הקרנת גנטיקה קדימה VIGS בתיווך לזיהוי גני המעורבים בהתנגדות Nonhost

Summary

וירוס-Induced השתקת הגן היא כלי שימושי לזיהוי גני המעורבים בהתנגדות nonhost של צמחים. אנו מדגימים את השימוש בחיידקים פתוגנים המבטאים GFPuv בזיהוי גנים מושתקים צמחים רגישים לפתוגנים nonhost. גישה זו היא קלה, מהירה ומאפשרת הקרנה בקנה מידה גדולה ופרוטוקול דומה ניתן ליישם בחקר אינטראקציות צמח חיידק אחרים שונות.

Abstract

עמידות למחלות של צמחי Nonhost נגד חיידקים פתוגנים נשלטת על ידי מסלולים הבטחוני מורכבים. הבנת מנגנון זה היא חשובה לפיתוח צמחים עמידים למחלה עמידות כנגד מגוון רחב של פתוגנים. וירוס-Induced השתקת גן (VIGS) הקרנה מבוססת קדימה גנטיקה היא גישה שימושית לזיהוי של גנים להגנת צמחים הקניית התנגדות nonhost. וירוס רעשן טבק (TRV) וקטור VIGS הוא וקטור VIGS יעיל ביותר עד כה, וכבר בשימוש על בסיס יעילות כדי להשתיק גני המטרה אנדוגניים בניקוטיאנה benthamiana.

בכתב היד הזה, אנחנו מדגימים את גישת הקרנת גנטיקה קדימה להשתקה של שיבוטים בודדים מספריית cDNA בנ benthamiana והערכת התגובה של צמחים הושתקו גן לנפרץ התנגדות nonhost נגד פתוגנים nonhost, Pseudomonas syringae PV. עגבניות T1, פ syringae PV. glycinea, וX. campestris PV. סיקטור. חיידקים פתוגנים אלה מהונדסים לחלבון GFPuv המפורש וניתן לראות על ידי עין בלתי מזוינת מושבות fluorescing הירוקות שלהם תחת אור UV בצמחים מחוסן הפתוגן nonhost אם גן היעד השתיק מעורבת בהקניית עמידות nonhost. זה מאפשר זיהוי אמין ומהיר של גנים מושתקים צמחים רגישים לפתוגנים nonhost. יתר על כן, מידע גן המועמד מבטיח יכול להיות מוכר על ידי הוספת רצף גן הצמח בTRV וקטור. כאן אנו מדגימים את יכולת התפוקה הגבוהה של גנטיקה קדימה VIGS בתיווך לזהות גני המעורבים בהתנגדות nonhost. כ, 100 cDNAs יכול להיות מושתק באופן אישי בכ שבועות עד שלושה שבועות ואת הרלוונטיות שלהם בהתנגדות nonhost נגד מספר חיידקים פתוגנים nonhost ניתן ללמוד בשבוע שלאחר מכן. בכתב היד הזה, אנו למנות מעורבים בהקרנה זו את הצעדים המפורטים. VIGS בתיווך קדימה הגנטיקה screeniגישת ng ניתן להרחיב לא רק לגנים מעורבים בזיהוי התנגדות nonhost אלא גם כדי ללמוד כמה גני הקניית העמידות מתח יוטיים ואביוטי במינים צמחים שונים.

Introduction

התנגדות Nonhost היא ההתנגדות של כל מיני צמחים נגד גזעים של ^1,2 הפתוגן מסוים. זה מקנה קשת רחבה ועמידות למחלות בצמחים עמידים ^2,3. עם זאת, המנגנון שלה, במיוחד נגד חיידקים פתוגנים, אינו מובן היטב ^4. הקרנה למוטציות או צמחים השתיקו כי התנגדות nonhost פשרה, ואפיון תמליל תפוקה גבוהה לזיהוי של גנים באופן דיפרנציאלי לידי ביטוי במהלך nonhost התנגדות ^5-9 שתי גישות עיקריות המשמשות בעבר להתנגדות לנתח nonhost חיידקים. בגלל התנגדות nonhost נשלטת על ידי מנגנון מורכב (ים) ⁴ עם המעורבות של גנים רבים, גישה פונקציונלי תפוקה גבוהה גנומי לזיהוי גן הוא קריטי להבנת מנגנון התנגדות nonhost (ים) טובה יותר.

וירוס-Induced השתקת גן (VIGS) שימש בהצלחה להשתיק צמח אנדוגניהגנים במיני צמחים רבים ^10,11. ניקוטיאנה benthamiana הוא אחד הצמחים המתאימים ביותר עבור VIGS ^10,12 וטיוטת רצף הגנום שלו זמין כעת ^13. וירוס רעשן טבק (TRV) מבוסס VIGS כבר בשימוש נרחב ככלי גנטיקה הפוך כדי לאפיין את הגנים מעורבים בnonhost התנגדות ^2,4,14. וקטורים ונגזרים VIGS זה זמינים כעת דרך מרכז משאבים ביולוגי ארבידופסיס (ABRC, http://www.arabidopsis.org/abrc/catalog/individ_cloned_gene_1.html). VIGS שימש גם ככלי לזיהוי גנטיקה קדימה גני המעורבים בחסינות צמח ^15-17, התנגדות nonhost במיוחד ^6,18. הערכת תגובת רגישות יתר (HR) בתיווך מוות של תאים הנגרם על ידי צמחים נגד הפתוגן nonhost ספציפי והערכת המוות של תאים הנגרם המחלה הן שני מבחני עיקריים המשמשים בעיקר לidentifyinגן רגיש גרם השתיק צמחים. עם זאת, המוות של תאי HR מושרה רק נגד פתוגנים nonhost מסוג II ולא נגד סוג I-nonhost פתוגנים ^2. לפיכך, מבחני HR לא ניתן להשתמש באופן אוניברסלי לזהות אסטרטגיות התנגדות nonhost בשימוש על ידי צמחים, במיוחד נגד מגוון רחב של סוג I-פתוגנים nonhost. כמו כן, אובדן חלקי של התנגדות nonhost במפעל הושתק גן לא תמיד להוביל למחלות סימפטומים ⁶ ולכן ניקוד מחלה לא יכול לשמש לזיהוי צמחים להתפשר התנגדות nonhost. בניגוד, בהערכת הצמיחה של פתוגנים nonhost במפעלי גנים המושתקים היא שיטה טובה יותר ללימוד הפסד של התנגדות nonhost בצמחי גנים מושתקים.

בהשוואה לגידול קונבנציונלי assay ^6,19, שיטה מהירה יותר להערכת התפתחות חיידקי nonhost על צמחי הגן המושתקים יכול לקצר את הזמן הנדרש להקרנת גנטיקה קדימה. מוקדם יותר דיווחו לנו שיטה להתבוננות חיידקיםצמיחת הפתוגן לשמאל על ידי עלים עין בלתי מזוינת באולטרה סגול (UV) אור באמצעות חיידקים לבטא חלבון (GFP) ¹⁹ ניאון ירוק. בכתב היד הזה אנחנו מדגימים את השימושיות של GFPuv להביע חיידקים פתוגנים nonhost לזיהוי קל של צמחי גנים מושתקים שנפרצו להתנגדות nonhost. מתודולוגיה זו היא מדויקת לזיהוי של צמחים רגישים ונוחה להקרנת תפוקה גבוהה.

Protocol

1. גידול צמחים והשתקת גני יעד

1. תנאי גידול צמחים:
   1. נ 'תזרע זרעי benthamiana על אדמה פחות תערובת שתילה, מטרו-Mix 350 ואת הזרעים לנבוט בתא גידול. כל אדמה אחרת או אדמה פחות בינונית יכולה לשמש גם במקום מטרו-Mix.
   2. השתלת שלושה בשבוע שתילים ישנים לתוך סירים בודדים ולגדל אותם בחממה המתנהלת ב21 ± 2 ° C יחד עם תנאי גידול אחרים, כמפורט בספרות קודמת ^12. שניים עד שלושה ימים לאחר ההשתלה, צמחים יכולים לשמש לTRV חיסון.
2. גידול TRV2 שיבוטים:
   TRV הוא וירוס bipartite והגנום שלו מורכב מRNA1 וRNA2. RNA1 מקודד RNA פולימראז RNA תלוי וחלבון תנועת ^20,21. RNA2 מקודד חלבון מעיל (CP) ושני חלבוני nonstructural מRNAs subgenomic ^21. שניהם RNA1 וRNA2 נדרשים להיווצרות של vir התבגרשלנו חלקיקים והתפשטותם ^20,21. בניית ספריית cDNA בוקטור TRV2 מתוארת בספרות קודמת ^22,23. בקצרה, ספריית VIGS השתמשה במחקר זה נבנתה מRNA חילוץ מרקמות עלים החשופים לelicitors יוטיים ואביוטי שונים.
   1. קח את Agrobacterium (GV2260 זן) המכיל את השיבוטים cDNA בוקטור TRV2 (96 גם צלחת) מהמקפיא. בהדרגה להפשיר אותם ואחרי התרבויות להגיע לטמפרטורת חדר, לחסן את תרבות Agrobacterium פרט על צלחת אגר לוריא-Bertani (LB) עם ריפאמפיצין (10 מיקרוגרם / מ"ל) וkanamycin (50 מיקרוגרם / מ"ל) באמצעות משכפל 96 פינים.
   2. דגירה הצלחות על 28 מעלות צלזיוס במשך יומיים. בדרך כלל אנחנו גדלים ארבע מושבות לשכפל לכל שיבוט, כך שבידוד Agrobacterium נאות זמין עבור חיסון זין של שני מפעלים. לבצע את כל השלבים בתנאים סטריליים.
3. VIGS:
   1. לגדולAgrobacterium (GV2260) נשא TRV1 על 28 מעלות צלזיוס במדיום נוזלי LB עם אנטיביוטיקה שהוזכר לעיל. קציר תאים על ידי צנטריפוגה מתרבויות גדלו לילה, מחדש להשעות בחיץ החיסון (10 מ"מ MES, pH 5.5; acetosyringone מיקרומטר 200), ו דגירה במשך 3 שעות בטמפרטורת חדר על שייקר ב50 סל"ד.
   2. קציר התאים על ידי צנטריפוגה מחדש להשעות ב5 מ"מ MES חיץ (pH 5.5) ולחסן (OD ₆₀₀ = 0.3) לצד abaxial של 3-4 נ benthamiana משאיר באמצעות מזרק מחטים. הליך חיסון מפורט בא לידי ביטוי בספרות קודמת ^24. מאוחר יותר, באתר של TRV1 חיסון, לחסן TRV2 מושבות בהתאמה ידי לדקור את העלים עם קיסם.
   3. לשמור על הצמחים עם תזונה נאותה כצמיחה נמרצת חשובה לVIGS יעיל ^12. כשני שבועות חיסון הודעה את תעתיקי גנים ממוקדים יתחילו להפחית את הצמחים והם מוכנים לחנ"ל הפתוגןulation בשלושה שבועות לאחר TRV חיסון.

2. הכנת תרבויות הפתוגן Nonhost וחיסון צמח

1. פרטים של פתוגנים השתמשו במחקר זה:
   Pseudomonas syringae PV. Tabaci, פ syringae PV. עגבניות T1, פ syringae PV. glycinea וXanthomonas campestris PV. סיקטור משמשים במחקר זה. לגדול פ זני syringae בB של המלך (KB) מדיום הנוזלי בתוספת ריפאמפיצין (10 מיקרוגרם / מ"ל), kanamycin (50 מיקרוגרם / מ"ל) ב 28 מעלות צלזיוס למשך 12 שעות. לגדול X. campestris PV. סיקטור במדיום נוזלי LB עבור 16 שעות. כל הפתוגנים נמל פלסמיד שיכול להביע GFPuv כפי שמתואר בספרות קודמת ^19.
2. הכנה של תרבויות פתוגן לחיסון צמח:
   1. קציר תאים חיידקיים על ידי צנטריפוגה ולאשר את קיומו של הקרינה ירוקה באמצעות ארוך waמנורת UV velength בחושך. לשטוף את התאים פעמיים עם מים סטריליים מחדש להשעות אותם לריכוז הרצוי להשתמש במים סטריליים.
   2. לחסן הפתוגן בהתאמה (ים) לצד abaxial של עלים הושתקו גן המטרה (5 עד 8 ^{​​ה ה)} כנקודות (כ -1.5 ס"מ קוטר). פתוגנים nonhost כמה ניתן לבדוק בו זמנית לצמיחה שלהם במפעלים הושתקו גן המטרה. במקביל לחסן הפתוגן המארח כמו זה יכול לשמש כביקורת חיובית לצפייה בהתפתחות חיידקי planta. גם וקטור שליטה לחסן (TRV :: 00) צמחים.

3. התבוננות בצמיחת planta של חיידקים פתוגנים

1. לחשוף את העלים מחוסן לאור UV אורך גל ארוך בחושך. ניתן לצפות במושבות חיידקים כנקודות ניאון ירוקות בצד abaxial של העלה ברקע של הקרינה הנפלטת על ידי אדום פני עלה.
2. שים לב לצמיחת הפתוגןמימים שלאחר חיסון 2 (dpi) עד 5 dpi. תצפית יומיומית במהלך פרק זמן זה היא הכרחית.
3. לאחר המסך הראשון, רשימה קצרה את תוצאות השיבוטים בצמיחה של פתוגן nonhost אחד או יותר (ים) השתקתם.
4. חזור על VIGS לשיבוטים הנבחרים ושוב לבדוק את התגובה של צמחי גן מושתקים לפתוגן nonhost (ים). רמה שנייה זה של הקרנה נעשה כדי להסיר את התוצאות החיוביות השגויות שהושגו במהלך המסך הראשון.

4. אישור על צמחי המועמדים להתנגדות Nonhost נפרצה

1. להשתיק את השיבוטים cDNA שנבחרו מתוך המסך כמתואר לעיל. לחסן את המפעל כולו עם הפתוגן nonhost (ים) על ידי השריית את הצמחים עם תרבויות פתוגן בהתאמה עם 0.01% (V / V) Silwet L-77 והעמדת צמחים השקועים לשאוב במשך 3 - 5 דקות. לכמת את התפתחות החיידקים על ידי assay גידול הקונבנציונלי ^6,18,19 כפי שיתואר להלן.
2. בשעות שלאחר החיסון 0 (HPI),3 dpi ו5 dpi, לאסוף שתי דגימות עלים מחמישה עלים ביולוגיים משכפל עבור כל פתוגן nonhost (ים) מחוסן באמצעות אגרוף עלה (0.5 ס"מ) ^2. טוחנים את דגימות עלים, הסידורי לדלל וצלחת SAP במדיום אגר בייט בתוספת אנטיביוטיקה ודגירה מתאימות על 28 מעלות צלזיוס למשך 2 ימים. לספור את מושבות חיידקים באמצעות מונה מושבה ולחשב את התפתחות החיידקים בעלים כפי שמתוארים בספרות קודמת ^6.
3. צמחים רגישים לפתוגן nonhost (ים) צריכים להראות מספר גבוה יותר של צמיחת הפתוגן בהשוואה לבקרת וקטור.

5. רצף הוספה וזיהוי גן המטרה

1. בצע מושבה PCR לשיבוט שנבחר באמצעות attB1 וattB2 פריימרים או תוך שימוש בפריימרים איגוף אתר שיבוט בוקטור TRV2. הפעל את המוצר ה-PCR בג'ל ולבדוק להגברה של להקה אחת.
2. הוספת צמח בגן וקטור TRV2 יכולה להיות רצף באמצעות attBפריימרים או primers איגוף אתר השיבוט.
3. בצע תפציץ באמצעות הרצף ולזהות פרטי הגן.
4. להשיג רצף גן באורך מלא יחד עם האזורים בלתי המתורגמים (UTRs).
5. בחר 300-400 ברים נ"ב משלושה אזורים של הרצף שונים ולשכפל אותם לTRV2 וקטור. באופן עצמאי לבצע VIGS תוך שימוש בכל שלושת מבני VIGS ולאשר את הפשרה של התנגדות nonhost בכל שלושת הצמחים השתיקו גנים.

תוצאות

מטרה העיקרית של מחקר זה היא להדגים שיטה לזיהוי קל ומדויק של הגן השתיק נ צמחי benthamiana שנפרצו להתנגדות nonhost. ישנם ארבעה שלבים עיקריים בשיטה זו. צעד הראשון הוא בנפרד כדי להשתיק מספר רב של גנים באמצעות TRV-VIGS. אנחנו השתקנו כ -5,000 גנים ^6,18 על פני תקופה של כ -1.5 שנים ...

Discussion

חסינות צמח מגבילה את הצמיחה של פתוגנים nonhost ולכן, מעט או ללא הקרינה ירוקה נפלט ממפעל בקרת וקטור משאיר מחוסן עם הפתוגן nonhost תחת אור UV אורך גל ארוך (איור 3D). עם זאת, כאשר גן המעורב בהתנגדות nonhost מושתק, הצמחים השתיקו גנים להעדיף הצמיחה של הקרינה הפתוגן והירוקה nonhost ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well U-bottom plates	Becton Dickinson Labware (Franklin Lakes, NJ, USA)	35-3077
96-pin replicator stainless steel	Nalge Nunc International (Naperville, IL, USA)	250520
High Intensity UV Inspection Lamps, Model B-100ap	Thomas scientific (Swedesboro, NJ, USA)	6283K50	Manufacturer ID 95-0127-01
Stuart SC6 colony counter	Bibby Scientific Limited, Staffordshire, UK	SC6PLUS
Soil-less potting mixture, Metro-Mix 350	SUNGRO Horticulture Distribution, Inc., (Bellevue, WA, USA)
Primers: attB1 (GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT) attB2 (GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT)	Integrated DNA Technologies, Inc (Coralville, IA, USA)	Custom synthesized
MES, Monohydrate	VWR international (Radnor, PA, USA)	CAS No. 145224-94-8
Acetosyringone (Dimethoxy-4’-hydroxyacetophenone)	Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)	D134406
Vac-In-Stuff (Silwet L-77)	Lehle Seeds (Round Rock, TX, USA)	VIS-30