מתודולוגיה לדור היעיל של חלבונים נגיפי חיסון מתויגים בפלורסנטיות

Summary

פרוטוקול מהיר ומודולרי ליצירת וירוסי חיסון רקומביננטיים המבטאים חלבונים מתויגים פלואורסצנטיים בו זמנית בשיטת הבחירה הדומיננטית החולפת מתואר כאן.

Abstract

תיוג חלבונים נגיפיים בחלבונים פלואורסצנטיים הוכיח גישה הכרחית לקידום ההבנה שלנו לגבי אינטראקציות בין מארחי וירוסים. וירוס Vaccinia (VACV), החיסון החי המשמש למיגור אבעבועות שחורות, נוח במיוחד למיקרוסקופיה של תאים חיים פלואורסצנטיים בשל גודלו הגדול של הוויריון והקלות שבה ניתן לתכנן אותו ברמת הגנום. אנו מדווחים כאן פרוטוקול אופטימיזציה ליצירת וירוסים רקומביננטיים. הדרישות המינימליות עבור רקומבינציה הומולוגית ממוקדת במהלך שכפול חיסון נקבעו, המאפשר פישוט של יצירת בנייה. זה איפשר את הברית של בחירה דומיננטית חולפת (TDS) עם כתב פלואורסצנטי ובחירה מטבולית כדי לספק גישה מהירה ומודולרית לתיוג פלואורסצנטי חלבונים ויראליים. על ידי ייעול הדור של וירוסים רקומביננטיים פלואורסצנטיים, אנו מסוגלים להקל על יישומים במורד הזרם כגון ניתוח הדמיה מתקדם של היבטים רבים של יחסי הגומלין מארח וירוס המתרחשת במהלך שכפול וירוסים.

Introduction

וירוס Vaccinia (VACV) הוא אב טיפוס אבעבועות רוח הקשורים מאוד וירוס variola, הסוכן הסיבתי של אבעבועות שחורות. שני וירוסים אלה הם חברים בסוג orthopox הכולל פתוגנים בולטים אחרים כגון אבעבועות קוף וירוס אטרומליה (אבעבועות עכבר)¹. Orthopoxviruses יש גנומים גדולים דו גדילי DNA (180-220 kb) כי לקודד כלפי מעלה של 200 מסגרות קריאה פתוחות חזויות^2,3. שכפול של וירוסים אלה כרוך היווצרות של מפעל וירוסים perinuclear, שבו וירוסים בוגרים (MV) נעשים, ואת רשת טרנס גולגי שבו תת קבוצה של MV לרכוש שתי ממברנות נוספות כדי ליצור וירוסים עטופים (WV) (נבדק על ידי רוברטס סמית⁴). הגנום של אורתופוקס נוח מאוד למניפולציה גנטית בשל רמה גבוהה של רקומבינציה גנטית שהיא תכונה של שכפול גנום VACV ומתווכת על ידי פולימראז DNA ויראלי⁵. יצירת וירוסים רקומביננטיים מסתמכת על רקומביניזציה הומולוגית ומולקולות DNA ליניאריות עם הומולוגיות קטנות כמו 12 bp להיות מספיק כדי לתווך רקומביניזציה בתאים נגועים בנגיף vaccinia⁶. תיוג פלואורסצנטי של וירוס חיסון יכול להניב חלקיקי וירוס בהירים מאוד בשל הגודל הגדול של חלקיקי אורתופוקס, המאפשר שילוב של חלבונים פלואורסצנטיים רבים לכל virion⁷. Vaccinia יש את היכולת לשאת שברים גדולים של DNA זר⁸ יתר על כן, חוסר סימטריה קפסיד נוקשה עשוי לאפשר מידה מסוימת של גמישות בעת הבעת היתוך גנים חלבון ויראלי מ loci אנדוגני שלהם⁹. תיוג פלואורסצנטי של חלבוני VACV הוכיח לא יסולא בפז לחקר אינטראקציות מארח-פתוגן ברמה התת-תאית, במיוחד בתחום כניסת^{וירוסים 10}, תחבורה^11-13, ו morphogenesis, במיוחד של virions עטוף⁷.

וירוסים רקומביננטיים ניתן לבחור על ידי הצלה של פנוטיפ צמיחה מוחלש^14,15, בחירה מטבולית^16-18, או על ידי ביטוי של גן סמן (למשל X-gal¹⁹ או חלבון פלואורסצנטי^13,20). כאן אנו מתארים את הבחירה של וירוסים פלואורסצנטיים באמצעות שילוב רב עוצמה של בחירה פלואורסצנטית מטבולית. וקטורים של בחירה דומיננטית חולפת (TDS), שפותחו על ידי פוקנר ומוס (1990)²¹, מאפשרים לשלב סמנים יחד עם הגן הרצוי המתויג בפלורסנט. כאשר הבחירה המטבולית מוסרת, אירוע רקומבינציה משני יכול להתרחש אשר כורת את גני הבחירה, אך משאיר את חלבון הווירוס מתויג פלואורסצנטי ללא פגע. איור 2 להלן מספק סקירה כללית של ההליך הניסיוני. הגנים הנבחרים המשמשים במחקר זה הם mCherry ואת Escherichia coli guanine phosphoribosyltransferase (gpt) גן, שניהם באים לידי ביטוי מקדם ויראלי מוקדם / מאוחר סינתטי בשימוש בעבר על ידי Cordeiro et al. ²² בנוסף, יש פלואורסצנטיות של חלבון היתוך מתויג של עניין. כאשר הבחירה המטבולית מוסרת, הסמנים הניתנים לבחירה (mCherry ו- gpt) נכרתים, ומשאירים רק את הפלואורסצנטיות של הגן המתויג, המאפשר זיהוי של הווירוסים הרקומביננטיים הנכונים. כריתת סמני הבחירה מספקת אפשרות לשלב תגי פלואורסצנט מרובים, ומאפשרת לנו ליצור וירוסים עם היכולת לתייג בפלורסנט מספר חלבונים ויראליים בו זמנית. מחקרים קודמים קבעו את הדרישות המינימליות של הומולוגיה לחיסון מחדש של מולקולות דנ"א ליניאריות ועגולות שהודבקו בתאים נגועים בנגיף חיסון⁶. רצינו לקבוע את יעילות השילוב מחדש של אורכי הומולוגיה משתנים של זרועות אגף בווקטור GPT-mCherry TDS באמצעות שילובו לתוך הגנום הנגיפי vaccinia. נקבע כי אזורים הומולוגיים של 100 bp בווקטור TDS מספיקים כדי למקד ולתווך את החדרת ה- DNA הרקומביננטי לגנום VACV על ידי רקומבינציה הומולוגית (איור 4). בעוד אורכי הומולוגיה קטנים יותר יאפשרו גם שילוב מחדש, אורכי הומולוגיה של 100 bp סיפקו מספיק וירוסים רקומביננטיים שניתן לזהות בקלות עם בחירה מטבולית ופלואורסצנטית. שברי DNA בגודל זה יכולים להיות מסונתזים מסחרית בעלות נמוכה יחסית ומקל מאוד על הייצור של וקטורים מרובים ליצירת וירוסים רקומביננטיים. בחרנו להגדיל את אורך ההומולוגיה ל 150 bp כדי לספק תדירות recombination גדול יותר תוך שמירה על עלויות של סינתזה של רצף oligonucleotide של אזורי איגוף.

Protocol

1. יצירת וקטור רקומביניזציה

1. זהה אזורי אגפים באורך 150 bp של הומולוגיה (המכונים הזרועות השמאלית והימנית) הדרושים לתיוג N- או C-terminally את הגן הוויראלי המעניין (ראה איור 1b).
2. עיצוב רצף oligonucleotide הכולל את 150 bp זרועות שמאל וימינה מופרדים על ידי זוג אתרי הגבלה של בחירה. כל הרצף הזה חייב להיות מוקף גם על ידי זוג שני של אתרי הגבלה (שונה מהזוג הראשון) כדי לאפשר שילוב לתוך וקטור TDS פעם מסונתז. יש לדאוג בעת עיצוב oligonucleotide עם אתרי הגבלה כי הרצפים נמצאים במסגרת עם אתר הכניסה הרצוי.
3. שלבו אתרי הגבלה בין הזרועות השמאלית והימנית בשעת עיצוב האוליגונוקלאוטידים לסינתזה, שחייבים להתאים לאלה שמאגפים את מסגרת הקריאה הפתוחה של התג הפלואורסצנטי המועדף (ראו איור 1b). ניתן להשתמש באתר הגבלת NotI כמקשר שלוש חומצות אמינו בין הזרוע השמאלית לתחילת התג הפלואורסצנטי.
4. שלבו את אותם אתרי הגבלה משני צדי התג הפלואורסצנטי של PCR (ראו איור 1c).
5. שכפל את הקטע המסונתז לווקטור TDS.
6. שכפלו את התג הפלואורסצנטי בווקטור רקומבינצ'יני שנוצר באמצעות אתרי ההגבלה בין אזורי הזרוע השמאלית והימנית של ההומולוגיה (ראו איור 1d).

2. יצירת וירוסים רקומביננטיים

1. לפי איור 2, להדביק monolayer של תאי BS-C-1 עם וירוס חיסון במדיה ללא סרום בריבוי של זיהום (MOI) > 1.
2. 1 שעה לאחר ההדבקה, תאי הצלה עם בינוני הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) ו transfect עם תערובת של פלסמיד וקטור רקומבינציה reagent ו transfection ביחס של 3:1 במדיה ללא סרום.
3. לאחר 24 שעות, לגרד ולשחזר תאים ב- DMEM המכילים ללא סרום שור עוברי (FBS) ולבצע שלושה מחזורי הפשרה בהקפאה כדי לשבור תאים פתוחים ולשחרר חלקיקי וירוסים.
4. בצע בדיקת פלאק עם כיסוי נוזלי של 10% FBS DMEM ו GPT בחירה ריאגנטים חומצה mycophenolic (25 מיקרוגרם / מיליליטר) ו xanthine (250 מיקרוגרם / מיליליטר) כדלקמן:
   1. זרעו צלחת של 6 בארות עם מונולייר של תאי BS-C-1.
   2. להדביק 100% monolayers תאים משולבים עם דילול סדרתי של תאים מופשרים בהקפאה המכילים חלקיקי וירוס כדי להבטיח הפרדה נאותה של לוחות בודדים.
   3. כיסוי עם נוזלי 10% FBS המכיל DMEM המכיל את ריאגנטים הבחירה GPT - חומצה mycophenolic ו xanthine בריכוזים הסופיים של 25 מיקרוגרם / מיליליטר ו 250 מיקרוגרם / מיליליטר בהתאמה.
5. לאחר דגירה של 24 שעות, הסר את כיסוי הנוזל והשתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לחפש לוחות המציגים פלואורסצנטיות אדומה מפוזרת המתאימה לשילוב של mCherry מווקטור TDS לתוך הנגיף. בהתאם לגן היעד ותג הפלואורסצנטי שנבחר, ניתן לראות פלואורסצנטיות מקומית של הגן המתויג גם באותו לוח אדום.
6. בחר לוחות מרובים עבור כל וירוס רקומביננטי על ידי גירוד מקומי עם קצה פיפטה ו 100 μl של 5% FBS המכיל DMEM להעביר תאים צינור Eppendorf, ואחריו שלושה סיבובים של הפשרת הקפאה של תאים מגרדים לשחרר וירוסים רקומביננטיים.
7. הוסף את DMEM המכיל וירוס מופשר בהקפאה לתוך monolayer של תאים בצלחת 12-well כדי להגביר וירוסים רקומביננטיים עם ריאגנטים הבחירה GPT במדיה הצמיחה. לגרד הגברות מוצלחות 24 שעות לאחר ההדבקה.
8. בצעו בדיקת פלאק של לוחות מוגברים בהצלחה המציגים פלואורסצנטיות אדומה, הפעם עם כיסוי agarose ובחירת GPT, כדלקמן:
   1. זרעו צלחת של 6 בארות עם מונולייר של תאי BS-C-1.
   2. בצע דילול סדרתי של וירוסים רקומביננטי להדביק בארות עם דילול הולך וגדל של וירוסים ב DMEM חינם FBS.
   3. 1 שעה לאחר ההדבקה, להסיר את המדיה הנוזלית כיסוי כל באר עם 0.5% agarose במדיום חיוני מינימלי (MEM) המכיל 2.5% FBS, 292 מיקרוגרם / מיליליטר L-גלוטמין, 100 U / ml פניצילין ו 100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין, יחד עם reagents הבחירה GPT.
9. 2-3 ימים לאחר ההדבקה, לבחור לוחות המציגים פלואורסצנטיות כי הוא גם אדום ואת הצבע של תג פלואורסצנטי שנבחר כדי להגביר שוב, הפעם ללא בחירת GPT.
10. בצע את ההסתעפות הבאה של לוחית עם שכבת-על של agarose ללא בחירה.
11. בחר לוחות שאיבדו את הפלואורסצנטיות האדומה המפוזרת שלהם אך שומרים על הפלואורסצנטיות המקומית המתאימה לתג המועדף.
12. המשך טיהור פלאק ללא בחירה כדי לקבל מלאי טהור של וירוסים רקומביננטיים שאיבדו את הגנים בחירת mCherry ו gpt אבל לשמור על פלואורסצנטיות מקומית המתאימה התג שנבחר. בדוק מניות טהורים על ידי פלאק assay, כל לוחות צריך פנוטיפ פלאק דומה.
13. השתמשו בבדיקת PCR של דנ"א גנומי כדי להבטיח שמניות ויראליות טהורות.
    1. עיצוב פריימרים המאגפים את אתר החדרת הגנים הפלואורסצנטיים ואת פריימרים המחזקים את הגן הפלואורסצנטי שהוכנס עצמו. שילובים שונים של פריימרים אלה ייצרו אמפליונים PCR שיזהו החדרת גנים ויצביעו על טוהר.
    2. להגביר מניות ויראליות להיות PCR הוקרן בבאר אחת של 12-well צלחת monolayer של תאי BS-C-1.
    3. 24 שעות לאחר זיהום, לגרד תאים נגועים לתוך 250 μl של DMEM.
    4. תאים נגועים צנטריפוגה (18,000 x g במשך 10 דקות, 4 מעלות צלזיוס), להסיר כדורי תא supernatant ו resuspend ב 500 μl TE (10 mM Tris-HCl ו 1 mM EDTA, pH 8) עם 0.1% (v / v) SDS. וורטקס כדי לתזמן תאים.
    5. הוסף 500 μl פנול-כלורופורם-isoamyl אקוהול, הפוך לערבב. צנטריפוגה (18,000 x גרם במשך 4 דקות, 4 מעלות צלזיוס). קח את העל-טבעי ותחזור.
    6. בצע משקעים אתנול על supernatant על ידי הוספת 1 מיליליטר 100% אתנול (מצונן) ו 50 μl נתרן אצטט, להפוך לערבב.
    7. השאירו ב -20 מעלות צלזיוס לילה או -80 מעלות צלזיוס למשך שעה. צנטריפוגה (18,000 x גרם במשך 30 דקות, 4 מעלות צלזיוס), להסיר את כל הנוזלים ולאפשר DNA מזורז לאוויר יבש. הושלה מחדש ב- 50 μl TE.
    8. השתמש בזה כתבנית להקרנת PCR DNA גנומי.

3. דור של וירוסים רקומביננטים הנושאים יותר מתג אחד

1. מטבע אותו מונוליילר תא עם וירוסים רקומביננטיים פלואורסצנטיים כדי ליצור וירוסים בעלי תווית כפולה או משולשת או שגרה חוזרת מפרוטוקול 1) עם תג שונה.
2. לטהר וירוסים המבוססים על פנוטיפ פלאק או הקרנת PCR של DNA גנומי לבודד וירוס.

תוצאות

איור 1 מפרט את המבנים השונים הנדרשים עבור הליך זה, המסונתזים (איורים 1b ו- 1c) או נוצרים באמצעות שלבי שיבוט (איור 1d). איור 2 מספק חלוקה לרמות של ההליך הניסיוני עם תמונות פלאק פלואורסצנטי מייצגות של VACV רקומביננטי A3-GFP המתואר עבור כל שלב בתהליך הבחירה. באיור 3, מווירוסי חיסון רקומביננטיים המבטאים חלבונים המתויגים בסמני פלואורסצנט המכוונים לחלבונים מבניים נגיפיים A3 ו- F13, שהם חלק מירעין הנגיף הפנימי²³ והמעטפה החיצונית²⁴, בהתאמה, מוצגים. תצפיות של לוחות נגיפיים ותאים נגועים עבור כל אחד מהווירוסים הרקומביננטיים שנוצרו מתוארים. היעילות של רקומבינציה הומולוגית של וקטורים עם הגנום VACV, המכיל נמוך כמו 70 bp אזורים של הומולוגיה אליו, נבדק והתוצאות מתוארות באיור 4. ההצלחה היחסית של זיהוי לוחות ויראליים העשויים משילוב מחדש עם וקטורים המכילים 100 bp homology היה ההיגיון מאחורי בחירה לסנתז 150 bp אורך זרועות שמאל וימינה של הומולוגיה לגן היעד.

איור 1. וקטור רקומבינציה דומיננטי ארעי (TDS). (a)וקטור TDS עם סמני בחירה gpt ו- mCherry. (ב)זרועות שמאל וימין של הומולוגיה מתוכננות עם אתרי הגבלה ספציפיים בין זרועות ההומולוגיה ומאגפים אותה. אתרי הגבלה בין הזרועות השמאלית והימנית ששימשו בשיטה זו היו NotI ו- BamHI, אתר NotI המשמש גם כמקשר בין הגן לתג הפלואורסצנטי. (ג)תגי פלואורסצנט התואמים לשיטה זו מוקף באתרי הגבלה מתאימים. כמה תגים מועסקים הם GFP (חלבון פלואורסצנטי ירוק), RFP (חלבון פלואורסצנטי אדום), Cerulean (שיפור על ECFP, חלבון פלואורסצנטי ציאן, על ידי mutagenesis²⁵מכוונת באתר) ו mini-SOG, חלבון פלואורסצנטי מהונדס מ GFP אשר יוצר מוצר לפתור על ידי EM על תאורה²⁶. (ד)שיבוט צעדים מעורבים בדור של וקטור recombination TDS הסופי. האוליגונוקלאוטידים המסונתזים המכילים את זרועות האגף השמאלי והימני משוכפלים לראשונה לווקטור TDS. זה מספק וקטור רקומביניזציה שלתוכו כל תג של בחירה יכול להיות מועבר פנימה והחוצה על ידי שיבוט לתוך אתרי ההגבלה משולב בין הזרועות השמאלית והימנית. לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.

איור 2. קווי המתאר של ההליך הניסיוני ליצירת וירוס חיסון רקומביננטי. אירועים המתרחשים ברמות הגנטיות והתאיות מתוארים, יחד עם תמונות פלאק מייצגות המתארות את השלבים בעקבות יצירת נגיף חיסון פלואורסצנטי בעל תווית A3-GFP. (A)תאים נגועים בנגיף החיסון הם transfected עם וקטור רקומביניזציה TDS. באיורזה מתוארת רק תוצאה של שילוב מחדש ביד שמאל והדוגמה משתמשת ב- GFP כתג הפלואורסצנטי המועדף. רקומביניזציה ימנית תגרום לשילוב של כל פלסמיד TDS בגנום באופן דומה, אלא שהתג יתמזג לכל גן המטרה בשלב הביניים, כלומר שלב C. Asay פלאק מבוצע על monolayer התא עם תערובת רקומביניזציה נתון לבחירת GPT. (C) לוחות המציגים פלואורסצנטיות אדומה וירוקה, המתאימים לביטוי mCherry ו- GFP בהתאמה, נבחרים ומוגברים. לאחר הסרת הבחירה, יהיה אובדן של פלואורסצנטיות אדומה המתאימה לאובדן הגנים gpt ו- mCherry (D) ולוחות המציגים פלואורסצנטיות ירוקה בלבד נבחרים ומוגברים (E). לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.

איור 3. תוצאות מייצגות של מערכת שילוב מחדש של TDS. תמונות מתארות לוחות שלמים של תאים מדביקים VACV רקומביננטי לאחר 48 שעות (a, c, e; סרגל קנה מידה 100 מיקרומטר), מלווה בתמונה של תא יחיד נגוע בווירוס רקומביננטי המתאים לאחר 8 שעות (b, d, f; סרגל קנה מידה 10 מיקרומטר). גנים המתאימים לחלבונים מקומיים virion נבחרו כדי לדמיין חלקיקי וירוסים. A3 הוא חלבון ליבה של נגיף החיסון(באנגלית:A3) הוא חלבון מעטפה נגיפי. כמו כן מוצג וירוס בעל שתי תיוגים עם שתי תוויות פלואורסצנטיות A3 ו- F13 (e, f). לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.

איור 4. ניתוח כמותי של יעילות רקומבינציה בין וקטורים רקומביננטיים לגנום VACV. BS-C-1 monolayers נדבקו VACV ו transfected 1 שעה לאחר ההדבקה עם שלושה וקטורים רקומבינציה המכילים אזורים של הומולוגיה של או 500 bp, 100 bp, או 70 bp לגנום VACV. כל וקטור הכיל גם את קלטת TDS הכוללת גנים לבחירת gpt ו- mCherry. תאים נמצאו 24 שעות לאחר ההדבקה ו lysed לשחרר את וירוסים רקומביננטי נוצר. מבחני פלאק בוצעו על lysates התא עם מדיה בחירת GPT ולוחות מראה פלואורסצנטיות mCherry נספרו כמו רקומביננטיים מוצלחים. לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.

איור 5. מפה של וקטור GPT-mCherry TDS המציג את אתר השיבוט המרובים. הווקטור תואר בעבר²² והמפה הווקטורית נוצרה בעזרת מפת EZ Plasmid v1.9 מקבוצת מעבדת ג'אנג (SCU). לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.

Discussion

טכניקה זו מתארת פרוטוקול יעיל ומודולרי ליצירת וירוסים רקומביננטיים המבטאים חלבונים ויראליים מתויגים בפלורסנט. השיטה מבטיחה שהשינוי היחיד בגנום הנגיפי הוא הוספת תג או סמן, ולא משאירים מאחור סמני בחירה. אורך הזרוע הקצרה הנדרשת עבור רקומבינציה הומולוגית מאפשר סינתזה ישירה שלה, ביטול מספר סיבובים זמן רב של PCR ושיבוט, בעוד הפלואורסצנטיות של mCherry ובחירת GPT מטבולית משמשים כדי לבודד ביניים רקומבינציה ויראלי. ביניים אלה ניתן לפתור, לאחר הסרת הבחירה, לנגיף עם גן מתויג או בחזרה לסוג ההורים. שיטה דומה המערבת שימוש הן בבחירה פלואורסצנטית והן בבחירה מטבולית תוארה בעבר²⁷ אם כי השיטה המשמשת במחקר זה משתמשת באזורים קצרים מסונתזים של הומולוגיה, ומאפשרת זיהוי של הנגיף הרקומביננטי הרצוי על ידי הדמיה של הפלואורסצנטיות של הגן המתויג של עניין. בחירה משנית זו ישימה רק לתיוג גנים ויראליים בעלי ביטוי גבוה המייצרים פלואורסצנטיות מספקת במהלך בדיקת פלאק. לחלופין, אפשר לדמיין החדרה של קלטת ביטוי מלאה, למשל חלבון פלואורסצנטי תחת מקדם ויראלי חזק. במקרה זה הזרועות השמאלית והימנית יגדירו את נקודת הכניסה ולא את הגן הנגיפי שיש לתייג.

ישנם כמה צעדים מרכזיים שהוכחו כמועילים במהלך ההליך הניסיוני. הכיסוי הנוזלי בשלב 2.3.3 שתואר לעיל הוכיח את עצמו כחיוני לגילוי ובידוד של לוחות פלורסנט אדומים/ירוקים. אנו מאמינים כי השילוב של ריאגנטים לבחירת GPT וכיסוי agarose הרתיע את הצמיחה של וירוסים רקומביננטיים ולכן עבר כיסוי נוזלי עבור הצעד הראשון של הגברת וירוסים לאחר transfection. חשוב גם לבחור לוחות פלואורסצנטיים המציגים פלואורסצנטיות צבע תג מקומי להעשרה וטיהור, כמו מתווכים הנובעים רקומבינציה בזרוע שמאל עלול לגרום פלואורסצנטיות מפוזרת שנצפה לוחות אם הזרוע השמאלית מכילה גם רצף מקדם. הגן סמן mCherry בווקטור TDS עשוי גם להיות מוחלף gfp, למשל, כדי לאפשר שילוב קל ובחירה של mCherry כתג פלואורסצנטי.

טכניקות מסוימות שתוארו לעיל משתנות מעט משיטות מבוססות ליצירת וירוס חיסון רקומביננטי. לדוגמה, MOI של וירוס המשמש ליצירת recombinants הוא בדרך כלל פחות מ 1²⁸, אולם השימוש MOIs גבוה כבר מספיק ליצירת וירוס vaccinia רקומביננטי בשיטה זו. השימוש ריאגנטים הבחירה GPT בדרך כלל דורש קדם שכפול של התאים עם ריאגנטים בחירה¹⁸, אולם הוספת אותם במהלך שלב ההצלה לאחר ההדבקה עדיין סיפק מבחר מספיק של recombinants הרצוי, במיוחד בשל נוכחות של סמן הבחירה פלואורסצנטי גם כן.

כפי שהוזכר קודם לכן, אחת המגבלות של טכניקה זו היא כי שלב בחירת הפלואורסצנטיות המשנית מסתמך על החלבון המתויג של עניין לידי ביטוי מאוד, ברמה המאפשרת גילויו על ידי העין ב- plaque assay. בלי זה, ניתן יהיה לטהר וירוסים שהפגינו רק פלואורסצנטיות mCherry, מתוכם לפחות 50% יכילו את הנגיפים recombinant הרצוי, אשר ניתן לזהות על ידי אסטרטגיות מולקולריות כגון PCR המתואר בשלב 2.12 לעיל. מגבלה נוספת יכולה להיות השבתה של חלבונים מסוימים כתוצאה מהתיוג שלהם. התג הפלואורסצנטי עשוי לעבור מוטציות או להיחתך על ידי הנגיף הרקומביננטי עם חלף לאורך זמן. לכן, מומלץ לטעום באופן קבוע של מניות וירוסים רקומביננטיים על ידי מיקרוסקופיה ו- PCR. לבסוף, ייתכן שיש גבול למספר החלבונים המתויגים בפלורסנט שניתן לשלב בנגיף אחד. היבט אחד של זה הוא היכולת לדמיין את כולם בו זמנית; בהתחשב באופי החופף של ספקטרום הפליטה של תגי פלורסנט זמינים, חשוב לבחור אותם בקפידה כדי להבטיח דימום ספקטרלי מינימלי. בנוסף, שימוש בתגים הקשורים קשר הדוק כגון GFP ו Cerulean פותח את האפשרות של שילוב מחדש בין השניים, בהתאם למיקומם בגנום רקומביננטי.

האופי המודולרי של טכניקה זו מאפשר החלפה פשוטה של תגים פלואורסצנטיים המבוססים על תאימות עם אפשרויות אחרות של כתמים ו/או תגים. על ידי כריתת סמנים ניתנים לבחירה, שיטת TDS מאפשרת הוספה סדרתית של חלבונים פלואורסצנטיים שונים או שילוב של תיוג מבוסס TDS עם מחיקות גנים מבוססות TDS לניתוחים פנוטיפיים²⁹. כדוגמה עבור התועלת של גישה זו, וירוס פלואורסצנטי מתויג כפול כי תוויות ליבות וירוס קרום WV נוצר. מחקרי הדמיה עם וירוס זה יכול לשמש כדי ללמוד תנועה, morphogenesis ועטיפה של וירוס במהלך שכפול וירוס. עדיין לא אופייני vaccinia חלבונים ויראליים עשויים גם להיות מתויגים ונחקרים על ידי טכניקה זו.

וירוס Vaccinia כבר בשימוש נרחב במחקרי הדמיה בשל מאפיינים רבים של הנגיף כי הם נוחים מיקרוסקופיה תאים חיים. תגים פלואורסצנטיים באים לידי ביטוי מהגנום הנגיפי, ומבטלים את הצורך בהעברה, ומאפשרים לנתח בקלות תאים ראשוניים שמקורם בבעלי חיים נגועים או בתאים שאינם ניתנים להעברה. בתחילה, VACVs פלואורסצנטי שימשו למעקב תת-תאי פשוט של תנועת וירוסים³⁰, אך גישות עדכניות יותר הרחיבו את התועלת שלהם לכלול מחקרי FRET³¹, FRAP בחלקיקי וירוס יחיד³², כתבי מקדם³³, הדמיה תוך-וvitלית³⁴, ומחקרים מבניים^35-37. כל הטכניקות האלה יכולות להיות בהישג יד קל יותר ויותר בשילוב עם שיטה זו של יצירת וירוסים פלואורסצנטיים רקומביננטיים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mycophenolic acid	Sigma-Aldrich	M3536-50MG	Dissolve in 0.1 N NaOH
Xanthine	Sigma-Aldrich	X0626-5G	Dissolve in 0.1 N NaoH
FuGENE HD transfection reagent	Promega	E2311
Fluorescence microscope fitted with Chroma filters 31001, 31002	Olympus, Chroma	BX51 (Olympus); 31001, 31002 (Chroma)