גילוי של פתוגנים תאיים חדשים על ידי Amoebal Coculture וגישות Amoebal העשרה

Summary

coculture Amoebal היא מערכת תרבית תאים באמצעות אמבות חסיד לגדול באופן סלקטיבי פתוגנים תאיים מסוגלים להתנגד תאי phagocytic כגון אמבות ומקרופאגים. בכך הוא מהווה כלי מפתח כדי לגלות חומרים מזהמים חדשים. העשרת Amoebal מאפשרת גילוי של מיני amoebal החדשים ושל החיידקים תאיים הספציפיים שלהם.

Abstract

פתוגנים תאיים כגון legionella, mycobacteria ואורגניזמים כמו כלמידיה קשים לבודד מפני שהם לעתים קרובות לגדול בצורה גרועה או בכלל לא בתקשורת סלקטיבית המשמשים בדרך כלל כדי לטפח חיידקים. מסיבה זו, רבים של פתוגנים אלה התגלו רק לאחרונה או בעקבות התפרצויות חשובות. פתוגנים אלה קשורים לעתים קרובות עם אמבות, המשמשים כמארח תאים ומאפשרות את ההישרדות וצמיחה של החיידקים. בכוונתנו כאן כדי לספק הדגמה של שתי טכניקות המאפשרות בידוד ואפיון של פתוגנים תאיים הנמצאים בדגימות קליניות או סביבתיות: coculture amoebal והעשרת amoebal. coculture Amoebal מאפשר התאוששות של חיידקים תאיים על ידי inoculating המדגם נחקר על דשא amoebal שיכול להיות נגוע וlysed ידי החיידקים תאיים בהווה במדגם. העשרת Amoebal מאפשרת התאוששות של אמבות הווה במדגם קליני או סביבתי. ההוא יכול להוביל לגילוי של מיני amoebal חדשים, אלא גם של חיידקים תוך תאי חדשים צומחים במיוחד באמבות אלה. יחד, שתי טכניקות אלה לעזור לגלות חיידקים תאיים חדשים מסוגלים לגדול באמבות. בגלל היכולת שלהם להדביק אמבות ולהתנגד phagocytosis, חיידקים תאיים אלה עשויים גם לברוח phagocytosis ידי מקרופאגים וכך, להיות פתוגניים לאאוקריוטים גבוהים יותר.

Introduction

לפני הופעתו של אבחון מולקולרי, מיקרואורגניזמים הנמצאים בנישות סביבתיות או בדגימות קליניות לעתים קרובות זוהו על ידי טיפוחם בתקשורת סלקטיבית שונה, בעיקר על אגר בצלחות פטרי. הפנוטיפ של מושבות חיידקים והפעילות המטבולית שלהם ולאחר מכן אפשר סיווג חיידקים ברמת מין. גם מרק יכול לשמש כדי להגדיל את הרגישות של זיהוי. עם זאת, שתי הטכניקות לא מאפשרות ההתאוששות של חיידקים שגדלים לאט או בכלל לא בתקשורת אלה. זו הסיבה מדוע גישות מולקולריות משמשות כל כך נרחבת בימינו. עם זאת, זיהוי של ה-DNA מספק אין מושג על יכולת הקיום של החיידקים. יתר על כן, לעומת זאת לתרבות, גישות מולקולריות לא לגרום למתח שיכול להיות מאופיין נוסף.

לומדים פתוגנים שגדלים בצורה גרועה על תקשורת מוצקה או שתאי הצורך לגדול הוא מסובך. רוב אלה "קשים לגדול" חיידקים הם סופית אניניםחיידקי acellular, לעתים קרובות גילו ואפיין הבא התפרצויות גדולות כפי שהיה במקרה של pneumophila הלגיונלה. חיידק זה התאפיין בעקבות התפרצות שהתרחשה במהלך כינוס של לגיון האמריקאי. רבים ככל 182 אנשים נדבקו ו29 מתו עקב ^1,2 דלקת ריאות חמור. מאוחר יותר הראה כי אמבות היו המארחים הטבעיים של חיידק זה, וכי נוכחותם ברשתות מערכת מיזוג אוויר במלון ומים הייתה במקורו של פרוץ מחלת הלגיונרים שנקרא ^3.

האמבות נמצאות ברחבי העולם והיו מבודדות מהקרקע, אוויר, מים ורירית האף של מתנדבים אנושיים (הנסקרת ב ^4). אמבות "חיים ללא" אלה הן בדרך כלל החלוקה באופן עצמאי בסביבה, אך ייתכן שמדי פעם לפלוש מארחים מתירנית ^5. הזנת אמבות במיקרואורגניזמים שונים באמצעות phagocytosis ועיכול lysosomal לאחר מכן על ידי הי"דdrolases ^6. חיידקים תאיים פקולטטיביים או לחייב רבים מסוגלים להתנגד לעיכול ובכך להדביק ולחלק באמבות כמו למשל חיידקים או mycobacteria קשורות כלמידיה הלגיונלה, (הנסקרת ב ⁷ ו ^-8). אמבות חיים נטולי סיכוי לייצג את המאגר פוטנציאלי חשוב עבור חיידקים תאיים שעדיין לא התגלו. זה הוביל את הקבוצה שלנו ליישם בלוזאן שתי טכניקות עיקריות, הנקראות coculture amoebal והעשרת amoebal, שאפשרו לקבוצות שונות כדי לבודד כמה מיקרואורגניזמים תאיים לחייב חדשים מדגימות סביבתיות שונות ^9-15.

מאז אמבות הן phagocytes המקצועי מרעה על חיידקים, חיידק מסוגל להתנגד phagocytosis ולגדול בתוך הפרוטיסטים אלה עשויים גם ליישב phagocytes אדם ולהיות פתוגניים כלפי בני אדם. זה הודגם באופן חלקי עבור חלק מחיידקים הקשורים לכלמידיה, כגון Waddlia צndrophila. וו chondrophila יכול לגדול לא רק באמבות, אלא גם בכמה סוגי תאים, כגון תאי יונקים אפיתל, מקרופאגים, ושורות תאי דגי ^16-18. Coculture amoebal מופיע גם רלוונטי לאיתור חיידקים תאיים בדגימות קליניות ^19,20, כוללים צואה שהם מזוהמים בכבדות עם מיני חיידקים שונים ^21.

כאן אנו מתארים את השלבים העיקריים של coculture amoebal והעשרת amoebal, כוללים (א) טיפול בדגימות קליניות או סביבתיות, (ב) הגידול של אמבות בתקשורת axenic ועל דשא חיידקים של Escherichia coli ו (ג) הבחירה ואפיון של חיידקים תוך תאיים.

Protocol

1. Amoebal Coculture

1.1 הכנה דגימות

1. מדגם סביבה
   1. דגימות מים
      סנן את דגימת המים (500 מיליליטר לליטר 1) דרך קרום גודל נקבובית 0.22 מיקרומטר. לאחר מכן, לנער את הקרום בPAS הבינוני מלוח אמבה עמוד (120 מ"ג של NaCl, 4 מ"ג של ₄ MgSO • 7H ₂ O, 4 מ"ג של CaCl ₂ • 2H ₂ O, 142 מ"ג של Na ₂ HPO _4, ו136 מ"ג KH ₂ PO ₄ ב1 ליטר של מים מזוקקים).
   2. דגימות מוצקות
      Resuspend דגימות מוצקות כמו דגימות קרקע או חול ודגימות מוצקות למחצה כגון בוצה משופעלת במים מזוקקים או PBS ולסנן אותם דרך קרום גודל נקבובית 0.22 מיקרומטר. לאחר מכן, לנער את הקרום בPAS.
   3. דגימות מזוהמות מאוד עם אמבות ופרוטוזואה אנדוגני
      משקעים ראשון דגימות על ידי צנטריפוגה הנמוכה מהירות (180 XG) עבורr 10 דקות או לסנן אותו דרך קרום גודל נקבובית 5 מיקרומטר. יתר על כן לעבד את supernatant (בהתאמה התסנין), כמו ב1.1.1.
      הערה: טכניקות טיהור אחרות עשויות לשמש כדי לטהר נוסף דגימות סביבתיות: מחממים את המדגם ב50 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות או לטפל עם פתרונות חומצי או בסיסיים ^14.
2. מדגם קליני
   לעבד דגימות קליניות בהתאם למאפיינים פיסיקלי כימי שלהם. נוזלי סינון או צנטריפוגה כדי להסיר זיהומים גדולים. Resuspend דגימות מוצקות. כדי להשתמש ברקמות, טוחן אותם, למשל באמצעות homogeneiser dounce או חרוזי זכוכית, וlyse התאים לשחרר את החיידקים תוך תאיים.

1.2 הכנת אמבות

1. הכנת מרק
   הכן את אמצעי התקשורת הבאה: מדיה עשירה המכילה peptone, תמצית שמרים וגלוקוז (PYG; של peptone proteose 100 גרם, 10 גרם של תמצית שמרים, 4.9 גרם של ₄ MgSO • 7H ₂O, 5 גרם של נתרן ציטרט • 2H ₂ O, 0.1 גרם של Fe (NH _{4) 2} (SO _{4) 2} • 6 שעות ₂ O, 1.7 גרם של KH ₂ PO _4, 1.97 גרם של Na ₂ HPO ₄ • 7H ₂ O , 45 גרם של גלוקוז, ו0.295 גרם של CaCl ₂ ב 5 ליטר של מים מזוקקים) ובינוני שאינו תזונתי כגון PAS למיני Acanthamoeba.
2. תרבות Amoebal
   1. טפחו את האמבות (מעדיף Acanthamoeba castellanii ATCC 30010 או polyphaga א לינק-AP1) ב ° C25 בצלוחיות תרבית תאים המכילות 30 מיליליטר של מדיום PYG.
   2. לקצור את האמבות ידי טלטול נמרץ של הבקבוק וצנטריפוגה ההשעיה התא 10 דקות ב 1,500 x גרם. שטוף את הכדור פעמיים עם מדיום PAS. ספירת התאים בשקופית טמבלית ולהתאים את עוצמת הקול כדי לקבל השעיה של 5 x 10 ⁵ תאים לכל מיליליטר.
   3. מעביר את ההשעיה amoebal לmicroplates. השתמש 1 מיליליטר לכל טוב ל12 - ו24 wצלחות ell, 500 μl לצלחות 48 היטב ו300 μl לצלחות 96 היטב. דגירה microplate לפחות שעה 2 ב 25 ° C. זה מאפשר שיקוע וחיבור של האמבות לתחתית היטב כל אחד.

1.3 Coculture

1. חיסון לדוגמא
   1. לחסן את הצלחת מ2.3.3 עם דילולים סידוריים של המדגם מ1.1 או 1.2, בדרך כלל סדרת דילול פי 10 עם, החל מדגם חי 100 μl.
   2. צנטריפוגה microplate ב1,800 XG עבור 10 דקות למשקעים על דשא amoebal מיקרואורגניזמים שעלולים להיות נוכח במדגם. זה מגביר את הקשר וphagocytosis של מיקרואורגניזמים על ידי אמבות.
   3. דגירה צלחות דקות 45 ב ° C25 ולשטוף שלוש פעמים עם PAS ידי החלפת מדיה עם PAS הטרי. הוסף 1 מיליליטר לכל טוב של PAS עם או בלי תוספת של אנטיביוטיקה (סטרפטומיצין, פניצילין, גנטמיצין ו / או vancomycin), בהתאם לbacteriמיני אל שהם חיפשו.
   4. דגירה microplate ב32 ° C באווירת humidified להימנע מיצירת ביצי קיימא של האמבות. שים לב היטב כל יום עם אובייקטיבי 20X כדי לזהות נוכחות של החיידקים הפולשים וlysing אמבות.
   5. במקרה של התפרקות לבצע תת על אמבות טריות ידי inoculating של cocultures 100 μl לmonolayer של כ -10 ⁵ אמבות / ² סנטימטר. כדי לבודד במיוחד בהתחשב מיני חיידקים, לחסן גם תקשורת אגר ספציפית המיועדת לחיידקים אלה (אגר כלומר BCYE לspp הלגיונלה.).
   6. בהעדר תמוגה, לקחת מcocultures 100 μl ארבעה עד שבעה ימים לאחר החיסון הראשון ולחסן תרבות amoebal טרי של 900 μl בצלחת 24 גם. אם תמוגה המהירה של אמבות הוא ציין בלי התפשטות של חיידקים, נגיף עשוי להיות נוכח. במקרה זה, לסנן את supernatant ב0.22 מיקרומטר ולהשתמש בהשעיה המסוננת להדביק אמבות טריות.

1.4 בידוד ואפיון בקטריאלי

1. צביעת חיידקים
   בצע cocultures ישירות על coverslips זכוכית ב24 גם microplates. הסר את המדיום ולבצע צביעה או immunofluorescence.
   1. מכתים Romanowsky השתנה
      1. בואו יבש coverslip. לטבול את coverslip חמש פעמים בפתרון מקבע (2 מ"ג / ליטר הירוק מהיר במתנול).
      2. לטבול חמש הפעמים coverslip בפתרון מכתים אני (1.22 g / L Eosine G בpH חיץ פוספט 6.6)
      3. לבסוף, לטבול את coverslip 5 פעמים בפתרון מכתים השני (thiazine 1.1 g / L בpH חיץ פוספט 6.6).
      4. יש לשטוף את המדגם עם מים מזוקקים. בואו יבש ולצפות על ידי מיקרוסקופ.
   2. מכתים Ziehl-Neelsen
      1. בואו יבש coverslip. כסה את המדגם עם fuchsin Ziehl. מחממים את הצבע עם להבה עד אדים מופיעים.
      2. מגניב בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות לפחותולשטוף עם מים מזוקקים. כסה את המדגם עם 3% פתרון חומצה הידרוכלורית בisopropanol למשך 2 דקות ולשטוף עם מים מזוקקים.
      3. כסה ל30 שניות עם מתילן כחול ולשטוף עם מים מזוקקים. בואו יבש ולצפות על ידי מיקרוסקופ ^22.
   3. מכתים Gimenez
      1. הכן פתרון מניות fuchsin בסיסי על ידי ערבוב של 10% fuchsin הבסיסי 100 מיליליטר (10 גרם של fuchsin הבסיסי ב100 אתנול מיליליטר 95%), 250 מיליליטר של 4% פנול מימיים ו650 מיליליטר של מים מזוקקים. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות לפני השימוש.
      2. בואו coverslip לייבש ולתקן על ידי העברתו דרך להבה. כסה את המדגם עם fuchsin טרי המסונן בסיסי (4 מיליליטר של פתרון מניות fuchsin בסיסי ב10 מיליליטר של M 0.1 חיץ פוספט נתרן, pH 7.45) למשך 2 דקות.
      3. יש לשטוף את המדגם עם מים ודגירה בירוק מלכיט (0.8% במים מזוקקים) ל10 שניות. יש לשטוף שוב עם מים וחזור מכתים ירוק מלכיט. יש לשטוף שוב עם מים. בואו coverslip יבש, מ 'ount אותו, ולבחון על ידי מיקרוסקופ ^23.
   4. Immunofluorescence
      1. תקן את coverslip על ידי דוגרים במתנול למשך 5 דקות או עם paraformaldehyde 4% עבור 10 דקות.
      2. לשטוף שלוש פעמים עם PBS ו דגירה עבור שעה 2 בפתרון חסימה (BSA 5%, 0.1% Saponin PBS) בטמפרטורת חדר.
      3. דגירה coverslip עבור שעה 1 בחסימת תמיסה המכילה נוגדנים שהועלו נגד מיקרואורגניזם של עניין.
      4. שטוף שוב שלוש פעמים PBS ודגירה עבור שעה 1 עם שני נוגדנים מכוונים נגד הנוגדן הראשוני והצמודים לfluorophore. לשטוף שלוש פעמים עם PBS, הר coverslip ולבחון על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
2. גילוי ה-DNA על ידי PCR
   תמצית ה-DNA 100-200 μl של coculture amoebal. זיהוי מיקרואורגניזמים עם פריימרים אוניברסליים מיקוד גן 16S rRNA או פריימרים ספציפיים למין של עניין, כגון mycobacteria ²⁴ , Legionella ²⁵ או חברי ²⁶ Chlamydiales.

2. העשרת Amoebal

2.1. הכנת מדגם

Resuspend דגימות מוצקות או חצי מוצקה בPAS ידי vortexing. צנטריפוגה ההשעיה במהירות נמוכה (180 XG) במשך 10 דקות. זה מאפשר העשרה של אמבות חיים ללא בגלולה. Supernatant יכול לשמש לcoculture amoebal והגלול להעשרת amoebal ^21.

2.2. הכנה בינונית

1. הוסף 1.5 גרם של אגר לשל PAS 100 מיליליטר וחיטוי דקות 15 בינוניות ב121 ° C. יוצקים את המדיום החם בצלחות פטרי ולתת לחזק בטמפרטורת חדר.
2. לגדול Escherichia coli (ATCC 25922) בLB או thioglycolate מרק לילה בשעה 37 ° C. שטפו את החיידקים פעמיים עם PBS ו resuspend אותם במדיום PAS. לדלל 10x בPAS והתפשט 2-3 מיליליטר של דילול זה על צלחת אגר PAS ולתת להתייבש.

ass = "jove_step"> 2.3. חיסון לדוגמא

הוסף ירידה של מדגם (או חתיכת המסנן) בצד אחד של הצלחת ולתת לו לזרום על צלחת פטרי כדי ליצור קו במרכז הצלחת.

2.4. צמיחת Amoebal ותת amoebal

1. שים לב לצלחת פטרי מדי יום. אם מול הגירת amoebal מזוהה, לגזור חתיכה קטנה של אגר בחזית ההגירה ולחסן צלחת פטרי NNA טרי מכוסות בדשא של א ' coli.
2. חזור על reinoculation מספר פעמים בהתאם לטוהר של המדגם, כדי שתהיה לי תרבות טהורה של זן amoebal נתון.

2.5. אפיון אמבות וחיידקים

1. לגרד את תאי resuspend אותם PAS.
2. תמצית ה-DNA ולקבוע את זהותו של אמבות ו / או endosymbionts חיידקים על ידי PCR וסדר (ההגברה 16S rRNA לחיידקים, שו"ת. 18S rRNA לאמבות ורצף, לדוגמא).
3. השתמש בתאים מגורדים אלה בPAS לחסן אמבות טריות ולבצע coculture amoebal כדי לזהות חיידקים ואולי בהווה במדגם.

תוצאות

שימוש coculture amoebal והעשרת amoebal, מגוון רחב של חיידקים פתוגניים ו / או סביבתיים כולה התגלה (טבלת 1).

coculture Amoebal היה בשימוש על ידי הקבוצה ואחרים שלנו לנתח דגימות סביבתיות, מתקני טיהור מים ומערכות הפצת מים. מגוון רחב של מיקרואור?...

Discussion

coculture Amoebal והעשרת amoebal שיטות יעילים שאפשרו את בידודם של מינים רבים של חיידקים וamoebal חדשים. תוצאות שהושגו עם שיטות אלה לאשר את הקיום בכל מקום של שני אמבות וחיידקים עמידים לאמבה בסביבה, ודבר המעניין ביותר ברשתות מים מעשה ידי אדם שנחשבים להיות נשלטו על ידי טיפולים כימיים ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glucose monohydrate	Merck, Darmstadt, Germany	108342
0.22 μm pore size membrane	Merck Millipore, Darmstadt, Germany	SCVPU11RE
proteose peptone	Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ	211693
yeast extract	Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ	212750
Cell culture flasks	Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ	353135
Kova slide	Hycor, Indianapolis, IN	87144
cell culture microplates	Corning Inc, Corning, NY	3524
Diff-Quik staining kit	Siemens Healthcare diagn., Munich, Germany	130832
Ziehl fuchsin	Fluka, St-Louis, MI	21820
basic fuchsin	Sigma, St-Louis, MI	857843
Phenol	Sigma, St-Louis, MI	P1037	Corrosive and mutagenic
malachite green oxalate	Fluka, St-Louis, MI	63160
Paraformaldehyde 16% solution	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA	15710
Saponin	Sigma, St-Louis, MI	84510