתוך LN, המאפשר מניפולציה של מינונים של סוג אחד או יותר של מטען מועבר microenvironment LN. לוקליזציה ושחרור מבוקר של חלקיקי פולימר הוכח ליצור תגובה חיסונית תאית הומוריסטית חזקה במינונים נמוכים משמעותית מאשר גישות קונבנציונליות. יתר על כן, באמצעות מניפולציה של גודל המוביל הביו-חומרי, ניתן לווסת את המצב העיקרי של עיבוד סלולרי בין ספיגה ישירה של חלקיקים או שחרור מטען חוץ-תאי ממיקרו-חלקיקים גדולים יותר⁵. תוצאות אלו קובעות את ההיתכנות של מסירה ביו-חומרית של i.LN. כפלטפורמה לאספקת חיסונים טיפוליים.

הסינתזה של חלקיקי PLGA על ידי אידוי אמולסיה /ממס הועסקה באופן נרחב ביישומי אספקת תרופות^23,24. לפיכך, אתגרים פוטנציאליים הקשורים לטכניקה זו מתייחסים בעיקר לזיהוי מוצלח ותצהיר של חיסונים באתר היעד של LN. למרות שהשימוש בצבע מעקב מקל על הדמיה של LNs מפשעתי ממוקד, גודל היעד ועומק מתחת לעור הם קטנים. לכן, המחברים ממליצים הקצאה זמן ועכברים לתרגול הכנה וזריקות של עכברים. במהלך הכנת בעלי חיים(כלומר גילוח ויישום של depilatory), יש להקפיד לא לחתוך את העכברים בצד הגחוני של החיה שבו זווית הרגל עם הבטן עושה את העור נוטה יותר לפציעה מן הקוצץ. בנוסף, יש להסיר את כל depilatory עם מים חמים כדי למנוע מבעלי חיים לבלוע את השמנת במהלך התנהגות טיפוח נורמלית. כדי לתרגל זריקות LN, ריכוז צבע מעקב גבוה יותר יכול להינתן ולתרגל בעלי חיים ניתן המתת חסד, ולאחר מכן מוזרק מספר פעמים. עכברי הזרקה הבאים ניתן necropsied ואת הגודל של LNs מבעלי חיים מוזרקים ניתן להשוות עם LN שליטה לא מופקרת. מגבלה אחת של טכניקה זו היא המגבלה הפיזית של נפח ההזרקה שניתן לטעון לתוך מבנה LN. הפרוטוקול שלנו מציע נפח הזרקה של 10 μl בעכברים, אם כי מחקרים אחרים דיווחו על נפחי הזרקה גדולים יותר לפחות עד 20 μl.¹³ עם זאת, אספקה ישירה של חיסונים באמצעות i.LN. הזרקה מאפשרת דרמטית מינון חוסך כך הפונקציה של חיסונים אלה בדרך כלל לא צריך להיות מוגבל על ידי אילוצי נפח.

כאמור, שינוי המאפיין הפיזי של החלקיקים(כלומר גודל) הוא מנגנון יעיל לשינוי המסלול או התוצאות הנגרמות על ידי ביו-חומרים ומטענים עטופים ברקמת LN. פרוטוקול אידוי אמולסיה / ממס ניתן לשנות בקלות כדי לשנות תכונות פיזיקליות או כימיות כגון מטען פני השטח או פונקציונליות, ואת קצב ההתכלה / שחרור מטען^23,24. לדוגמה, קינטיקה שחרור ניתן לכוונן באמצעות קומפוזיציות פולימר חלופיות, ואת תפקוד פני השטח ניתן לשנות באמצעות הרכבים השומנים שונה או פולי (אלכוהול ויניל). המטען טעון בחלקיקים ניתן לתפעל בקלות כדי להכיל אנטיגנים שונים או אדג'ובאנטים עבור פתוגנים היעד. היתרון של גישה זו מושגת באמצעות שילוב של משלוח i.LN. עם מקומי, שחרור מבוקר של מטען מ biomaterials. סינרגיה זו מקימה פלטפורמה שניתן לנצל כדי ליצור ביעילות תגובות חיסוניות אדפטיביות באמצעות מינונים זעירים ועם תופעות לוואי לא ספציפיות/מערכתיות מופחתות.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)	Avanti Polar Lipids	850375	10 mg/ml stock in chloroform
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] ammonium salt (DSPE-PEG)	Avanti Polar Lipids	880128	10 mg/ml stock in chloroform
1,2-Dioleoyl-3-trimethylammonium-propane chloride salt (DOTAP)	Avanti Polar Lipids	890890	10 mg/ml stock in chloroform
Polylactic-co-glycolic acid (PLGA)	Sigma-Aldrich	P2191	Lactide:Glycolide (50:50). MW 30,000-60,000
Dichloromethane (DCM)	VWR	BDH1113
Isoflurane	Vetone	502017
Nair	Nair
Evans blue tracer dye	VWR	AAA16774-09
U-100 BD Ultra-Fine Short Insulin Syringes, 31 G 5/16 in needle	VWR	BD328418
Single-Use Needles, BD Medical, 21 G, 1.5 in needle	VWR	BD305167
Syringes with BD Luer-Lok Tip, BD Medical, 1 ml	VWR	BD309628
Falcon Cell Strainers, Sterile, Corning, 40 µm	VWR	21008-949
Vybrant DiD Cell-Labeling Solution	Invitrogen	V-22887
Fluoresbrite YG Microspheres 6.00 µm	Polysciences	17149
Fluoresbrite YG Microspheres 0.05 µm	Polysciences	17156
Ovalbumin, Purified	Worthington Biochemical	LS003056
Qsonica Sonicator Ultrasonic Processor Q125	Qsonica	Q125	1/8 in diameter microtip probe
Ultra-Turrax T 25 digital homogenizer	IKA	YO-04739-22	10 G dispersing element
Fluorescent Microscope	Olympus	IX-83
Laser Diffraction Particle Size Distribution Analyzer	Horiba	LA-950	Including provided cuvette-style glass fraction cell
Professional 8685 Peanut Classic Clippers	Wahl