הנדסת רקמות: בנייה תאית 3D פיגום למשלוח גיליונות סלולריים שכבות

Summary

For creation of highly organized structures of complex tissue, one must assemble multiple material and cell types into an integrated composite. This combinatorial design incorporates organ-specific layered cell sheets with two distinct biologically-derived materials containing a strong fibrous matrix base, and endothelial cells for enhancing new vessels formation.

Abstract

רקמות רבות, כגון לב האדם הבוגר, אינן מסוגלות להתחדש כראוי לאחר נזק. ^2,3 אסטרטגיות בהנדסת רקמות להציע חידושים על מנת לסייע לגוף בהתאוששות ותיקון. לדוגמא, גישות TE ייתכן שתוכלנה להחליש לב שיפוץ לאחר אוטם שריר הלב (MI) ואולי להגדיל את סך תפקוד לב לרמתו ערב MI הנורמלי ליד. ⁴ כמו בכל רקמה פונקציונלית, התחדשות מוצלחת של רקמת לב כרוכה באספקה ​​הנאותה של סוגי תאים מרובים עם רמזים סביבתיים העדפת אינטגרציה והישרדות של שתל תא / רקמה המושתלת. רקמות מהונדסות צריכים להתייחס פרמטרים רבים, כולל: אותות מסיסים, אינטראקציות תא אל התא, וחומרי מטריצה ​​הוערכו ככלי רכב משלוח, ההשפעות שלהם על הישרדות תא, חוזק חומרים, וסיוע של ארגון תא אל רקמות. מחקרי העסקת ההזרקה הישירה של תאי שתל רק להתעלם היסודות החיוניים האלה. ^2,5,6עיצוב רקמת שילוב מרכיבים אלו טרם פיתח. כאן, אנו מציגים דוגמא לעיצובים משולבים באמצעות שכבות של יריעות תא בדוגמת עם שני סוגים שונים של חומרים המופקים ביולוגיים המכילים את סוג תא איבר המטרה ותאי האנדותל לשיפור היווצרות כלי דם חדש ב" הרקמה ". למרות שהמחקרים האלה מתמקדים בדור של כמו לב רקמות, עיצוב רקמה זו יכול להיות מיושם על איברים רבים אחרים מאשר לב עם שינויים בעיצוב וחומר מינימאליים, והוא אמור להיות מוצר מהמדף לטיפולי משובי. הפרוטוקול מכיל חמישה שלבים מפורטים. טמפרטורת פולי הרגישים (-isopropylacrylamide N) (pNIPAAM) משמשת למאכלי תרבית רקמת מעיל. לאחר מכן, תאי רקמה ספציפית בתרבית על פני השטח של לוחות מצופים / משטחי micropattern כדי ליצור גיליונות תא עם הידבקויות לרוחב חזקות. שלישית, מטריצת בסיס נוצרה לרקמה על ידי שילוב של מטריצה ​​נקבובית עם permissi neovascularve הידרוג ותאי האנדותל. לבסוף, גיליונות התא הם הרימו ממנות pNIPAAM המצופים והועברו למרכיב הבסיס, מה שהופך את המבנה השלם.

Introduction

Injection of cells and/or single materials alone has shown variable success in other organ systems and limited success in cardiac regeneration.^5,7-12 Currently, stem cell-derived cells are delivered to damaged tissue using a variety of delivery methods including: direct cell injection into tissue and perfusion into the blood supply.^13-17 Others have implanted cells alone, materials alone and/or in combination with material carriers to help regenerate damaged organs.^18-21 This design combines multiple strategies that provide material strength, patterning in multiple materials and multiple cell types.

Specifically, the base acellularized fibrous matrix provides the foundational physical strength to the construct, making it suitable for suturing in into the patient, if necessary. The void spaces in the base matrix are filled with endothelial cells in a neovascular permissive hydrogel²² for rapidly establishing vascularization of the implanted construct. This composite is then integrated with pre-patterned cell sheets that allow enhanced cell-to-cell communication, more closely mimic the native tissue.^1,23-25 The overall production process for the layered cellular patch is outlined by the flowchart in Figure 1.

Protocol

.1 יצירה של צלחות מצופות pNIPAAM

1. ממיסים את g 2.6 של pNIPAAM ב2 מ"ל של פתרון הקסאן / 40% 60 טולואן%.
2. מחממים את התערובת ל60 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות עוררו, עד pNIPAAM נמס.
3. לחתוך נייר סינון לתוך מעגל 60 מ"מ קוטר ונייר מקום במשפך בוכנר.
4. סנן את הפתרון דרך המשפך בוכנר לתוך כוס הזכוכית שקל מראש (לא להשתמש בפלסטיק, כהקסאן ימס פלסטיק).
5. מניחים את הכוס והתוכן לתוך ואקום פעמון O (24 psi) / N (16 hr). הערה: עד השאריות הוא הגיב עם איזופרופיל זה יהיה לחמצן כדי לוודא זה לא בא במגע עם חמצן.
6. לשקול את הכוס להקים את המשקל של pNIPAAM.
7. להוסיף באלכוהול רפואי לpNIPAAM, יצירת 50/50 w / w פתרון.
8. מניחים 2 מ"ל של הפתרון על פני השטח של צלחת תרבית הרקמה, ומעיל למשך 5 דקות תחת אור UV.
9. לשטוף את הצלחת עם 2 מ"ל של PBS החם פעמייםלפני השימוש בתרבית תאים.

.2 יצירת גיליונות סלולריים

הערה: גיליונות תא של תאים ראשוניים לאיבר המטרה יכולים להיות שנוצרו באמצעות מספר השיטות שונות, או על ידי ציפוי משטחי תרבית רקמה עם פולימר תרמו מגיב כפי שמתואר כאן. צלחות תרמו רגיש טרום מצופים מוצעות גם על ידי מספר הספקים.

הערה: פרוטוקול זה מיועד לתרבות באמצעות צלחת 35 מ"מ. בקצרה, תאים מודגרת ראשון על 37 מעלות צלזיוס למשך תקופה מינימאלית של 24 שעות בנקודת המפגש ליצור חיבורי רוחב בין תאים סמוכים. לשחרר גיליונות תא, צלחות חשופים לטמפרטורות מתחת 32 ° C. גיליון התא הוא הועבר לאחר מכן למטריצה ​​הסיבית הבסיס החזק המכילה הידרוג'ל מתירנית neovascular עם תאי האנדותל של כלי דם.

1. לבודד את אוכלוסיית התאים. הערה: שיטה זו תלויה בנהלי גזירת פרט ואת הסוג של תאים. mu החלק אב העורקים עכברושתאי scle (RASMC) משמשים בדוגמא זו. אלה הם תאי שריר חלק עיקריים מבודדים מאב העורקים בבטן של חולדה.
2. שוטף את התאים עם 2 מ"ל של PBS החם.
3. הוסף 3 מ"ל של טריפסין (או ביקוע / פתרון disassociating אחר) לתאים למשך 5 דקות.
4. לעכב טריפסין על ידי התוספת של 3 מ"ל של התקשורת והתרבות, או פתרון חיץ פוספט (PBS) המכיל 10% בסרום שור עוברי (FBS).
5. לאסוף את התאים בצינור חרוטי ולספור aliquot.
6. ספין התאים ב 1,000 סל"ד (228 XG) במשך 5 דקות.
7. לשאוב supernatant ו resuspend התאים בתקשורת הצמיחה שלהם (בינוני תרבות SmGM2 בתוספת ערכת כדור משמש לRASMC).
8. הנח את המדיה המכילה את התאים על צלחת 35 מ"מ תרמו רגישה - צלחת מצופה pNIPAAM בריכוז שישיג 100 מפגש%. הערה: לקבלת RASMCs המספר שנקבע להיות 100,000 תאים / ² סנטימטר. עם זאת, כתוצאה מאובדן של תאים במהלך החולף, 120% מva ש משמש lue.
9. מקום לתוך חממה על 37 מעלות CO / N. שים לב: חשוב לשמור על התאים ב37 ° C כדי לשמור על הידבקות התא לצלחת.

.3 הכנה של מטריקס המכונן

הערה: מטריצות סיבי 3D שונים ניתן להשתמש כדי שכבת מטריצה ​​סיבית חזקה בין סדיני תא העדינים. כמה דוגמאות כוללות: gelfoam, bioglass, חומרי acellularized טבעיים ²⁶ או nanospun חומרי ^27,28 המטריצה ​​חזירי שתן בשלפוחית ​​השתן (UBM) משמשת במחקרים אלה סופקה בנדיבות ממשתף הפעולה שלנו, ד"ר Badylak ^29.

1. לפני שימוש, לקבוע מאפייני מטריצה ​​כולל חוסר התוכן סלולארי אם נעשה שימוש במטריצה ​​decellularized, ^27,28 כדאיות ספציפית תא, וחלל הריק. ²²
2. חותך את המטריצה ​​מעוקרת מראש לגודל וצורה רצויים. הערה: כאן, ניקוב חורים משמש לחיתוך עיגול בקוטר 4 מ"מ.

ve_title "> 4. תאי האנדותל זריעה לNeovascular מתירנית Hydrogel

הערה: ניתן להשיג תאי האנדותל ממגוון רחב של מקורות, כולל בידול מתאי גזע או אב. כאן, HUVECs משמש.

1. השתמש בכל זמן כמו בפעם cross-linking הידרוג'ל יתר (הפיברין, ג'ל קולגן) הוא קצר מספיק כדי לאפשר לתאים להישאר בת קיימא. שים לב: כאן, ג'ל hyaluronan (HA) המבוסס צולב עם גשר דיסולפיד משמש.
2. הכן את הידרוג'ל HA בהתאם לפרוטוקול החברה.
3. לאסוף את תאי האנדותל ולפזר לפתרון תא בודד באמצעות טריפסין 1x. הערה: Accutase או תא דיסוציאציה הצפת יכול לשמש גם לפיזור תא בודד.
4. לבטל את אנזים טריפסין על ידי שימוש בכמות שווה של מעכבי טריפסין הסויה (אם זה חשוב כי תאים אינם באים במגע עם סרום) או 10 FBS% PBS, איסוף הפתרון / צינור חרוטי תאים לתוך 15 מ"ל.
5. Count התאים, ולחשב את הנפח הדרוש לממדי התיקון (לכמת בעבר). הערה: לקבלת תיקון 4 מ"מ, המשמשים כאן 2 מיליון תאי האנדותל.
6. חלץ 2 מיליון תאים, ומקום לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל חדש.
7. ספין ב( 228 XG) במשך 5 דקות.
8. לשאוב supernatant, עוזב את התאים כגלולה בצינור חרוטי.
9. מערבבים את החומרים נוזליים HA וטין ב1: מנת 1. לאחר מכן להוסיף 80% מהנפח הכולל לתוך צינור חרוטי המכיל גלולה.
10. Resuspend תאי אנדותל ב1: 1 HA / התערובת לטין
11. מניחים את התאים התלויים בתערובת HA / לטין לתוך המטריצה ​​הסיבית הבסיס מהשלב 2.
12. הוספת 1/5 (20 אחוזים) מכלל הנפח הרצוי של צולב מקשר
13. דגירה של השעה 1 ב37 מעלות צלזיוס.

.5 בידוד של גיליונות סלולריים

1. הסר את הצלחות שטופלו pNIPAAM 35 מ"מ המכילות את התאים מן החממה והמקום במכסת מנוע תרבית תאים בRT.
2. במהירות לשאוב את התקשורת מהתאים, ולהוסיף 2 מ"ל של 6% ג'לטין הרגיל שחומם ל37 מעלות צלזיוס.
3. בעוד ג'לטין הוא עדיין חם, מניח את סריג המתכת לתוך ג'לטין, והשקיע אותה מתחת לפני השטח של ג'לטין הרגיל (סרט 1).
4. מניחים את הצלחת כולה על גבי קרח למשך 5 עד 7 דקות, המאפשר את הג'לטין להקשיח.
5. לאחר 7 דקות, להשתמש במרית כדי להפריד בזהירות את קצות ג'לטין מהצד השני של הצלחת, ולאחר מכן להשתמש במלקחיים כדי להרים את סריג המתכת מהערת הצלחת: ג'לטין 6%, וגיליון התא צריך להרים עם הסריג.
6. הזז את גיליון התא לצלחת ומניח על גבי שילוב מטריצה-הידרוג'ל הבסיס סיבי, הגדרת הרשת בראש המבנה בזהירות. הערה: צד הפסגה של גיליון התא עדיין יהיה במיקום העליון.
7. הוסף 2 מ"ל של תקשורת החמה (37 מעלות צלזיוס).
8. דגירה O / N המאפשר הגיליון של תאים לדבוק פני השטח הידרוג'ל.
9. הסר tהוא סריג מתכת לאחר הפתרון מחמם (כ 1 שעה), או ביום שלמחרת.

תוצאות

תרשים הזרימה (איור 1) מראה את השיטה הכוללת של מה שהופך את התיקון רב שכבתי. גיליונות תא מנותקים מהצלחת טופלה pNIPAAM על ידי הטלת הטמפרטורה מתחת 32 ° C. אז גיליון התא ממוקם בחלקו העליון של הידרוג'ל הצולב המכיל את תאי האנדותל זורעים לתוך המטריצה ​​הבסיסית סיבית

Discussion

השלבים הקריטיים בפרוטוקול כוללים: ציפוי משטחי צלחת עם פולימר thermoresponsive ומניפולציה של גיליונות התא לאחר קירור הצלחות. מכיוון שתאים שונים להציג תכונות פיזיות שונות, כמו adhesivity, זמן ההרמה צריך להיות מותאם לכל סוג תא אחר. המרכיב השני, ורוב מאתגר באופן משמעותי של פרוטוקול ז...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Calcein-AM	Invitrogen	C3099	Cell tracker / live dye
Lysotracker Red	Invitrogen	L7528	Cell tracker
Neutral Red	Sigma	N7005	Visible Cell dye
pNIPAAM	Sigma Aldrich	412780250	Poly(N-isopropylacrylamide)
Toluene	Sigma Aldrich	244511-1L
Hexane	Sigma Aldrich	296090-1L
RAOSMC	Lonza	R-ASM-580	Rat Aortic Smooth Muscle Cells
SmGM2	Lonza	CC-4149	Smooth Muscle Media
HUVEC	Invitrogen	C-003-5C	Human Venous Endothelial Cells
HyStem	Glycosan/Biotime
Isopropyl alcohol	VWR International	BDH1133-4LP
Trypsin	Corning Cellgro	25-053-C1
PBS	Gibco	14287-072
FBS	Gibco	16140-071
Specific Equipment
Filter paper	Ahlstrom	6310-0900
Buchner Funnel	Sigma Aldrich	Z247308
UpCell Plates	Nunc	2014-11
UV light	Jelight Company	UVO Cleaner Model No.42