ניטור תחרות תוך-מין באוכלוסיית תאים חיידקיים על ידי Cocultivation של זנים שכותרתו פלואורסצנטית

Summary

חיידקים עשויים לצבור מוטציות מזיקות או מועילות במהלך חייהם. באוכלוסייה של תאים אנשים שצברו מוטציות מועילות עשויים במהירות עולים על חבריהם. כאן אנו מציגים הליך פשוט כדי לדמיין תחרות intraspecies באוכלוסיית תאים חיידקיים לאורך זמן באמצעות אנשים בעלי תווית פלואורסצנטית.

Abstract

מיקרואורגניזמים רבים כגון חיידקים מתרבים מהר מאוד והאוכלוסיות עשויות להגיע לצפיפויות תאים גבוהות. שברים קטנים של תאים באוכלוסייה תמיד צברו מוטציות מזיקות או מועילות לתא. אם אפקט הכושר של מוטציה מספק תת-אוכלוסין עם יתרון צמיחה סלקטיבי חזק, האנשים של תת-אוכלוסיות זו עשויים במהירות outcompete ואפילו לחסל לחלוטין את חבריהם המיידיים. לכן, שינויים גנטיים קטנים הצטברות מונחה בחירה של תאים שרכשו מוטציות מועילות עלול להוביל לשינוי מוחלט של הגנוטיפ של אוכלוסיית התא. כאן אנו מציגים הליך כדי לפקח על התפשטות שיבוט מהירה וחיסול של מוטציות מועילות ומזיקות, בהתאמה, באוכלוסיית תאים חיידקיים לאורך זמן על ידי cocultivation של אנשים שכותרתו פלואורסצנטית של חיידק מודל גרם חיובי Bacillus subtilis. השיטה קלה לביצוע וממחישה מאוד כדי להציג תחרות intraspecies בקרב אנשים באוכלוסיית תאים חיידקיים.

Introduction

חיידקי קרקע ניחנים בדרך כלל ברשתות רגולטוריות גמישות ויכולות מטבוליות רחבות. שתי התכונות מאפשרות לתאים להתאים את המסלולים הקטבוליים והאנאבוליים שלהם כדי להתחרות עם חבריהם ומיקרואורגניזמים אחרים עבור החומרים המזינים, הזמינים בנישה אקולוגית נתונה¹. עם זאת, אם החיידקים אינם מסוגלים להסתגל לסביבתם מנגנונים אחרים עשויים להסביר את הישרדותו של מין. ואכן, כמו חיידקים רבים להתרבות מהר ואת האוכלוסיות יכול להגיע צפיפות תאים גבוהה תת-אוכלוסיות אולי צברו באופן ספונטני מוטציות מועילות המספקות לתאים יתרון גדילה סלקטיבי ולכן להגדיל את הכושר שלהם. יתר על כן, נקודות חמות מוטציה ו mutagenesis הסתגלות הנגרמת על ידי מתח יכול להקל על האבולוציה של חיידק לא מזוהה^2,3. לכן, הצטברות של מוטציות וצמיחה תחת בחירה רציפה היא המקור למגוון המיקרוביאלי העצום, אפילו בתוך אותו סוג^4,5. כמו בטבע, עיצוב של גנומים חיידקיים מתרחש גם במעבדה עקב טיפוח מתמשך תחת בחירה. הדבר בא לידי ביטוי בביות של החיידק גראם חיובי B. subtilis, אשר משמש ברחבי העולם במחקר בסיסי ובתעשייה. בשנות ה-40 של ה-40 טופלה סובטיליס בצילומי רנטגן מזיקים לדנ"א ולאחר מכן בטיפוח בתנאי צמיחה מסוימים⁶. המוטציות שהצטברו בחיידקים במהלך הביות שלהם מסבירות את אובדן מאפייני הגדילה הרבים, כלומר זן מעבדת B. subtilis 168 איבד את היכולת ליצור מושבות מורכבות^7,8.

כיום, עבור חיידקי המודל הנחקרים ביותר Escherichia coli ו- B. subtilis, מגוון כלים רבי עוצמה זמינים לתפעל גנטית את הגנום שלהם כדי לענות על שאלות מדעיות ספציפיות. לפעמים חוסר ההשבתה של גן עניין גורם פגם צמיחה חמור, אשר לאחר מכן גלוי בבירור על מדיום צמיחה סטנדרטי⁹. לעומת זאת, לעתים קרובות מתעלמים ממוטציות הגורמות לפגם צמיחה חלש ובכך משפיעות רק במעט על כושר הזן. עם זאת, בשני המקרים דגירה ממושכת והעברת זנים מוטנטים במשך כמה דורות בדרך כלל לגרום הצטברות של מוטנטים מדכאים כי החזירו את הפנוטיפ של זן האב^2,9. האפיון של מוטנטים מדכאים וזיהוי המוטציות שהחזירו את פגם הצמיחה של זן מוטנט האב היא גישה מועילה מאוד המאפשרת הבהרה של תהליכים תאיים חשובים ולעתים קרובות חדשניים^10,11.

אנו מעוניינים בשליטה של הומאוסטזיס גלוטמט ב B. subtilis¹². בדומה ל- E. coli, B. subtilis מגיב להטרדה של הומאוסטזיס גלוטמט (כלומרלחסום השפלה גלוטמט²) על ידי הצטברות של מוטנטים מדכאים. השינויים הגנומיים במוטנטים מדכאים אלה שנרכשו על ידי מוטציה ספונטנית הוכחו כמשקמים במהירות הומאוסטזיס גלוטמט^9,13. לכן, אין זה מפתיע כי הסתגלות של B. subtilis למצב צמיחה ספציפי במהלך ביות של החיידק משתקף סינתזת אנזים ובפעילויות אנזימטיות התפתחו, אשר מעורבים בחילוף החומרים גלוטמט¹². הוצע כי חוסר גלוטמט אקסוגני במדיום הצמיחה במהלך תהליך הביות היה הכוח המניע להופעת קיבעון של גלוטמט מסתורי דהידרוגנאז (GDH) gudB^CR גן בזן המעבדה 168^2,14. השערה זו נתמכת על ידי התצפית שלנו כי הכמות המופחתת של פעילות GDH בזן המעבדה מספקת לחיידקים יתרון גדילה סלקטיבי כאשר גלוטמט אקסוגני הוא נדיר². יתר על כן, טיפוח של זן B. subtilis, סינתזה של GDH GudB, בהיעדר תוצאות גלוטמט אקסוגני הצטברות של מוטנטים מדכאים שהשביתו את הגן gudB ². ברור, הנוכחות של GDH פעיל קטבולי הוא נחות עבור התא כי גלוטמט המיוצר באנדוגניות כי אחרת יכול לשמש אנבוליזם הוא מושפל אמוניום ו 2-oxoglutarate (איור 1). לעומת זאת, כאשר גלוטמט מסופק על ידי המדיום, זן B. subtilis מצויד בפעילות GDH ברמה גבוהה יש יתרון צמיחה סלקטיבית על פני זן כי מסנתז רק GDH פונקציונלי אחד. סביר להניח שפעילות GDH ברמה גבוהה מאפשרת לחיידקים להשתמש בגלוטמט כמקור פחמן שני בנוסף למקורות פחמן אחרים המסופקים על ידי המדיום² (ראו איור 1). לכן, פעילות GDH משפיעה מאוד על כושר של חיידקים, בהתאם לזמינות של גלוטמט אקסוגני.

כאן אנו מציגים שיטה מאוד להמחשה כדי לנטר ולהמחיש תחרות תוך-מינית בין שני זנים של B. subtilis השונים במקום אחד על הכרומוזום (איור 2). שני הזנים סומנו עם הגנים yfp ו- cfp המקודדים את YFP ו- CFP פלואורופורים, ו cocultivated בתנאים תזונתיים שונים. על ידי דגימה לאורך זמן ועל ידי ציפוי דילול מתאים על צלחות אגר הניצולים בכל אחת מהתרבויות ניתן לפקח בקלות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטריאו נפוץ. ההליך המתואר במאמר זה קל לביצוע ומתאים לדמיין את ההתפשטות המהירה של שיבוט וחיסול מוטציות מועילות ומזיקות, בהתאמה, באוכלוסיית תאים לאורך זמן.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. הכנת צלחות אגר, מדיה תרבותית, קריוסטוקים וקדם-תרבויות

1. הכן מדיית צמיחה ריאגנטים נדרשים (ראה טבלה של חומרים ריאגנטים).
2. פס הזנים B. subtilis (למשל. BP40 (rocG⁺ gudB^CR amyE::P_gudB-yfp)ו- BP52 (rocG⁺ gudB⁺ amyE::P_gudB-cfp) המבטאים GDHs פעיל אחד ושתיים, בהתאמה)² שישמשו בניסוי התחרות על לוחות אגר בינוני SP כדי לקבל מושבות בודדות. דגירה הצלחות לילה ב 37 מעלות צלזיוס.
3. קח מושבות בודדות לחסן צינורות תרבות סטריליים המכילים 4 מיליליטר LB נוזלי בינוני. לגדל את החיידקים לילה ב 28 °C (69 °F) ו 220 סל"ד.
4. לגדול תרבויות לילה ב 28 °C (69 °F) כדי למנוע כי התאים lyse או לקעקע.
5. למדוד את הצפיפות האופטית של התרבויות באורך גל של 600 ננומטר (OD₆₀₀₎באמצעות ספקטרופוטומטר סטנדרטי.
6. אם התרבויות הגיעו OD₆₀₀ של 2.0, לערבב 0.75 מ"ל של התרבויות עם 0.75 מיליליטר של פתרון גליצרול סטרילי 50% ב 1.5 מיליליטר צינורות תגובה. OD_{הסופי 600} צריך להיות 1.0 כדי להשיג cryostocks המכיל כ 10⁸ תאים / מיליליטר.
7. לאחסן את הצינורות ב -80 מעלות צלזיוס.
8. הפוך שלוש precultures של כל זן שכותרתו עם cfp ו yfp קידוד גנים פלואורופור. לחסן את precultures (צינורות תרבות סטרילית המכילה 4 מיליליטר LB נוזלי בינוני) עם 1 תאים μl מ -80 מעלות צלזיוס cryostocks. דגירה את התרבויות לילה ב 28 °C (69 °F) ו 220 סל"ד.

2. Cocultivation של חיידקים, איסוף מדגם, ואחסון מדגם

1. מכינים טריים 100 מ"ל C-Glc ו- CE-Glc בינוני מינימלי (ראה טבלה של ריאגנטים וחומרים), ומעבירים 20 מ"ל של כל מדיום לתוך צלושי טלטול סטריליים 100 מ"ל.
2. קח 0.1 מ"ל של precultures שגדלו בן לילה, לדלל אותם עם 0.9 מיליליטר LB בינוני ב 1.5 מיליליטר cuvette, ולקבוע את OD₆₀₀.
3. לניסוי התחרות, לקחת את אלה precultures של זנים שונים שיש להם OD_{דומה 600 בין} 1.0-1.5.
4. כדי להשיג אוכלוסיות תאים מעורבות, לדלל את התאים של precultures כי היה המתאים OD₆₀₀ כדי OD₆₀₀ של 0.05 ב 20 מיליליטר C-Glc ו CE-Glc בינוני מינימלי בתוספת 100 מ"ל לנער בקבוקונים. לניסוי התחרות יש לערבב בין שני הזנים ביחס של 1:1.
5. קח 10 דגימות מיליליטר מן הבקבוקים, להעביר אותם 15 מ"ל צינורות פלסטיק, לקצור את התאים על ידי צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 4,000 x g בצנטריפוגה העליון שולחן סטנדרטי, ולהשליך את supernatant.
6. לשים מחדש את התאים 0.5 מ"ל טרי LB בינוני, ולהעביר את התאים לתקרה סטרילית 1.5 מ"ל תגובה. מוסיפים 0.5 מ"ל של גליצרול סטרילי 50%, מערבבים את ההשעיה על ידי מערבולת קפדנית ומאחסנים את הדגימות במקפיא של -80 מעלות צלזיוס עד להמשך הטיפול.
7. דגירה את התאים שנותרו צלוחי לנער עד 24 שעות ב 37 °C (60 °F) ו 220 סל"ד. שמור את צלושי לנער בחושך כדי למנוע הלבנה תמונה של פלואורופורים.
8. קח דגימות נוספות של 0.1 מיליליטר לאחר 7 שעות ו 24 שעות של צמיחה. למדוד ולשים לב OD₆₀₀ של 1:10 דילול (ב C-Glc או CE-Glc בינוני מינימלי) של הדגימות.
9. קח את הכמות המתאימה של תאים מכל תרבות כדי להפוך cryostocks כי יש OD₆₀₀ של 1.0. לאחסן את הדגימות ב -80 מעלות צלזיוס עד להמשך הטיפול.

3. טיפול מדגמי, ציפוי והדגירה לניתוחים כמותיים

1. לאחר איסוף כל הדגימות, להפשיר את cryostocks, לדלל את התאים בתמיסת מלח 0.9% (ראה טבלה של ריאגנטים וחומרים) עד^10-3.
2. צלחת 0.1 מ"ל של 10^-3 דילול על לוחות אגר בינוני SP ולהפיץ את התאים באמצעות פיפטות זכוכית סטרילית.
3. דגירה הצלחות לילה ב 37 מעלות צלזיוס בחושך עד מושבות יחיד הופיעו.

4. ספירת הניצולים לפי מיקרוסקופיית פלואורסצנטי סטריאו לניתוח כמותי

1. מחלקים את תחתית צלחת האגר בעט שחור בארבעה חלקים לצורך אוריינטציה טובה יותר תוך ספירת הניצולים תחת מיקרוסקופ הפלואורסצנטי של הסטריאו.
2. מניחים את הצלחת במהופך מתחת למיקרוסקופ ומביאים את המושבות לפוקוס באמצעות מקור האור הקר.
3. לאחר שהמושבות נמצאות במוקד, עבור אל ערכת המסנן המתאימה עבור CFP כדי לדמיין את התאים ששרדו של הזן בעל התווית cfp. לספור את הניצולים של זן זה על ידי תיוג המושבות עם עט ולשים לב למספר.
4. הסר את התוויות עם אתנול ולעבור למסנן YFP להגדיר לדמיין את התאים ששרדו של זן yfpשכותרתו. לספור את הניצולים שוב על ידי תיוג המושבות עם עט ולשים לב למספר.

5. טיפול מדגמי ומיקרוסקופיה לניתוחים חצי שוויוניים

1. לנתונים הממחישים, ספוט 10 μl של^10-4 דילול (כ 100 תאים) משלב 3.1 על צלחת אגר SP (ראה איור 3).
2. דגירה הצלחות לילה ב 37 מעלות צלזיוס בחושך עד מושבות יחיד הופיעו.
3. מניחים את צלחת פטרי ללא מכסה מתחת למיקרוסקופ ומביאים את המקום לפוקוס באמצעות מקור האור הקר.
4. צלם תמונות של המקומות להמחשה של דמויות. בחר זמן חשיפה מתאים לצילום התמונות של המושבות עם מקור האור הקר.
5. מבלי להזיז את הלוח, עבור למסנן CFP, התאם את זמן החשיפה וצלם תמונה. בצע את אותו הדבר עם ערכת המסננים של YFP ושמור את התמונות לניתוחים נוספים.

6. ניתוח נתונים

1. השתמש בתוכנות כגון Excel עבור ניתוחי הנתונים הכמותיים. בהתבסס על המושבות שנספרו, לחשב את אחוז המושבות הצהובות והכחולות ביחס למספר שלם של מושבות, אשר מוגדרים 100%.
2. השתמש במספרים המחושבים כדי ליצור דיאגרמת עמודות מוערמות (ראו איור 4 ואיור 5). השתמשו בתוכנית לעיבוד תמונות כמו Adobe Photoshop לבניית תמונות ממוזגות של התמונות שצולמו מהנקודות השונות. לחלופין, התוכנה הזמינה בחופשיות ImageJ, להורדה http://rsbweb.nih.gov/ij/ יכול לשמש לעיבוד תמונה.
3. פתח את התמונות מנקודה אחת שצולמו באמצעות ערכת המסננים CFP והמסנן YFP. מטב את הניגודיות ואת הבהירות כדי להפחית את פלואורסצנטיות הרקע מהמדיה.
4. עבור לאחת התמונות ובחר הכל. העתק את התמונה והדבק אותה בתמונה האחרת.
5. השתמש בפונקציה "השתמטות צבע" כדי למזג את התמונות או לכסות את התמונות הפלואורסצנטיות באמצעות הכרטיסיה ערוצים. תמונות ממוזגות של המושבות מאמצעי תקשורת שונים ונקודות זמן שונות מייצגות את הצמיחה של הזנים השונים בתרבות הנוזלית.

7. טיפים ספציפיים: ניסוי מתג צבע ו Cocultivation של זנים Isogenic שכותרתו עם cfp ו yfp

הביטוי של אחד משני הגנים המקודדים פלואורופור ב B. subtilis עשוי להשפיע על כושר ובכך את קצב הצמיחה של החיידקים. לכן, מומלץ לבצע את הניסויים הבאים על מנת לשלול כי חיסול של זן מתחרה אחד מאוכלוסיית התא במהלך הטיפוח הוא פשוט בשל השפעה שלילית של הפלואורפור:

1. חזור על כל הניסוי ו cocultivate זנים מתויגים הפוך(למשל, הזן הקודם cfpשכותרתו מסומנת כעת עם הגן yfp ולהיפך). למרות ההופכי, התוצאות שהתקבלו צריך להיות דומה התצפית הקודמת כי זן אחד יש יתרון צמיחה סלקטיבית על פני הזן השני.
2. חזור על כל הניסוי ו cocultivate זנים isogenic שכותרתו yfp ו CFP (למשל BP40 (rocG⁺ gudB^CR amyE::P_gudB-yfp)ו BP41(rocG⁺ gudB^CR amyE::P_gudB-cfp)). להעריך את ההשפעה השלילית של אחד משני פלואורופורים על כושר של החיידקים על ידי ביצוע הרכב אוכלוסיית התא לאורך זמן.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

השיטה המתוארת כאן הוחלה בהצלחה כדי לדמיין תחרות תוך-מין באוכלוסיית תאים המורכבת מזני B. subtilis שסומנו בגנים cfp ו- yfp המקודדים את הפלואורופורים CFP ו- YFP, בהתאמה. כפי שמוצג באיור 3, ניתן להשתמש בשיטה כדי לדמיין תחרות תוך-מין באופן הממחיש מאוד. על ידי איתור הדגימות על אזורים ק...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

מספר שיטות פותחו כדי לנתח כושר תחרותי של^{חיידקים 16}. במקרים רבים החיידקים תויגו עם קלטות עמידות לאנטיביוטיקה שונות¹⁷. בדומה לגישה שלנו, תיוג התאים עם קלטות עמידות לאנטיביוטיקה מאפשר הערכה של כושר תחרותי של החיידקים במהלך cocultivation בתנאי גדילה מוגדרים. יתר על כן, שיטה זו יכולה לשמש כ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
(NH4)2SO4	Roth, Germany	3746
Agar	Difco, USA	214010
Ammonium ferric citrate (CAF)	Sigma-Aldrich, Germany	9714
CaCl2	Roth, Germany	5239
Glucose	Applichem, Germany	A3617
Glycerol	Roth, Germany	4043
K2HPO4•3H2O	Roth, Germany	6878
KCl	Applichem, Germany	A3582
KH2PO4	Roth, Germany	3904
KOH	Roth, Germany	6751
MgSO4•7H2O	Roth, Germany	P027
MnCl2	Roth, Germany	T881
MnSO4•4H2O	Merck Millipore, Germany	102786
NaCl	Roth, Germany	9265
Nutrient broth	Roth, Germany	X929
Potassium glutamate	Applichem, Germany	A3712
Tryptone	Roth, Germany	8952
Tryptophan	Applichem, Germany	A3445
Yeast extract	Roth, Germany	2363
1.5 ml Reaction tubes	Sarstedt, Germany	72,690,001
2.0 ml Reaction tubes	Sarstedt, Germany	72,691
15 ml Plastic tubes with screw cap	Sarstedt, Germany	62,554,001
Petri dishes	Sarstedt, Germany	82.1473
1.5 ml Polystyrene cuvettes	Sarstedt, Germany	67,742
15 ml Glass culture tubes	Brand, Germany	7790 22
100 ml Shake flasks with aluminium caps	Brand, Germany	928 24
Sterile 10 ml glass pipettes	Brand, Germany	278 23
Incubator (28 and 37 °C)	New Brunswick	M1282-0012
Standard pipette set (2-20 μl, 10-100 μl, 100-1,000 μl)	Eppendorf, Germany	4910 000.034, 4910 000.042,
Table top centrifuge for 1.5 and 2 ml reaction tubes	Thermo Scientific, Heraeus Fresco 21, Germany	75002425
Table top centrifuge for 15 ml plastic tubes	Heraeus Biofuge Primo R, Germany	75005440
Standard spectrophotometer	Amersham Biosciences Ultrospec 2100 pro, Germany	80-2112-21
Stereofluorescence microscope	Zeiss SteREO Lumar V12, Germany	495008-0009-000
Freezer (-20 and -80 °C)	-	-
Fridge (4 °C)	-	-
Autoclave	Zirbus, LTA 2x3x4, Germany	-
pH meter	pH-meter 766, Calimatic, Knick, Germany	766
Vortex	Vortex 3, IKA, Germany	3340000
Balance	CP2202S, Sartorius, Germany	replaced by
Black pen (permanent marker)	Staedler, Germany	317-9
Powerpoint program	Microsoft, USA	-
Office Excel program	Microsoft, USA	-	Program for data processing
Adobe Photoshop CS5	Adobe, USA	replaced by CS6, download	Computer program for image processing
Computer	PC or Mac	-
ZEN pro 2011 software for the stereofluorescence microscope	Zeiss, Germany	410135 1002 110	AxioCam MRc Rev. Obtained through Zeiss
Specific solution recipes
SP Medium
8 g Nutrient broth
0.25 mg MgSO4•7H2O
1 g KCl
15 g agar for solid SP medium			if required
add 1 L with H2O			autoclave for 20 min at 121 °C
1 ml CaCl2 (0.5 M), sterilized by filtration
1 ml MnCl2 (10 mM), sterilized by filtration
2 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration
LB Medium
10 g Tryptone
5 g Yeast extract
10 g NaCl
15 g agar for solid LB medium			if required
add 1 L with H2O			autoclave for 20 min at 121 °C
C-Glc Minimal Medium
200 ml 5 x C salts
10 ml L-Tryptophan (5 mg/ml), sterilized by filtration
10 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration
10 ml III’ salts
25 ml Glucose (20%)			autoclaved for 20 min at 121 °C
add 1 L with sterile H2O
CE-Glc Minimal Medium
200 ml 5 x C salts
10 ml L-Tryptophan (5 mg/ml), sterilized by filtration
10 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration
10 ml III’ salts
20 ml Glutamate (40%)
25 ml Glucose (20%), autoclaved for 20 min at 121 °C
add 1 L with sterile H2O
5 x C salts
20 g KH2PO4
80 g K2HPO4•3H2O
16.5 g (NH4)2SO4
add 1 L with sterile H2O			autoclave for 20 min at 121 °C
III’ salts
0.232 g MnSO4•4H2O
12.3 g MgSO4•7H2O
add 1 L with sterile H2O, autoclave for 20 min at 121 °C
40% Glutamate solution
200 g L-Glutamic acid
adjust the pH to 7.0 by adding approximately 80 g KOH
add 0.5 L with sterile H2O			autoclave for 20 min at 121 °C
0.9% Saline (NaCl) Solution
add 1 L with sterile H2O			autoclave for 20 min at 121 °C
50% Glycerol solution
295 ml Glycerol (87%)
add 0.5 L with sterile H2O			autoclave for 20 min at 121 °C
Bacteria (All strains are based on the Bacillus subtilis strain 168)
Bacillus subtilis BP40 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-yfp)	Laboratory strain collection
Bacillus subtilis BP41 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-cfp)
Bacillus subtilis BP52 (rocG+ gudB+ amyE::PgudB-cfp)
Bacillus subtilis BP156 (rocG+ gudB+ amyE::PgudB-yfp)