JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

הקמנו ניאון בפרוטוקול הכלאה באתרו לצורך זיהוי של גנום נגיף ה-DNA מתמשך בתוך סעיפי רקמות של מודלים של בעלי חיים. פרוטוקול זה מאפשר לימוד תהליך זיהום על ידי codetection של הגנום הנגיפי, מוצרי RNA שלו, וחלבונים נגיפיים או סלולריים בתוך תאים בודדים.

Abstract

codetection תא הבודד של גן, מוצר RNA שלו וחלבונים רגולטוריים סלולריים הוא קריטי כדי ללמוד ויסות ביטוי גנים. זהו אתגר בתחום וירולוגיה, בפרט לנגיפי DNA מתמשכים המשכפלים את גרעיניים הכרוכים במודלים של בעלי חיים למחקר שלהם. סוג 1 נגיף הרפס סימפלקס (HSV-1) קובע זיהום סמוי לאורך חיים בתאי עצב היקפיים. וירוס חבוי משמש כמאגר, שממנו reactivates וגורם אפיזודת herpetic חדשה. הביולוגיה של התא של חביון HSV-1 נשארה הבינה היטב, בין שאר בשל המחסור בשיטות לגילוי HSV-1 הגנום באתרו במודלים של בעלי חיים. אנו מתארים DNA-ניאון הכלאה באתרו (FISH) גישה ביעילות גילוי הגנום נגיפי נמוך עותק בתוך קטעים של רקמות עצביות ממודלים של בעלי חיים נגועים. השיטה מסתמכת על הסרת מסכות אנטיגן מבוסס חום, ובדיקות שכותרתו ישירות תוצרת בית ה-DNA, או בדיקות זמינות באופן מסחרי. פיתחנו נירוסטה משולשתגישת נינג, שילוב ה-DNA-FISH עם RNA-FISH וimmunofluorescence, באמצעות הגברה אות peroxidase מבוססת כדי להתאים כל דרישה מכתים. שיפור עיקרי הוא היכולת להשיג, תוך 10 מיקרומטר קטעי רקמה, אותות נמוך רקע שניתן הדמיה ברזולוציה גבוהה על ידי מיקרוסקופיה confocal וepifluorescence הקונבנציונלי רחב בתחום. בנוסף, הצביעה המשולשת עבדה עם מגוון רחב של נוגדנים המכוונים נגד חלבונים תאיים ונגיפיים. הפרוטוקול המלא לוקח 2.5 ימים כדי להכיל את הנוגדנים וחדירת בדיקה בתוך הרקמה.

Introduction

סוג 1 נגיף הרפס סימפלקס (HSV-1) הוא וירוס neurotropic האדם עיקש, הקמת זיהום סמוי ארוך טווח בנוירונים של גרעיני trigeminal (TG) של מערכת עצבים ההיקפית, שממנו reactivates מעת לעת כדי לשכפל ולהפיץ. הגנום HSV-1 הוא לוקליזציה dsDNA 150 kb בגרעין של תא עצב המארח שבו הוא נשאר פלסמידים multicopy כchromatinized, שלא להשתלב בגנום מארח תא 1,2. במהלך חביון, התכנית הגנטית מחזור replicative HSV-1 היא מאוד מודחקת, וביטוי גנים מוגבל לתמליל הקשורים חביון (LAT) לוקוס, מהקמת חביון ייזום מחדש 3. LAT מייצר RNA ארוך 8.5 kb noncoding מעובד לפלצור יציב 2 kb גדול, וכמה מירנה 4-7. חביון HSV-1 מתאפיין ובכך על ידי הנוכחות של ה-DNA הנגיפי הגנומי, RNA LAT, והיעדרם של חלבוני מחזור replicative לזיהוי.

> מודלים של בעלי חיים, בעיקר בעכבר והארנב ontent ", הם מודלים ניסיוניים משחזרים כמה תכונות של חביון באדם. אחד האינטרסים העיקריים של הדגמים האלה הוא שהם מאפשרים לימוד היבטים פיסיולוגיים של חביון HSV-1 במארחים עם מערכת חיסון. במהלך העשורים האחרונים , כלים ניסיוניים רבים, כגון וירוסים ועכברים מהונדסים גנטי, פותחו כדי ללמוד את הפיסיולוגיה, גנטיקה וביולוגיה תאית של חביון HSV-1, מרקמות של בעלי חיים. עד עכשיו, ה-DNA הגנומי הנגיפי זוהתה ולכמת על ידי כתם דרום ו qPCR מTGS ניתק. עם זאת, אין כיום שיטה זמינה לזיהוי הגנום HSV-1 על ידי הכלאה באתרו על סעיפי רקמות 8. כתוצאה מכך, זמן האחזור נבחנים באופן שוטף על סעיפים היסטולוגית באמצעות זיהוי של RNA LAT ידי רנ"א הכלאה באתר ולא זיהוי הגנום נגיפי. כי זה כבר בלתי אפשרי לאפיין תאים נגועים המבוסס על הנוכחות של הגנום נגיפי, thiמגבלה טכנית של הייתה חסרון עיקרי לניתוח של היבטים רבים של אינטראקציות מארח וירוס, כגון קשר בין הגנום הנגיפי וביטוי גנים נגיפי סלולארי או תגובת התא בתיווך החיסונית מארח 9,10.

והכי חשוב, את ההטרוגניות תא אל התא של הזיהום לטנטי נשארה יחסית שלא נחקרה והוכחה להיות תכונה מרכזית של מיסות בעכברים ובתאי עצב הגנגליון חושיים אנושיים שהושתלו לעכברים SCID 11-17. בדרך כלל, זה היה מוצג על ידי qPCR שהגנום עותק מספר HSV-1 לכל תא משתנה מ5 עד כמה מאות. למרות LAT מופיע כרגולטור מפתח של מיסות והפעלה מחדש, נתוני qPCR על נוירונים בודדים ובאתר PCR הצביעו על כך שרק קבוצת משנה של תאי עצב נגועים רדום, נמוך כמו 30%, מבטאים את מוקד LAT 11,12,18-21. איך התא המארח והסביבה הסלולר בתוך השפעת הרקמה על הקמת חביון הווירוס וביטוי גנים נגיפי עדיין לא ברור. כאן אנו מתארים ניאון חזק הכלאה באתרו (FISH) שיטה לזיהוי היעילה של נמוך עותק HSV-1-DNA הגנומי בתוך סעיפי רקמות עצביים של בעלי חיים. שיטה זו תוכננה ומשמשת אותנו כדי לקבל גישה להדמיה מיקרוסקופית ברזולוציה גבוהה שיש צורך לחקור את האינטראקציה של הגנום הנגיפי עם רכיבי התוך גרעיני התא המארח 22. בנוסף, אנו מתארים שיטת צביעה מרובה לזיהוי בו זמני של ה-DNA הנגיפי עם רנ"א וחלבונים, אשר הוא כלי ייחודי כדי לתאר את אינטראקציות מארח וירוס המווסתים את ביטוי הגנים נגיפי. השיטה יכולה להיות מיושמת גם עבור מגוון רחב של ניתוחים הדורשים זיהוי של HSV-1 הגנום סמוי, כגון כימות נוירונים נגועים במספר רב של חלקים. צעד מפתח הוא ליישם טיפול אחזור אנטיגן כדי להפוך את ה-DNA הנגיפי נגישה להכלאה. לפיכך, פרוטוקול זה יכול להיות גם יעיל לזיהוישל וירוסי dsDNA אחרים, שהם כיום לא ניתן לגילוי על ידי גישות DNA-FISH קונבנציונליים בתוך רקמות של בעלי חיים.

Protocol

שיטה זו הייתה בשימוש במחקר שפורסם בעבר 22. לרקע כללי ותיאור של מניפולציה קונבנציונלית על איש, אם ודגים, אנו מציעים הספרות זמינה הבאה 23.

1. זיהום בבעלי חיים

כל ההליכים הכרוכים בחיות ניסוי תאמו לסוגיות אתיות מהאגודה לחקר חזון העיניים הצהרה (ארוו) לשימוש בבעלי החיים במחקר, ואושרו על ידי ועדת האתיקה המקומית של UPR-3296-CNRS, בהתאם לקהילה אירופאית הנחיית מועצת 86/609/EEC. כל בעלי החיים קיבלו גישה בלתי מוגבלת למזון ומים.

השיטה של זיהום עכבר עם HSV-1 מתואר להלן נעשתה שימוש במחקרים שפורסמו בעבר 24-26.

  1. הכן את הפתרונות הבאים כדי להכין לפני שמתחילים:

    פתרון מניות נגיף HSV-1
    הרדמת פתרון - Ketaminדואר 100 מ"ג / קילוגרם וXylazine-10 מ"ג / קילוגרם
  2. קח את 1 μl של וירוס (10 6 pfu) לmicrosyringe 5 זכוכית μl מחובר למכשיר משאבת microsyringe אספקת 0.1 μl / sec הערה:. Resuspend מניית הווירוס במדיום אדום ללא פנול כדי לראות את הגבול בין השמן האדום להציג בנימים ופתרון הווירוס ולהימנע מהזרקת אוויר באתר של חיסון בנגיף.
  3. הנח את העכבר בהרדמה (קטמין-100 מ"ג / קילוגרם וXylazine-10 מ"ג / קילוגרם) על הגב עם הפנים כלפי מעלה שלה.
  4. מקם את ראש העכבר הרדים תחת סטריאו מיקרוסקופ משקפת ולהכניס את המחט בשכבת subepithelial של השפה העליונה משמאל בגבול mucocutaneous. להזריק את פתרון הווירוס בשני שלבים (פעמיים 0.5 μl) במהירות של 0.5 μl לכל 5 שניות הערה:. כבד הפסקה 10 שניות בין שתי זריקות 0.5 μl, כדי לאפשר ההשעיה נגיפית לספוג באתר ההזרקה.
  5. מניחים את העכבר ב37 מעלות צלזיוס חממה עד התעוררות.
  6. השאר את העכבר במתקני בעלי החיים להתאושש במשך הזמן הנדרש הערה:. במודל העכבר, HSV-1 גורם לזיהום ראשוני, שנקרא זיהום חריף, שנמשך פחות מ -10 ימים באתר של חיסון ובתוך כמה רקמות עצביות כוללים TGS, גרעיני צוואר הרחם מעולים (SCG), וגרעינים הגבי שורש (DRG) בהתאם לאתר החיסון. סימנים של זיהום ראשוני בהדרגה להיעלם והשהיה נחשבת הוקם באופן מלא על 28-30 ימים לאחר פגיעה (dpi) ואילך. ניתן לקצור רקמות עצביות בדרך כלל בין 4 dpi למחקרים על זיהום חריף, ומ28 dpi ללימודי חביון.

2. העכבר זלוף לתקן

  1. הכן את הפתרונות הבאים לפני שמתחיל: 50ml של חיץ מלח פיסיולוגי

    60 מיליליטר של 1x PBS
    150 מיליליטר של paraformaldehyde 4% מוכנים טרי ב1x PBS
    60 מיליליטר של סוכרוז 20% ב 1x PBS.
  2. הכן את צינורות טפטוף: לחבר את המחט לנימים, אשר מחוברת למשאבת peristaltic.
  3. להרדים את העכבר כפי שתואר לעיל (1.2 SREP) ולהניח אותה על הגב שלה על מגש לנתיחה, מחובר על ידי ארבע רגליים עם סיכות.
  4. מספריים באמצעות לחתוך את העור מהבטן עד לגרון *. לקרוע את שכבת הרקמה דקה המכסה את האיברים. פתח את כלוב צלעות על ידי חיתוך הצלעות בצד אחד של עצם החזה. הסר את העור על ידי תלישה. להעביר אחד משני מימין וחלקים השמאליים של בית החזה כדי לחשוף את לב הערה:. שים לב שלא לחתוך את המעיים, ריאות וכלי גדולים (עורקי ראש וורידי הצוואר), אשר יהפכו ינקבו-קיבעון בלתי אפשרי.
  5. הכנס את המחט בחדר השמאלי *. לחתוך את אטריום ימין עם המספריים. להמשיך עם exsanguination ידי הזרקת 20 מיליליטר של תמיסת מלח פיזיולוגית בכלי הדם בלב. תן את זרימת הדם במגש. לאטה: במהלך הליך זה, שים לב שלא לנקב דרך הצד של הלב האחר.
  6. תנקב עם 150 מיליליטר של PFA 4% ב 1x PBS במהלך 15 * דקות (זהירות: PFA הוא רעיל, לתפעל מתחת למכסת מנוע קטר). Perfuse 60 מיליליטר של סוכרוז 20% ב 1x PBS במהלך 6 דקות. בשלב זה העכבר מוכן לקצירת TG הערה:. הגדר את המשאבה ל10 מיליליטר / דקה. זלוף טוב הוא מורגש כאשר זנב העכבר מתקשח למעלה, להרים ואז ליפול שוב.

3. קציר TG

  1. הכן את הפתרון הבא לפני שמתחיל:

    סוכרוז 20% ב 1x PBS
  2. חותכים את הראש ברמה של הצוואר. חותכים את קצה האף ממש מאחורי השיניים החותכות על מנת לחשוף את חלל האף. לחתוך את החיך בשתיים עם מספריים ולהתרחק מכל צד של חיך הערה:. TGS מופיע בדיוק מתחת לחיך, כשני המונים לבנים ומלבניים של 2-3 מ"מ האורך ממוקם בצד הימין ובצד שמאל ומחובר לעצב המשולש.
  3. חותכים את ענפי עצב המשולש בכל צד של TGS לשחרר TGS מגזע המוח. הסר את TGS עם צבת כירורגית ולשמור אותם בתמיסה סטרילית סוכרוז 20% ל24 שעות הערה:. השתמש שני נמענים שונים עבור השמאל וימין TGS, כדי למנוע בלבול בין TG עזב (נגוע) וTG תקין (לא או נדבק בחולשה). דגירה TGS בסוכרוז 20% ב 1x PBS עבור 24 שעות לפני ההטבעה.
  4. שבץ TGS בבלוק אחד בcryosectioning הטבעה בינוני והקפאה ב -80 ° C.
  5. בלוקים חנות ב -80 ° C עד חתך.

4. Cryosection הכנה

  1. חותכים את אורכו TGS כ10 מיקרומטר סעיפים ב-20 ° cryostat C, ולמקם אותם בשקופיות (30 מעלות צלזיוס) Superfrost מעט מחוממות. בואו פרוסות להתייבש במשך 5-10 דקות לאחר מכן להקפיא ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש הערה:. עד 4-5 חלקים יכולים להיות PLAced בשקופית אחת, אם מספר גדול של חלקים הוא להיות מעובד באותו הזמן. אנו ממשיכים כדלקמן: סעיפים סידוריים מופקדים 3 סדרה של שקופיות שהכותרת A1, B1 על, וC1, אז A2, B2, C2 וכן הלאה. לפיכך, כל סדרת שקופיות (A, B, ו-C) יכולה להיות מעובד לצביעה שונה (הכלאה באתרו, דגים, באתר PCR, LCM) ונתונים המתקבלים תוך שימוש בטכניקות השונות ניתן להשוות בידיעה כי שקופיות שנשאו את אותו המספר מתאימות לאותו האזור של TG.

5. תיוג בדיקה HSV-1

הפרוטוקול מתואר להלן לגילוי הגנום HSV-1 על ידי DNA FISH שמש בהצלחה עם שני סוגים של בדיקות. הראשון הוא בדיקה ניאון שמתאימה לניתוח הקנס של ארגון גרעיני בתוך תאים בודדים, על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי ההגדלה הגבוה שכותרתו Cy3 תוצרת בית. השני היא בדיקה biotinylated זמינה מסחרי, שבו ניתן לשלבד עם הגברה אות מבוססת peroxidase לספק אות בהירה. האחרון הוא מתאים לזיהוי וכימות של וירוסים המכילים תאי עצב בהגדלה נמוכה בכל סעיף, ועבור הניתוח של דפוסי הגנום HSV-1. משתמשי קצה צריכים להעריך איזו גישה המתאימה ביותר למטרה של המחקר שלהם. הבדיקה זמינה המסחרית רשומה בסעיף מגיב, וההכנה של חללית תוצרת הבית מתוארת להלן.

  1. הכן את הפתרונות הבאים לפני שמתחיל:

    HSV-1 וקטורי הגנום מכיל (ראה שלב 1)
    70% אתנול, כיתה ביולוגיה מולקולרית.
  2. . הכן cosmids המכיל 30 מנות kb של HSV-1 הגנום (cosmids מספר 14, 28, ו56 מתוארים התייחסות 20 באמצעות עמודות טיהור מוקדשת לוקטורים גדולים הערה: סוג אחר של ספריות המכילות גנומים HSV-1, כגון כרומוזומים מלאכותיים חיידקים צריכים עובד כמו גם, כל עוד הבדיקה מכסה אלחלק arge של הגנום HSV-1 כדי לייצר אות מספיק 27-29. בידיים שלנו, בדיקות שנעשו מעמוד שדרת וקטור cosmid לא מייצרות שום אות, ושמשו כביקורת שלילית. וקטורי cosmid לכן כל המכילים רצף HSV-1 שימשו במחקר שלנו. אפשר גם לחתוך את רצף HSV-1 ולהשתמש בו כדי להכין את החללית.
  3. . תווית 2 מיקרוגרם של כל cosmid עם Cy3-dCTP באמצעות ערכת nick-תרגום על פי הנחיות יצרן הערה: בצע תיוג עם תערובת תגובה מכילה Cy3-dCTP בלבד ולא dCTP ללא תווית.
  4. עצור את התגובה על ידי הוספת 3 μl של 0.5 M EDTA בתערובת והחימום ב70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. מגניב על קרח.
  5. לטהר את החללית על minicolumn הדרת ג'ל G50. הוסף 150 מיקרוגרם של ה-DNA זרע סלמון לבדיקה ולזרז את הבדיקה על ידי משקעים אתנול. גלולה DNA צריכה להיות ורוד עקב התאגדות Cy3. שטוף את הכדור עם 70% אתנול ולהסיר כמה שיותר אתנולככל האפשר עם טפטפת. אל תתנו יבש גלולה.
  6. ממיסים את גלולה עם של פוראמיד deionized 100 μl (זהירות: פוראמיד הוא רעיל מניפולציות מתחת למכסת מנוע קטר.). ריכוז הבדיקה לא ניתן למדוד באופן מהימן בשלב זה. כמויות הבדיקה שהוזכרו בטקסט מתייחסות לכמות של ה-DNA התבנית ששמשה לביצוע הבדיקה. הפרוטוקול שמבוסס על 2 מיקרוגרם של תבנית ה-DNA ושל פוראמיד 100 μl, זה נחשב 20 ng / μl. חנות ב -20 ° C. הבדיקה שכותרתו ניתן להכין בכמות גדולה ולאחסן קפוא במשך כמה חודשים.

6. DNA-FISH

איור 1 מציג סקירה של השלבים העיקריים של פרוטוקול ה-DNA-FISH, וכיצד לבצע את ה-DNA-FISH כחלק מניסוי מכתים מרובים codetect RNA וחלבון, כפי שתואר בפרוטוקולים 7-9.

  1. הכן את הפתרונות הבאים לפני שמתחיל:

    0.5% טריטון X-100 ב 1x PBS
    2x SSC וחיץ SSC 0.2X
    6.0 חיץ ציטרט pH מ"מ 100 מ"מ pH 6.0 חיץ ציטרט (פתרון מניות 10x) ו10 (פתרון עובד)
    חיץ הכלאת 2x (ראה 4 לפרוטוקול)
  2. ביום 1, במקום שקופיות על מחזיק שקופיות בטמפרטורת חדר, ולתת את החלקים להתייבש במשך 10 דקות. הקף בעיגול את החלקים עם עט הידרופובי. רעננותם הסעיפים ב1x PBS עבור 10 דקות. דגירה הסעיפים 20 דקות עם 0.5% טריטון X-100 ב 1x PBS לpermeabilize הרקמות. 3x לשטוף 10 דקות עם 2x SSC, ולשמור ב2x SSC עד חיץ הסרת המסכות מחומם (ראה להלן).
  3. להסרת מסכות, להכין מגש זכוכית שקופית (קיבולת 20 שקופיות) מלאים ב200 מיליליטר של חיץ 10 מ"מ ציטרט הנתרן (pH 6.0). מניחים את המגש במכל גדול יותר מלא ב500 מיליליטר של מים מזוקקים. הגדרה זו מאפשרת לשליטה טובה יותר של קטניות חימום. לפני הצבת השקופיות במגש, מחממים את החיץ בתנור המיקרוגל עד buffer מגיע רתיחה (כ -8 דקות ב800 W).
  4. מניחים את השקופיות במגש המכיל חיץ ציטרט שחומם מראש, ולוודא שהם מכוסים לגמרי עם חיץ. מחממים במשך כ 20 שניות עד שמגיע לרתיחת החיץ. זהירות, לא לתת לחיץ מעל הרתיחה, שעלול לגרום נזק לרקמות. להתקרר בטמפרטורת חדר למשך 2 דקות. חזור על 6x מחזור החימום (7 מחזורי חימום בסך הכל) *. לצנן 2 דקות ולהעביר את השקופיות ב2x SSC עבור 5min.
    * הערה: זה הוא אחד השלבים הקריטיים ביותר. המספר ומשך הזמן האופטימלי של מחזורי חימום צריכים להיקבע באופן אמפירי, ועלולים להשתנות לסוג של רקמה או הסוג של בדיקה בשימוש. המיקרוגל, המגש, מיכל והנפח של חיץ במגש והמים במכל צריך להיות כל הזמן זהה לשחזור של הסרת מסכות. רתיחה מוגזמת יכולה לגרום לאובדן רקמה ותאים פגועים. לכל דופק חימום, את המראה של רתיחה הוא התבונן בזהירות, וחוםING יש לעצור בסימנים הראשונים של רתיחה. לאחר הגדרה, הסרת מסכות מופיעה איור 2 א. חזק והשחזור מראה כי הגנום HSV-1 יכול להיות מזוהה על ידי הסרת מסווה מעל עם מאגרים שונים, מצביעים על כך שתנאי הסרת מסכות יכולים להיות חוקרים נוסף. הסרת מסכות מבוססות ציטראט נמצאה כדי לספק באופן עקבי אות דגים טובה, ושימור רקמות, עם קטעים ממודלים במעבדה ובבעלי חיים שונים.
  5. דגירה השקופיות במתנול: חומצה אצטית: תמהיל PBS (3:01:04) במשך 15 דקות, ולאחר מכן במתנול: תערובת חומצה אצטית (3:1) במשך 15 דקות (זהירות: חומצה אצטית הוא מאכל מניפולציות תחת קטר. מכסה המנוע ולהשתמש בהגנה נאותה. הכן את הפתרון הזה ממש לפני השימוש).
  6. מייבשים את הקטע דרך דגירה 10 דקות רצופות ב70%, ולאחר מכן 2x 10 דקות ב100% אתנול. בואו יבש בטמפרטורת חדר למשך 10 דקות. שמור יבש עד חיטוט.
  7. הכן את פתרון החיטוט כדלקמן: להכין מראש 20 מיליליטר מניות של שיתוף חיץ הכלאת 2xntaining 20% ​​סולפט dextran (MW 500,000), הפתרון של 2x Denhardt, SSC 4x *. Aliquot הפתרון כמו 500 μl בmicrotubes, ולאחסן ב -20 ° C. לשקופית 1 (coverslip של 22 מ"מ x 50 מ"מ), לערבב 90 ננוגרם של HSV-1 בדיקה Cy3 שכותרתו (30 ננוגרם של בדיקה עבור כל cosmid), ולהשלים את הנפח ל -40 μl עם פוראמיד. הוסף 40 μl של חיץ הכלאת 2x. מערבבים היטב על ידי pipetting מעלה ומטה מספר פעמים.
    * הערה: כדי להכין את חיץ הכלאה 2x, לערבב 4 גרם של סולפט 500,000 dextran MW ב10 מיליליטר של מים מזוקקים. זה עושה את תערובת סמיכה המתמוססות על 3-4 שעות ב70 ° C. מערבבים באופן קבוע כדי לעזור לפזר. הוסף 4 מיליליטר של 20x SSC, 400 μl של 100x הפתרון של Denhardt. השלם 20 מ"ל ומערבבים היטב בעזרת מערבולת.
  8. זרוק 80 μl של חיטוט פתרון על החלקים היבשים. כסה עם coverslip זכוכית x 50 מ"מ 22 מ"מ, ולוודא כי פתרון החיטוט משתרע על פניאת כל פני השטח של coverslip. זהירות: לא צריכה להיות שום בועות. נוכחות של בועות פוחתת יעילות הכלאה. לאטום את coverslip באמצעות מלט גומי, ולתת לו להתייבש. שמור את השקופיות בחושך בטמפרטורת חדר למשך לפחות 2 שעות לאות הכלאה אופטימלית לאורך כל השקופית.
    הערה: מלט גומי הוא נוח כפי שהוא מתייבש במהירות, עמיד למים, ומגן על המדגם מהתייבשות במהלך הכלאה. זה גם קל לקלף כדי להסיר את coverslip לאחר הכלאה. לק הוא חלופי יעיל, אבל אופציה פחות נוחה.
  9. להמשיך עם denaturation ידי הצבת השקופיות על חממת שקופיות 80 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. לחלופין, למקם את השקופיות על מגש מתכת ומניח את המגש באמבט מים 80 מעלות צלזיוס (המגש צריך לצוף). לאחר מכן להעביר במהירות את השקופיות על גבי מגש מתכתי מונח על קרח. השאר למשך 5 דקות. העברת השקופיות על 37 מעלות צלזיוס (תנור שקופית או חממה) להכלאה בין לילה.
    הערה: אנחנו לא ממליצים הכלאה קצרה יותר, וכתוצאה מכך חלש או אין אות.
  10. ביום 2, הסר את מלט הגומי עם מלקחיים, תוך שמירה על השקופית על התנור כדי לשמור על הסעיף ב37 ° C. הסר את coverslip בעדינות עם הקצה של להב סכין מנתחים.
  11. 3x לשטוף עם 2x SSC ב37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ושלוש פעמים עם SSC 0.2X על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. שטפי פעם עם 2x SSC בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות ולהמשיך עם מכתים DNA והרכבה (ראה פרוטוקול 10 בהמשך).
    הערה: שיטה זו מאפשרת זיהוי של מטרות הגנומי סלולריות, באמצעות בדיקות המתאימות לפתרון החיטוט יחד עם HSV-1 בדיקות ספציפיות כפי שפורסם לcentromeric ורצפי pericentromeric 22.

7. FISH RNA-DNA הכפול

ראה איור 1, קופסות ירוקות לסקירה.

למספר רב שלמכתים את ההליכים, לרבות צעד RNA-FISH, זה בדרך כלל מומלץ ראשון לבצע זיהוי RNA כיעד כזה הוא רגיש לשפלה על ידי RNAse וכימיקלים. בנוסף, הליך ה-DNA-FISH כולל טיפולים המקטינים את היעילות של כתמים אחרים. עבור RNA-FISH, בחרנו בגישת זיהוי אנזים מבוססת (tyramide איתותים ההגברה (TSA) באמצעות בדיקות biotinylated וperoxidase (HRP streptavidin) בשילוב). TSA מבוסס על מצע ניאון tyramide (ראה טבלה מגיב לפרטים נוספים), אשר קשור קוולנטית לרקמה על ידי תגובה האנזימטית peroxidase. אות RNA-FISH נשמרה כך במהלך DNA-FISH.

  1. הכן את הפתרונות הבאים לפני שמתחיל:

    וקטור לשעתוק במבחנה של מוקד LAT (pSLAT-2)
    1x PBS המכיל 2 מ"מ RVC
    0.5% טריטון X-100 ב 1x PBS המכילים 2 מ"מ RVC
    3% H 2 0 2 במים מזוקקים.
    70%, 80%, 95% אתנול, כיתה ביולוגיה מולקולרית.
    פתרון הכלאת RNA 4x (ראה 4 לפרוטוקול)
  2. לפחות יום אחד לפני ניסוי RNA-FISH, להכין את חללית FISH-RNA. כדי לזהות את Latency Associated Transcript HSV-1 (LAT), להכין ribo-בדיקה biotinylated מpSLAT-2 הווקטור 30, או נתיב אחר לשעתוק במבחנה של לוקוס LAT, כפי שתואר לעיל בהתייחסות 26. בקצרה: Linearize 10 מיקרוגרם של pSLAT-2 עם HindIII ולטהר את הווקטור מתעכל עם ערכת טיהור ה-DNA. לסנתז ribo-בדיקה גדיל בודדת מ2 מיקרוגרם של pSLAT-2 מתעכלים עם ערכת T7 שעתוק במבחנה בנוכחות ביוטין-16-UTP *. לטהר את החללית עם מיני עמודת RNA ולכמת ב260 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר. לדלל את החללית ב50 ng / μl במים חופשיים DNAse / RNAse ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס, בaliquots הקטנים, כדי למנוע מחזורי הקפאת הפשרה.
    * הערה: ביוטין-16-UTP: יחס UTP צריך להיקבע באופן אמפירי. אנו found יחס 40:60 לספק בדיקות ביעילות גילוי LAT ידי RNA-FISH.
  3. ביום 1, במקום שקופיות על מחזיק שקופיות בטמפרטורת חדר, ולתת את החלקים להתייבש במשך 10 דקות. הקף בעיגול את החלקים עם עט הידרופובי. רעננותם הסעיפים ב1x PBS המכילים 2 מ"מ מורכב Ribonucleoside vanadyl (RVC) * ל10 דקות. דגירה הסעיפים עבור 20 דקות עם 0.5% טריטון X-100 ב 1x PBS המכילים 2 מ"מ RVC לpermeabilize הרקמות. לשטוף 3x 10 דקות עם 1x PBS, 2 מ"מ RVC. כדי להרוות את כל פעילות peroxidase אנדוגני, דגירה הסעיף ב 3% H 2 O 2 ל2x 10 דקות, ולאחר מכן לשטוף פעם עם 1x PBS, 2 מ"מ RVC.
    * הערה: לאורך כל הליך RNA-FISH, ribonucleoside המורכב vanadyl (RVC) מתווסף למאגרים ופתרונות כדי למנוע השפלה RNA.
  4. דגירה 2x 10 דקות ב70% אתנול. בשלב זה, ניתן לאחסן את חלקים ב70% אתנול ב-20 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות. מייבשים את החלקים על ידי דגירה ב80%, 95%, ומכון טכנולוגי של 100%anol, 5 דקות כל אחד. בואו יבש הסעיף לפחות 10 דקות.
    הערה: במקרים מסוימים, טיפול באתנול יכול להיות מזיק לצורך זיהוי של מטרות אחרות. ניתן להשתמש 2x SSC (ראה להלן ב9 פרוטוקול לקבלת פרטים על צביעה משולשת) - פרוטוקול חלופי ובצעד prehybridization בפוראמיד 50%. עם זאת, טיפול באתנול הוא הגישה תכליתית ביותר לRNA-FISH ומספק הרקע הנמוך ביותר.
  5. הכן את פתרון החיטוט כדלקמן: להכין מראש 10 מיליליטר מניות של פתרון הכלאת RNA המכיל 4x 8x SSC, 20x הפתרון של Denhardt, 4 mM EDTA, dextran 40% *. Aliquot הפתרון כמו 500 μl בmicrotubes, ולאחסן ב -20 ° C. לשקופית 1 להכין 80 μl של פתרון (coverslip של 22 מ"מ x 50 מ"מ), על ידי ערבוב 20 ng של riboprobe LAT biotinylated, 40 ng של השמרים tRNA, 2 מ"מ RVC, ושלם ל20 μl עם מים. הוסף 20 μl של פתרון הכלאת RNA 4x, ו40 μlשל פוראמיד (50% ריכוז סופי). עבור pipetting וערבוב קלים יותר, מומלץ לprewarm פתרון הכלאת RNA 4x ב75 ° C. מערבבים היטב על ידי pipetting מעלה ומטה מספר פעמים.
    * הערה: כדי להכין את פתרון הכלאת RNA 4x, לערבב 4 גרם של סולפט dextran (MW 500,000) ב 3 מיליליטר של מים מזוקקים ו4 מיליליטר של 20x SSC. זה עושה את תערובת סמיכה המתמוססת על 3-4 שעות ב70 ° C. מערבבים באופן קבוע כדי לעזור להמסה. הוסף 2 מיליליטר של 100x הפתרון של Denhardt, ו80 μl של פתרון EDTA 0.5 M. השלם ל10 מיליליטר עם מים ומערבבים היטב בעזרת מערבולת. זהירות: השתמש רק במוצרים בחינם RNAse / DNase.
  6. לפגל הבדיקה דקות 10 ב75 ° C. בינתיים, במקום שקופיות בחממת שקופיות מוגדרות 65 ° C. זרוק 80 μl של פתרון בדיקה על הסעיפים ובמהירות במקום coverslip על הירידה. זהירות: לא צריכה להיות שום בועה. נוכחות של בועות יורדת EFF של ההכלאהiciency. דגירה יש להיערך בתא humidified מאז coverslip אינו אטום. השתמש באחת חממת שקופית שיכול להחזיק מים (ראה טבלת חומר), או להכין תא humidified בתוך קופסא אטומה ולמקם אותו בתנור הכלאת C 65 מעלות.
  7. דגירה הלילה בשעה 65 ° C. הערה: RNA-FISH LAT מתבצע ב65 ° C כדי למנוע ספציפי מחייב של החללית, אשר נצפתה על 37 ° C. בדיקות RNA-FISH רבות אחרות צריכים לגרום לאות טובה על 37 ° C.
  8. ביום 2, לפני תחילת כביסה, להכין את חומרים כימיים גילוי בהתאם להוראות היצרן של ערכת זיהוי ה-TSA. זיהוי נעשה עם ערכת זיהוי מסחרית TSA כולל חזרת peroxidase (HRP) streptavidin בשילוב ומצע ניאון ירוק או כחול.
  9. שמור את השקופיות על דוד השקופית ב65 ° C. מוציא בזהירות את coverslip ומהירות להוסיף 1 מיליליטר של פוראמיד 50% ב2x SSC, prewarmedלא 65 ° C. זהירות, לא נותנת יבשה הסעיף. לשטוף פעמיים 10 דקות על 65 מעלות צלזיוס בפוראמיד 50% ב2x SSC ו2x 10 דקות ב2x SSC ב65 ° C. לשטוף שוב עם 2x SSC ובמקום להחליק על דוד שקופיות 37 מעלות צלזיוס.
  10. להמשיך לשלב הגילוי בהתאם להוראות יצרן ערכת זיהוי ה-TSA. הריכוז של HRP-streptavidin, ריכוז מצע ניאון וזמן תגובה צריך להיקבע באופן אמפירי *. לגילוי RNA LAT, השתמשנו באופן שיגרתי את המצב הבא: HRP-streptavidin המדולל ב1/500, מגיב ניאון ב1/100 לקרינה כחולה ו1/500 לקרינה ירוקה, וזמן תגובה של 10 דקות. האות ניתן לבדוק במהירות עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך ללא הרכבה, לפני שתמשיך עם ה-DNA-FISH.
    * הערה: פרוטוקול ההגברה יהיה עיצוב על פי המטרות העיקריות של הניסוי. לדוגמה, כדי דק בתרגום רנ"א היעד, זה מודעהvised להשתמש בזמן תגובה קצר. לעומת זאת, כדי לזהות במהירות ולספור תאים חיוביים בהגדלה נמוכה, זמן תגובה יכול להיות מוגבר כדי ליצור אות בהירה.
  11. עבור ה-DNA-FISH, בצע את ההליך שצוין לעיל, החל מהשלב הסרת המסכות (שלב 6.2).

8. FISH החיסוני-DNA

ראה איור 1, קופסות סגולות לסקירה.

באופן דומה ל-RNA-DNA-FISH, מומלץ לבצע ראשון immunofluorescence, שכן ה-DNA-FISH עלול לפגל חלבונים ולמנוע זיהוי שלהם על ידי נוגדנים. איכות אות immunofluorescence תלויה מאוד במאפייני הנוגדנים, ויש לבדוק כמה נוגדנים בכל הזדמנות אפשרית. הסרת מסכות Epitope מתבצעת פעם אחת לפני immunofluorescence כדי לשפר הן זיהוי החלבונים ו-DNA-FISH. כדי לשמר את אות immunofluorescence על המדגם במהלך הליך ה-DNA-FISH יש צורך covalently לקשר אותו לרקמות. אנו מציגים כאן שתי גישות שספקו תוצאות טובות בידיים שלנו, זיהוי נוגדן המבוסס הודעה קיבעון וtyramide (ראה שלב 8.5). הבחירה צריכה להיות מונעת על ידי בדיקות מקדימות לכל זוג היעד / נוגדן.

  1. הכן את הפתרונות הבאים לפני שמתחיל:

    1x PBS המכיל 3% עזים בסרום נורמלי (NGS).
    2% PFA ב 1x PBS (דילול מפתרון מניות 4%)
  2. ביום 1, את הצעדים הראשונים זהים ל-DNA-FISH, עד שלב הסרת המסכות (שלבים 6.1-6.2).
  3. לאחר שחשף, דגירה החלקים עם 1x PBS המכיל NGS 3% במשך שעה 1.
  4. דגירה עם הנוגדן הראשוני המדולל ב 1x PBS המכיל NGS 3% ל24 שעות. זמן דגירה נמוך יכול לשמש כדי לקצר את הפרוטוקול, למרות שאנו מצאנו כי דגירה לילה בדרך כלל תוצאות באות חזק יותר. עד 48-72 שעות של דגירה ייתכן שתידרשנה לנוגדנים ראשוניים זיקה נמוכים כגון IgM.
  5. ביום2, לשטוף 3x 10 דקות עם 1x PBS.
  6. פרוטוקול עם נוגדן הודעה קיבעון-: דגירה 1 שעות עם שני הנוגדנים בשילוב עם צבע פלואורסצנטי ירוק, ב1/200 ב 1x PBS המכילים 3% NGS. לשטוף שלוש פעמים 10 דקות עם 1x PBS. לאחר הקיבוע מבוצע עם 2% PFA ב 1x PBS עבור 10 דקות *. לשטוף 3x 10 דקות עם 1x PBS.
    פרוטוקול עם זיהוי ה-TSA: דגירה 1 שעות עם הנוגדנים משני יחד-HRP ב1/250 ב 1x PBS המכילים NGS 3%. לשטוף שלוש פעמים 10 דקות עם 1x PBS. להמשיך עם זיהוי tyramide בהתאם להוראות היצרן. כפי שצוין לעיל (שלב 7.9), דילול מגיב וזמן תגובה צריך להיקבע באופן אמפירי. ברוב המקרים, הפרוטוקול שלנו היה מבוסס על דילול 1/500 של מצע הניאון וזמן תגובה 10 דקות. לשטוף 3x 10 דקות עם 1x PBS.
    * הערה: פוסט קיבעון הוא שלב קריטי באימונו-FISH, ודורש הגדרה זהירה. לאחר הקיבוע חזק יותרטוב יותר את האות אם, ונמוך יותר את יעילות ה-DNA-FISH.
  7. להמשיך עם ה-DNA-FISH מהצעד מתנול החומצה אצטית (שלב 6.3). משך חיסוני DNA-FISH הוא בדרך כלל 3 ימים, עם הנוגדן הראשון מודגרות לילה.

9. FISH-DNA-RNA הכפול יחד עם Immunofluorescence

ראה איור 1, תיבות תפוזים לסקירה.

RNA-FISH מבוצע ראשון, ואחרי immunofluorescence, ו-DNA-FISH לבסוף. אם immunofluorescence הוא זוהה על ידי תגובת tyramide, זה מפתח ללהרוות לחלוטין את פעילות HRP מהצעד RNA-FISH עם H 2 O 2, וכדי לוודא שהמרווה היא יעילה. הדבר נעשה על ידי שימוש בשקופית אחת כביקורת "אין נוגדן ראשוני".

בגלל ההתייבשות מבוססת אתנול היא מזיקה לחלבונים מסוימים ממס רגיש, הצעד הזה של RNA-FISH יכול לעכב immunofluorescence. אם כן, RNA-FISH יכול להתבצע wה-i פרוטוקול חלופי, כמפורט להלן ב9.3 stpe.

  1. הכן את הפתרון הבא לפני שמתחיל:

    פוראמיד 50% ב 1x PBS המכיל 2 מ"מ RVC
  2. ביום 1, להכין את חללית RNA-FISH והמשך כעבור RNA-FISH הכפול, עד H 2 O 2 צעד מרווה (שלב 7.2).
  3. מקרה 1, מכתים immunofluorescence עובד לאחר התייבשות אתנול: להמשיך עם RNA-FISH כפי שצוין לעיל בצעדים 7.3-7.9. לאחר מכן המשך לשלב 9.6 להלן.
  4. מקרה 2, מכתים immunofluorescence נמנע על ידי טיפול באתנול: מניחים את השקופיות בתא humidified על דוד שקופיות מוגדר 65 ° C ו דגירה של 1.5 שעות בתמיסה המכילה prehybridization פוראמיד 50%, 1x PBS, ו2 מ"מ RVC. מסננים את פתרון prehybridization ושחרר 80 μl של פתרון הכלאה כפי שצוין בצעדים 7.4 ו7.5. לאחר מכן להמשיך עם הכלאה RNA-FISH וזיהוי כabov הצביעדואר בצעדים 7.6-7.9 (יום 2 ו -3).
  5. ביום 2, לאחר RNA-FISH הושלם, להמשיך עם חיסוני DNA-FISH החל בשלב הסרת המסכות (ראה שלב 6.2). לאחר מכן, בצע את הפרוטוקול חיסוני DNA-FISH כפי שצוין לעיל בצעדי 8.2-8.6.

10. הרכבה שקופיות והדמיה

  1. הכן את הפתרון הבא לפני שמתחיל:

    Hoechst 33342 ב0.5 מיקרוגרם / מיליליטר ב1x PBS
  2. גרעיני כתם עבור 10 דקות עם DAPI או Hoechst 33,342 * ב0.5 מיקרוגרם / מיליליטר ב1x PBS עבור 10 דקות. לשטוף 3x 10 דקות עם 1x PBS.
    * הערה:. זהירות אם אחת ממערכות זיהוי משתמש בצבע כחול ניאון, אל תשתמש DAPI או Hoechst. במקום זאת, השתמש צבעי DNA ניאון עם ספקטרום פליטה באורך הגל מרחיק האדום כגון Topro3.
  3. מסננים הרבה נוזלים ככל האפשר מהשקופיות. זרוק 80 μl של מדיום הרכבה המכיל סוכן antifading בקצה אחד של השקופיות. לכסות את החלקים עם איכות אופטית גבוההcoverslip (N ° 1.5 זכוכית). בואו coverslip לרדת באיטיות על ידי שמירה על זה בקצה אחד עם מלקחיים, על מנת לאפשר את מדיום ההתפשטות הגוברת על הסעיף ללא בועות.
  4. לאטום עם לק ולאחסן ב 4 ° C בתיבת שקופיות כהות.
  5. תצפית ישירה של אות ה-DNA-FISH של הגנום HSV-1 סמוי דורשת אובייקטיבית 40X ומעלה הגדלה טבילת שמן, עם צמצם מספרי גבוה (לדוגמא 40X NA 1.1, 60x-63X NA 1.4, 100X NA 1.3) ומקור אור העירור של לפחות שווה ערך למנורת כספית 100 W. אנו מייעצים באמצעות מיקרוסקופ שידור יעילות גבוהה כגון אלו המסופקים על ידי יצרנים ב 5 השנים האחרונות (ראה טבלה של ציוד). מיקרוסקופיה confocal מספקת כלים לאיסוף תמונות עם רקע נמוך יותר בשל אוטומטי הקרינה של הרקמות, כגון חתך דק או הדמיה של רוח רפאים.

תוצאות

לאחר מספר חודשים של בדיקות מקיפות, גילתה שהסרת מסכות כימיות המבוסס על חום שנעשתה הגנום HSV-1 סמוי זמינה עבור ניאון הכלאה באתר. במהלך התהליך, ניסינו נהלי הסרת מסכות שונים, וטיפולים היחידים המבוסס על חום (כלומר חימום החלקים עד לטמפרטורה תת רתיחה במיקרוגל) הופיעו...

Discussion

הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר זיהוי של HSV-1 הגנום סמוי בתוך הנוירונים של חלקי רקמות עצביים עכבר. ההבנה של מסלולי ויסות ביטוי הגנים נגיפיים שלנו הייתה מוגבלת על ידי חוסר השיטה לגילוי HSV-1-DNA הגנומי באתרו בתוך רקמות עצביות. מידע על מספר עותק הגנום וחלקם של תאי עצב נגועים...

Disclosures

המחברים מצהירים שום אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgements

אנו מודים לנ Sawtell (מרכז הרפואי בית החולים לילדים בסינסינטי, סינסינטי, אוהיו, ארה"ב), ש 'Efstathiou (אוניברסיטת קיימברידג', בריטניה) וג'יימס היל (LSU למדעי בריאות מרכז, ניו אורלינס, ארה"ב) עבור מתן דגימות מHSV-1 נגוע בעכברים וארנבים, בהתאמה, ולחומרים כימיים; H. Masumoto (מקזוסה DNA מכון מחקר, צ'יבה, יפן) וס 'Khochbin (Institut אלברט Bonniot, גרנובל, צרפת) לדיונים מועילים.

עבודה זו מומנה על ידי מענקים מהמרכז הלאומי de la משוכלל ונדיר Scientifique (CNRS) (תכנית ATIP, לPL, http://www.cnrs.fr), הצרפתי הלאומית למחקר הסוכנות (ANR) (ANR-05-MIIM- 008-01, CENTROLAT, http://www.agencenationale-recherche.fr), קרן FINOVI (http://www.finovi.org/:fr:start), DEVweCAN LabEX (ANR-10-LABX-61 ) של אוניברסיטת דה ליון, במסגרת התכנית "Investissements d'Avenir "(ANR-11-IDEX-0007) המופעלים על ידי ANR (http://www.agence-nationale-recherche.fr), l'Association לשפוך la משוכלל ונדיר contre le הסרטן (ARC-7979 וARC- 4910, http://www.arc-cancer.net), לה Ligue Nationale Contre le סרטן (LNCC, http://www.ligue-cancer.net), והאינקה (תכנית EPIPRO, http://www.e -Cancer.fr). FC וPL הם חוקרי CNRS.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Balb/c miceJanvier, France6 week-old females
HSV-1 strainsSC16 strain (wild type)See Labetoule, M. et al. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci 44, 217–225 (2003) for details on HSV-1 strain and virus stock preparation.
Ketamine hydrochlorideSigmaK2753Intraperitoneal injection of a solution containing Ketamine (100mg/kg) and Xylazine (10mg/kg)
Xylazine hydrochlorideSigmaX1251
Paraformaldehyde (PFA)Sigma158127Suspend 4 g of PFA in 90 ml of water. Add 50 µl of 1N NaOH, and heat at 60 °C in a water bath with agitation. PFA dissolves in about 30 min. Add 10 ml of 10x PBS. This solution can be prepared in advance and stored at -20 °C in 5 ml tubes. Caution. Manipulate under a fume hood.
Physiological SalineSigma07982-100TAB-F
1x PBS, pH 7.4 (sterile)Life Technologies10010-015 
SucroseSigma84100Prepare a 20% sucrose solution in 1x PBS.
Cryosectionning embedding medium - Tissue-Tek OCT CompoundSAKURA4583 
Large vector DNA purification kitQiagen12462To purify Cosmid or BAC vector containing HSV-1 genome and store at -20 °C
Nick translation kitRoche Applied Sciences10 976 776 001 
Cy3-dCTPGE HealthcarePA53021Protect from light
0.5 M EDTASigmaE6758 
G50 Mini spin columnGE Healthcare27-5330-01 
Salmon sperm DNA 10 mg/mlInvitrogen Life Technologies15632-011 
Ethanol molecular biology gradeSigma87047Prepare a 70% solution
Salmon sperm DNAInvitrogen Life Technologies15632-011 
Formamid Molecular biology gradeSigmaF9037Caution. Manipulate under fume hood.
HSV-1 biotinylated commercial probe Enzo Life SciencesENZ-40838 
ImmEdge hydrophobic penVector LaboratoriesH-4000 
20x Saline Sodium Citrate (SSC)SigmaS6639Prepare a 2x SSC solution in ddH20.
Triton X-100SigmaT8787Prepare a 10% stock solution in water and store at +4 °C. Prepare the 0.5% solution in 1x PBS right before use.
10 mM Sodium citrate pH 6.0SigmaS1804Prepare a 100 mM stock solution (10x). Weigh 10.5 g of citric acid (MW 210.14). Caution, irritant and toxic, wear appropriate mask and gloves), and dissolve in 400 ml water. Adjust pH at 6.0 with 1 N NaOH (caution, irritant, wear gloves). Adjust to 500 ml with distilled water. Dilute 10x in distilled water before use.
Acetic AcidSigma320099 
Methanol, molecular biology gradeSigma322415 
Dextran sulfate - MW 500,000EuromedexEU0606-A 
Denhardt's solution (100x)Euromedex1020-A 
Rubber Cement "FixoGum"Marabut290110000 
DNA purification kit  - Qiaquick PCR purification kitQiagen28104 
T7 in vitro transcription kitAmbion Life TechnologiesAM1314 
Biotin-16-UTPRoche Applied Sciences11388908910 
RNA purification minicolumnQiagen73404 
Ribonucleoside Vanadyl ComplexNew England BiolabsS1402S 
H2O2SigmaH3410Prepare a 3% solution in distilled water. Store at +4 °C and protect from light.
Yeast tRNAInvitrogen15401011prepare a 10 mg/ml solution in RNAse free water
Normal Goat SerumInvitrogenPCN5000 
Primary antibodiesany supplierThe following primary antibodies were used in the result section: anti-mouse CENP-A (rabbit mAb C51A7, Cell Signaling Technologies), and anti-ATRX H-300 (Santa Cruz Biotechnology)
Secondary fluorescent antibodiesInvitrogen Life TechnologiesThe fluorescent secondary antibodies routinely used in our protocol are Alexa Fluor labeled goat antibodies (IgG H+L). The antibody used in the result section is an anti-rabbit goat antibody labaled with Alexa Fluor 488 (reference A11001)
Tyramide Signal Amplification (TSA) kit - Streptavidin + Alexa Fluor 350 (blue fluorescence)Invitrogen Life Technologies#T20937TSA kits are also available from Perkin Elmer
Tyramide Signal Amplification (TSA) kit - Streptavidin + Alexa Fluor 488 (green fluorescence)Invitrogen Life Technologies#T20932
Hoechst 33342Invitrogen Life TechnologiesH3570Prepare a 0.5 µg/ml solution in 1x PBS immediately before use. Discard the remaining solution.
22 mm x 50 mm coverslip. n°1.5 glassElectron Microscopy Sciences72204-04 
Mounting medium with anti-fading agent - VECASHIELDVector LaboratoriesH-1000Another conventional product is Fluoromount G from Electron Microscopy Science
Superfrost glass slidesFisherScientific12-550-15 
Equipment/MaterialCompanyReferenceNote
Needle for infectionGlass micropipette hot drawn. Custom made.
Dissection equipmentMoria, FranceMicrosurgical scissors and forceps
Peristaltic pumpCole Palmer InstrumentsEasyload Masterflex
Microsyringe pump device (Nano Pump)kdScientificKDS310 
CryostatLeica FranceCM 1510-1 
-80 °C freezerSanyoUltra Low -80 °C
Domestic microwave oven 
Dry block heaterEppendorf022670204 
Incubator Slide moatBoekel Scientific240000 
Coplin JarDominique Dutscher68512 
Staining glass containerDominique Dutscher68506 
Fluorescent microscopeZeissThe images presented in the result section were collected with a Zeiss AxioObserver with objective 40X LD NeoFluor N.A 0.6, and 100X PlanApochromat N.A 1.3. Filter set #38, #43, and #43. HXP 120 fluorescence light source. Photometrics CoolSNAP HQ2 CCD camera. Signal will be more easily observed on a recent high efficiency microscope such as Zeiss AxioImager/AxioObserver series, Nikon Ti-E/Ni-E series or Leica DM/DMI6000 series

References

  1. Knipe, D. M., Cliffe, A. Chromatin control of herpes simplex virus lytic and latent infection. Nat. Rev. Microbiol. 6 (3), 211-221 (2008).
  2. Bloom, D. C., Giordani, N. V., Kwiatkowski, D. L. Epigenetic regulation of latent HSV-1 gene expression. Biochim. Biophys. Acta. 1799 (3-4), 3-4 (2010).
  3. Stevens, J. G., Wagner, E. K., Devi-Rao, G. B., Cook, M. L., Feldman, L. T. RNA complementary to a herpesvirus alpha gene mRNA is prominent in latently infected neurons. Science. 235 (4792), 1056-1059 (1987).
  4. Zwaagstra, J., Ghiasi, H., Nesburn, A. B., Wechsler, S. L. In vitro promoter activity associated with the latency-associated transcript gene of herpes simplex virus type 1. J. Gen. Virol. 70, 2163-2169 (1989).
  5. Farrell, M. J., Dobson, A. T., Feldman, L. T. Herpes simplex virus latency-associated transcript is a stable intron. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88 (3), 790-794 (1991).
  6. Umbach, J. L., Kramer, M. F., Jurak, I., Karnowski, H. W., Coen, D. M., Cullen, B. R. MicroRNAs expressed by herpes simplex virus 1 during latent infection regulate viral mRNAs. Nature. 454 (7205), 780-783 (2008).
  7. Jurak, I., Kramer, M. F., et al. Numerous conserved and divergent microRNAs expressed by herpes simplex viruses 1 and 2. J. Virol. 84 (9), 4659-4672 (2010).
  8. Wagner, E. K., Bloom, D. C. Experimental investigation of herpes simplex virus latency. Clin. Microbiol. Rev. 10 (3), 419-443 (1997).
  9. Held, K., Junker, A., et al. Expression of herpes simplex virus 1-encoded microRNAs in human trigeminal ganglia and their relation to local T-cell infiltrates. J. Virol. 85 (19), 9680-9685 (2011).
  10. Held, K., Eiglmeier, I., et al. Clonal expansions of CD8⁺ T cells in latently HSV-1-infected human trigeminal ganglia. J. Neurovirol. 18 (1), 62-68 (2012).
  11. Sawtell, N. M. Comprehensive quantification of herpes simplex virus latency at the single-cell level. J. Virol. 71 (7), 5423-5431 (1997).
  12. Sawtell, N. M., Poon, D. K., Tansky, C. S., Thompson, R. L. The latent herpes simplex virus type 1 genome copy number in individual neurons is virus strain specific and correlates with reactivation. J. Virol. 72 (7), 5343-5350 (1998).
  13. Bertke, A. S., Swanson, S. M., Chen, J., Imai, Y., Kinchington, P. R., Margolis, T. P. A5-positive primary sensory neurons are nonpermissive for productive infection with herpes simplex virus 1 in vitro. J. Virol. 85 (13), 6669-6677 (2011).
  14. Bertke, A. S., Ma, A., Margolis, M. S., Margolis, T. P. Different mechanisms regulate productive herpes simplex virus 1 (HSV-1) and HSV-2 infections in adult trigeminal neurons. J. Virol. 87 (11), 6512-6516 (2013).
  15. Kobayashi, M., Kim, J. Y., et al. A primary neuron culture system for the study of herpes simplex virus latency and reactivation. J. Vis. Exp. (62), (2012).
  16. Kim, J. Y., Mandarino, A., Chao, M. V., Mohr, I., Wilson, A. C. Transient reversal of episome silencing precedes VP16-dependent transcription during reactivation of latent HSV-1 in neurons. PLoS Pathog. 8 (2), (2012).
  17. Zerboni, L., Che, X., Reichelt, M., Qiao, Y., Gu, H., Arvin, A. Herpes simplex virus 1 tropism for human sensory ganglion neurons in the severe combined immunodeficiency mouse model of neuropathogenesis. J. Virol. 87 (5), 2791-2802 (2013).
  18. Mehta, A., Maggioncalda, J., et al. In situ DNA PCR and RNA hybridization detection of herpes simplex virus sequences in trigeminal ganglia of latently infected mice. Virology. 206 (1), 633-640 (1995).
  19. Chen, X. -. P., Mata, M., Kelley, M., Glorioso, J. C., Fink, D. J. The relationship of herpes simplex virus latency associated transcript expression to genome copy number: a quantitative study using laser capture microdissection. J. Neurovirol. 8 (3), 204-210 (2002).
  20. Proenca, J. T., Coleman, H. M., Connor, V., Winton, D. J., Efstathiou, S. A historical analysis of herpes simplex virus promoter activation in vivo reveals distinct populations of latently infected neurones. J. Gen. Virol. 89, 2965-2974 (2008).
  21. Nicoll, M. P., Proença, J. T., Connor, V., Efstathiou, S. Influence of herpes simplex virus 1 latency-associated transcripts on the establishment and maintenance of latency in the ROSA26R reporter mouse model. J. Virol. 86 (16), 8848-8858 (2012).
  22. Catez, F., Picard, C., et al. HSV-1 Genome Subnuclear Positioning and Associations with Host-Cell PML-NBs and Centromeres Regulate LAT Locus Transcription during Latency in Neurons. PLoS Pathog. 8 (8), (2012).
  23. Solovei, I., Grasser, F., Lanctôt, C. FISH on Histological Sections. CSH Protoc. , (2007).
  24. Labetoulle, M., Kucera, P., et al. Neuronal propagation of HSV1 from the oral mucosa to the eye. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 41 (9), 2600-2606 (2000).
  25. Labetoulle, M., Maillet, S., Efstathiou, S., Dezelee, S., Frau, E., Lafay, F. HSV1 latency sites after inoculation in the lip: assessment of their localization and connections to the eye. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44 (1), 217-225 (2003).
  26. Maillet, S., Naas, T., et al. Herpes simplex virus type 1 latently infected neurons differentially express latency-associated and ICP0 transcripts. J. Virol. 80 (18), 9310-9321 (2006).
  27. Tanaka, M., Kagawa, H., Yamanashi, Y., Sata, T., Kawaguchi, Y. Construction of an excisable bacterial artificial chromosome containing a full-length infectious clone of herpes simplex virus type 1: viruses reconstituted from the clone exhibit wild-type properties in vitro and in vivo. J. Virol. 77 (2), 1382-1391 (2003).
  28. Gierasch, W. W., Zimmerman, D. L., Ward, S. L., Vanheyningen, T. K., Romine, J. D., Leib, D. A. Construction and characterization of bacterial artificial chromosomes containing HSV-1 strains 17 and KOS. J. Virol. Methods. 135 (2), 197-206 (2006).
  29. Nagel, C. -. H., Döhner, K., et al. Nuclear egress and envelopment of herpes simplex virus capsids analyzed with dual-color fluorescence HSV1(17). J. Virol. 82 (6), 3109-3124 (2008).
  30. Arthur, J., Efstathiou, S., Simmons, A. Intranuclear foci containing low abundance herpes simplex virus latency-associated transcripts visualized by non-isotopic in situ hybridization. J. Gen. Virol. 74, 1363-1370 (1993).
  31. Pileri, S. A., Roncador, G., et al. Antigen retrieval techniques in immunohistochemistry: comparison of different methods. J. Pathol. 183, 116-123 (1997).
  32. Saito, N., Konishi, K., Takeda, H., Kato, M., Sugiyama, T., Asaka, M. Antigen retrieval trial for post-embedding immunoelectron microscopy by heating with several unmasking solutions. J. Histochem. Cytochem. 51 (8), 989-994 (2003).
  33. Ishov, A. M., Maul, G. G. The periphery of nuclear domain 10 (ND10) as site of DNA virus deposition. J. Cell Biol. 134 (4), 815-826 (1996).
  34. Sourvinos, G., Everett, R. D. Visualization of parental HSV-1 genomes and replication compartments in association with ND10 in live infected cells. EMBO J. 21 (18), 4989-4997 (2002).
  35. Everett, R. D., Murray, J., Orr, A., Preston, C. M. Herpes simplex virus type 1 genomes are associated with ND10 nuclear substructures in quiescently infected human fibroblasts. J. Virol. 81 (20), 10991-11004 (2007).
  36. Margolis, T. P., Imai, Y., Yang, L., Vallas, V., Krause, P. R. Herpes simplex virus type 2 (HSV-2) establishes latent infection in a different population of ganglionic neurons than HSV-1: role of latency-associated transcripts. J. Virol. 81 (4), 1872-1878 (2007).
  37. Imai, Y., Apakupakul, K., Krause, P. R., Halford, W. P., Margolis, T. P. Investigation of the mechanism by which herpes simplex virus type 1 LAT sequences modulate preferential establishment of latent infection in mouse trigeminal ganglia. J. Virol. 83 (16), 7873-7882 (2009).
  38. Shi, S. -. R., Shi, Y., Taylor, C. R. Antigen retrieval immunohistochemistry: review and future prospects in research and diagnosis over two decades. J. Histochem. Cytochem. 59 (1), 13-32 (2011).
  39. Lu, X., Triezenberg, S. J. Chromatin assembly on herpes simplex virus genomes during lytic infection. Biochim. Biophys. Acta. 1799 (3-4), 217-222 (2010).
  40. Placek, B. J., Berger, S. L. Chromatin dynamics during herpes simplex virus-1 lytic infection. Biochim. Biophys. Acta. 1799 (3-4), 223-227 (2010).
  41. Eshleman, E., Shahzad, A., Cohrs, R. J. Varicella zoster virus latency. Future Virol. 6 (3), 341-355 (2011).
  42. Paulus, C., Nitzsche, A., Nevels, M. Chromatinisation of herpesvirus genomes. Rev. Med. Virol. 20 (1), 34-50 (2010).
  43. Nitzsche, A., Paulus, C., Nevels, M. Temporal dynamics of cytomegalovirus chromatin assembly in productively infected human cells. J. Virol. 82 (22), 11167-11180 (2008).
  44. Zhou, J., Chau, C. M., et al. Cell cycle regulation of chromatin at an origin of DNA replication. EMBO J. 24 (7), 1406-1417 (2005).
  45. Day, L., Chau, C. M., Nebozhyn, M., Rennekamp, A. J., Showe, M., Lieberman, P. M. Chromatin profiling of Epstein-Barr virus latency control region. J. Virol. 81 (12), 6389-6401 (2007).
  46. Arvey, A., Tempera, I., Lieberman, P. M. Interpreting the Epstein-Barr Virus (EBV) Epigenome Using High-Throughput Data. Viruses. 5 (4), 1042-4254 (2013).
  47. Lu, F., Day, L., Gao, S. -. J., Lieberman, P. M. Acetylation of the latency-associated nuclear antigen regulates repression of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus lytic transcription. J. Virol. 80 (11), 5273-5282 (2006).
  48. Günther, T., Grundhoff, A. The epigenetic landscape of latent Kaposi sarcoma-associated herpesvirus genomes. PLoS Pathog. 6 (6), (2010).
  49. Toth, Z., Maglinte, D. T., et al. Epigenetic analysis of KSHV latent and lytic genomes. PLoS Pathog. 6 (7), (2010).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Neuroscience83HSV

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved