JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

על ידי שילוב של ילידים וcrosslinking immunoprecipitation הכרומטין עם רזולוציה גבוהה ספקטרומטריית מסה, גישת ChroP מאפשרת לנתח את ארכיטקטורת proteomic המורכבת של שינויי היסטון, וריאנטים וחלבונים שאינם histonic synergizing בתחומי הכרומטין תפקודי מובהקים.

Abstract

הכרומטין הוא מורכב nucleoprotein מאוד דינמי עשויים דנ"א וחלבונים השולט בתהליכי ה-DNA תלוי שונים. מבנה הכרומטין ותפקוד באזורים מסוימים מוסדר על ידי ההעשרה המקומית של שינויי היסטון לאחר translational (hPTMs) וגרסאות, מחייב חלבוני הכרומטין, ובכלל זה גורמי שעתוק, ומתילציה בדנ"א. אפיון proteomic של הרכב הכרומטין באזורים פונקציונליים שונים כבר הקשו עד כה על ידי חוסר פרוטוקולים יעילים להעשיר תחומים כגון בטוהר והכמות המתאימים לניתוח מעמיק לאחר מכן על ידי ספקטרומטריית מסה (MS). אנו מתארים כאן אסטרטגיה חדשה תוכננה פרוטאומיקה הכרומטין, בשם ChroP (roteomics P matin chro), לפיה immunoprecipitation הכרומטין preparative משמש כדי לבודד אזורי הכרומטין ברורים שתווים, במונחים של hPTMs, וריאנטים הקשורים שותף חלבונים שאינו histonic, הם נותח על ידי טרשת נפוצה. אנו ממחישים הואמחדש הקמת ChroP להעשרה והניתוח של אזורי heterochromatic תעתיק שקטים, שסומנה על ידי נוכחותו של Tri-מתילציה של ליזין 9 בהיסטון H3. התוצאות שהושגו להדגים את הפוטנציאל של ChroP באפיון יסודיות proteome heterochromatin ולהוכיח את זה כאסטרטגיה אנליטיים רבת עוצמה להבנת אופן שבו גורמי החלבון הייחודיים של הכרומטין אינטראקציה וsynergize להקים תצורות מבניות ותפקודיות מוקד ספציפי.

Introduction

הכרומטין הוא מורכב nucleoprotein דינמי מאוד כי הוא מעורב כתבנית ראשונית לכל התהליכים בתיווך ה-DNA. הנוקלאוזום הוא היחידה הבסיסית החוזרת ונשנית של הכרומטין והוא מורכב מליבת octameric חלבוניים המכילה שתי מולקולות של כל H2A הקנונית היסטון, H2B, H3 ו-H4, שסביבו 147 נ"ב של ה-DNA עטופים 1,2. כל ההיסטונים הליבה בנויים כתחום כדורי ו" זנב "N-מסוף גמיש שבולט מחוץ להנוקלאוזום. אחד המנגנונים העיקריים להסדרת מבנה הכרומטין ודינמיקה מבוסס על שינויים קוולנטיים לאחר translational (PTMs), שבעיקר להתרחש על N-Termini של ההיסטונים 3,4. שינויי היסטון יכולים לתפקד גם על ידי שינוי מבנה הכרומטין סדר גבוה יותר, על ידי שינוי קשרים בין ההיסטונים-DNA או בין nucleosomes, ובכך שליטה על הנגישות של חלבוני ה-DNA מחייבת (מנגנוני cis), או על ידי מתנהג כמו dockinאתרים גרם לחלבונים רגולטוריים, או כיחידות בודדות, או משובץ במתחמי Multimeric. חלבוני ויסות כזה יכול להפעיל את תפקידם בדרכים שונות: על ידי ויסות ישירות ביטוי גנים (כלומר חלבוני TAF), או על ידי שינוי מיקום הנוקלאוזום (כלומר הכרומטין שיפוץ מכלולים) או על ידי שינוי שאריות אחרות היסטון (כלומר חלבונים עם מתיל-transferase או אצטיל פעילות transferase) (מנגנוני טרנס) 5. התצפית כי אשכול דפוסים ברור PTM בלוקוסי הכרומטין ספציפיים הוביל לפירוט של את ההשערה כי שינויים שונים באתרים שונים עשויים synergize ליצור קוד מולקולרי המתווך את המצב התפקודי של ה-DNA הבסיסי. "ההשערה של קוד היסטון" צברה קונסנסוס גדול בשנים, אבל אימות ניסיוני שלה כבר התאפקה על ידי מגבלות טכניות 6,7.

פרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסה (MS) התפתחהכלי רב עוצמה למפה דפוסי שינוי היסטון ולאפיין מחייב חלבוני הכרומטין 8. MS מזהה שינוי כΔmass ספציפי בין המסה הניסיונית ותיאורטית של פפטיד. ברמה של ההיסטונים בודדים, MS מספק שיטה משוחדת ומקיפה למפה PTMs, המאפשר זיהוי של שינויים חדשים וinterplays החושפני ביניהם 9-14.

בשנים האחרונות, מספר האסטרטגיות פותחו כדי לנתח את הרכב proteomic של הכרומטין, כולל האפיון של כרומוזומים שלמים המיטוטי 15, זיהוי של חלבוני קושרי hPTM המסיסים 16-18 והבידוד והניתוח של אזורי הכרומטין הספציפיים (כלומר הטלומרים) 19,20. עם זאת, החקירה של סינרגיות המוקד ספציפי בין PTMs היסטון, גרסאות, והחלבונים הקשורים הכרומטין היא עדיין לא הושלמה. כאן, אנו מתארים גישה חדשה, בשם ChroP (roteomics chro P matin) 21, שפיתחנו כדי לאפיין ביעילות תחומים הכרומטין תפקודי מובהקים. גישה זו מתאים את עצמו immunoprecipitation הכרומטין (שבב), פרוטוקול מבוסס היטב בשימוש במחקר אפיגנטיים, לניתוח proteomic מבוסס MS יעיל של המדגם המועשר. פיתחנו שני פרוטוקולים שונים, בהתאם לסוג של הכרומטין משמש כקלט והשאלה מופנה על ידי MS; בפרט: 1) שבב של הכרומטין ילידים מבולבל מתעכל עם MNase מועסק לטהר מונו nucleosomes ולנתח את hPTMs שיתוף שיוך (N-ChroP); 2) שבב של הכרומטין crosslinked מקוטע על ידי sonication משמש בשילוב עם אסטרטגית interactomics מבוסס SILAC לאפיין כל הכרומטין שיתוף ההעשרה מחייב חלבונים (X-ChroP). אנו מדגימים כאן שילוב של N-ו-X-ChroP להעשרת ולימוד heterochromatin, באמצעות H3K9me3 כפיתיון לצעדי immunoprecipitation. השימוש בChroP יכול להתארךללמוד או אזורים שונים על הכרומטין, או שינויים בהרכב הכרומטין בתוך האזור אותו במהלך המעבר למצב תפקודי שונה, ובכך סלל את הדרך ליישומים שונים באפיגנטיקה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. תא תרבות

  1. מדיום סטנדרטי לשבב ילידים
    1. לגדל תאי הלה במדיום שונה Dulbecco של הנשר (DMEM) בתוספת 10% שור סרום עוברי (FBS), 1% גלוטמין, 1% פן / סטרפטוקוקוס ו10 HEPES מ"מ pH 7.5.
  2. תיוג SILAC לcrosslinking שבב
    1. לגדל תאי הלה במדיום SILAC DMEM, המדולדל של ליזין וארגינין, בתוספת 10% FBS dialyzed, 1% גלוטמין, 1% פן / סטרפטוקוקוס, 10 HEPES מ"מ pH 7.5 וגם L-ליזין האור (ליס 0) ו-L- ארגינין (ARG 0) או עמיתיהם הכבדים, L-ליזין (Lys 8) ו-L-ארגינין (ARG 10) (לוח חומרים), בריכוזים הסופיים של 73 מ"ג / ליטר ו42 מ"ג / ליטר, בהתאמה.
    2. לגדל תאים לתקופה של עד שמונה דורות במדיום SILAC כדי להבטיח שילוב חומצות אמינו המסומן באיזוטופ מלאה. עובר תאים כל יומיים, כאשר הם מגיעים לצפיפות של 1.0-1.5 x 10 6 תאים / מיליליטר, זריעתם בaconcentration של 3 x 10 5 תאים / מיליליטר.
    3. להעריך את צמיחת תאים ואת הכדאיות במדיום SILAC לאינדיבידואציה כל שינוי אפשרי מפיזיולוגיה שעלולה לנבוע מההרכב העני יותר של מדיום SILAC; כדי לעשות זאת:
      1. ראייה לבדוק תאי המורפולוגיה במיקרוסקופ כל יום במהלך התיוג.
      2. ספירת תאים ועקומות גדילת עלילה של תאים גדל בSILAC לעומת בינוני סטנדרטי.

2. Native הכרומטין immunoprecipitation (N-שבב)

  1. הכנת גרעינים מהתאים בתרבית
    1. השתמש 1-2 x 10 8 תאי HeLaS3 ללא תווית לכל ניסוי. קציר תאים, להפוך aliquot של 50 x 10 6 תאים ב50 צינורות מיליליטר ו צנטריפוגות ב XG 340 10 דקות ב 4 ° C, לשטוף אותם עם PBS קר כקרח.
    2. Resuspend כל תא גלולה ב 8 מיליליטר תמוגה חוצץ (טבלת 1) ו דגירה של 10 דקות ב 4 ° C על גלגל מסתובב. יוצקים carefully כל lysate סלולארי על כרית סוכרוז (טבלת 1) ו צנטריפוגות ברוטור את נדנדה, ב3,270 XG במשך 20 דקות ב 4 ° C, כדי להפריד בין גרעינים מציטופלסמה.
    3. בטל supernatants, לשמור על כדורים גרעיניים ולשטוף אותם פעמים PBS קר כקרח על ידי צנטריפוגה, להשליך supernatant בכל שטיפה.
  2. Micrococcal Nuclease עיכול (MNase) (בקנה מידה קטנה) ובקרת איכות של הכרומטין לאחר עיכול
    1. Resuspend את הכדור הגרעיני שטף ב1 מיליליטר עיכול חוצץ (טבלת 1); לחלק בשני aliquots של 500 μl ולשמור על קרח.
    2. מדוד את הצפיפות אופטית (OD) ב 260 ננומטר של aliquot, מדולל 1:200 ב0.2% סולפט dodecyl נתרן (SDS) הערה:. OD = 1 מתאים לכ -50 מיקרוגרם / מיליליטר של DNA הכרומטין. בדרך כלל, החל מ 2 x 10 8 תאים, OD הוא בטווח של 40-60.
    3. קח 1% מגרעינים, להוסיף אנזים MNase לריכוז סופי של 0.005 U של אנזים / μl של גרעינים ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך נסיגות זמן שונות (0, 10, 20, 40, 60 דקות).
    4. בכל נקודת זמן, לאסוף 4 μl של גרעינים מתעכלים ולהוסיף 1 mM EDTA כדי לעצור את תגובת MNase. שמור על קרח.
    5. לחלץ דגימות DNA על ידי ערכת טיהור PCR וelute ב50 μl TE חוצץ (טבלת 1).
    6. קח 20 μl של כל דגימת DNA, להוסיף 10 μl טוען חוצץ (טבלת 1) ולטעון את הדגימות על 1% (w / v) agarose ג'ל המכיל Ethidium ברומיד, עם סמן ה-PCR כביקורת גודל.
    7. בדוק את עיכול הערכת סולם הנוקלאוזום הכרומטין המיוצר על ידי הדגירה MNase.
    8. בחר את הזמן האופטימלי לעיכול, המבוסס על השכיחות של מוני nucleosomes בהכנה. . בדרך כלל ל0.005 U של האנזים / μl של גרעיני הזמן האופטימלי של מערכת העיכול MNase הוא 60 דקות (איור 1 ב פנל, עזב) הערה: MNase האופטימלי הריכוז / השעה של digestiעל עשוי להיות מותאם בהתאם לסוג התא הרצוי ועל הגודל של nucleosomes מתיחה.
  3. עיכול Large-scale/preparative MNase והחלמה של שברים הכרומטין מסיסים
    1. הוסף לכל aliquot (ראה 2.2.1) 5 MNase μl, המקביל לריכוז סופי של 0.005 U של האנזים / μl של גרעינים; מערבב בעדינות ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות (או באופן כללי למרווח הזמן האופטימלי, המבוססים על הניסוי בקנה המידה הקטנה).
    2. הוסף 1 mM EDTA כדי לעצור את התגובה ולשמור על קרח. גלולה הגרעינים מתעכלים על ידי צנטריפוגה ב7,800 XG ב C ° 4 ל10 דקות. העבר supernatants (S1 שבריר) בצינור חדש ולאחסן בהערת 4 ° C.: S1 מכיל את החלק הראשון מסיס של הכרומטין, הכולל מונו nucleosomes. הוסף את מעכבי פרוטאז (טבלת 1).
    3. כדורי resuspend בזהירות ב1 מיליליטר דיאליזה חוצץ (טבלת 1) וdialyze לילה בשעה 4 ° C (גut הנחה של צינור הדיאליזה הוא 3.5 KDA), ב3 L דיאליזה הצפת, עם ערבוב קל מתמיד. לאסוף חומר וצנטריפוגות dialyzed ב7,800 XG 10 דקות ב 4 ° C. מעביר את supernatant (חלק S2) בצינור Eppendorf חדש ולאחסן ב 4 ° C. הערה: S2 כולל di-לEPTA-nucleosomes, בהתאם לעיכול מידת MNase.
  4. בקרת איכות של הכרומטין לפני immunoprecipitation
    1. קח aliquot המקביל ל 5 מיקרוגרם של שברים הכרומטין S1 ו S2 (לכמת על ידי מדידת OD ב 260 ננומטר במערכת NanoDrop). תמצית ה-DNA על ידי ערכת טיהור PCR וelute ב50 μl TE חוצץ (טבלת 1).
    2. קח 20 μl של S1 ו S2-DNA, לערבב עם 10 μl טוען חוצץ (טבלת 1) ולטעון אותם על 1% (w / v) agarose ג'ל. בדוק את האיכות ויעילות של MNase עיכול על ידי בדיקה ויזואלית של סולם nucleosomes הערה:. חלק S1 הוא מאודמועשר במונה nucleosomes, תוך שבריר S2 מכיל בעיקר פולי nucleosomes (איור 1, פנל מימין).
  5. דגירה של הכרומטין עם נוגדן
    1. חנות ב C ° -20 50 μl של שבריר S1 לניתוח ספקטרומטריית מסה שלאחר מכן.
    2. הוסף 1 נפח של שבב דילול חוצץ (טבלת 1) לS1 שבריר.
    3. מוסיף את הנוגדנים נגד hPTM (או חלבון) של עניין; דגירה הלילה על גלגל מסתובב ב 4 ° C. הערה: בדרך כלל, השתמש 10 מיקרוגרם ל20 מיקרוגרם של נוגדנים ל2 x 10 8 תאים. היחס האופטימלי בין כמות הנוגדנים ומספר תאים שמתחיל יש להגדיר בזהירות כל מקרה לגוף, בהתאם לשפע של hPTM / החלבון המשמש כפיתיון בתוך המדגם ועל יעילות הנוגדן. אופטימיזציה היא ניסיונית, המבוסס על הבדיקות הבאות:
      1. השווה את כמות hPTM / החלבון של עניין בין הקלט וזרימת הדרך (FT,ראה 2.7.2) על ידי כתם המערבי או MS כדי לוודא שimmunoprecipitation מעשירה חלק משמעותי מאזור הכרומטין הספציפי הערה:. זה בדרך כלל מושגת כאשר לפחות 50% מפיתיון hPTM / החלבון יגמר בFT (איור 1 ג) .
      2. בדוק שחלבון immunoprecipitated של עניין הוא לגילוי על ג'ל SDS-PAGE, אשר מבטיח כי כמות מספקת של חומר זמינה לניתוח MS הערה:. הנוכחות על הג'ל של הלהקות המתאימות לארבעה ההיסטונים הליבה בstoichiometry הנכון מצביע על כך שהנוקלאוזום שלם כבר immunoprecipitated ידי N-ChroP (1D איור). חוסר stoichiometry הנכון הוא למעשה מעיד על שיבוש חלקי / התגלגלות של הנוקלאוזום.
    4. במקביל, להכין את חרוזים המגנטיים מצמידים חלבון G (ראה 2.6).
  6. איזון וחסימה של חרוזים מגנטיים בשילוב חלבון G
    1. לאזן של חלבון 100 μl חרוזים מגנטיים בשילוב-G בלועים בחסימת פתרון (טבלת 1), הערה שטיפת שלוש פעמים ודוגרות אותם לילה בשעה 4 ° C על גלגל מסתובב:. בעקבות יכולת הקשירה של חרוזים, שימוש בתרחיף 100 μl עבור 2-20 מיקרוגרם של נוגדנים.
    2. שטוף את החרוזים נחסמו פעם אחת עם פתרון חסימה ולאחר מכן פעמיים עם שבב דילול חוצץ (טבלת 1).
  7. בידוד של הכרומטין באמצעות חרוזים מגנטיים
    1. הוספה של חרוזים חסמו 100 μl למדגם הכרומטין S1 ו דגירה אותם על גלגל מסתובב ב-C ° 4 ל -3 שעות. צנטריפוגה ב XG 340 דקות 1 לספין למטה המדגם מהמכסה של הטיפים. שים במעמד מגנטי כדי גלולה את החרוזים.
    2. מעביר את supernatant לצינור חדש Eppendorf. זוהי הזרימה דרך (FT), כלומר את החלק היחסי של הכרומטין שלא להיקשר לנוגדנים.
    3. שטוף את החרוזים ארבעהפעמים בכביסה חוצץ (טבלת 1) הגדלת ריכוז המלח בכל שטיפה (75, 125 ו175 מ"מ NaCl).
    4. לelute הכרומטין immunoprecipitated, דגירה חרוזים ב30 μl של מדגם LDS הצפת, בתוספת dithiothreitol מ"מ 50 (DTT) במשך 5 דקות ב70 ° C. הפרד את חלבוני eluted על 4-12% ג'ל שיפוע Bis-טריס acrylamide-SDS טרומי וכתם ג'ל עם ערכת קולואיד Coomassie מכתים (1D איור).

3. Crosslinking הכרומטין immunoprecipitation (X-שבב)

  1. Crosslinking של תאים עם פורמלדהיד
    1. הוסף פורמלדהיד 0.75% לתאים שכותרתו SILAC, לערבב בקצרה ודגירה של 10 דקות בטמפרטורת חדר. להרוות פורמלדהיד ידי הוספת 125 גליצין מ"מ ודגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר.
    2. לחלק תאים ב5 x 10 7 aliquots; לשטוף אותם שלוש פעמים עם PBS קר כקרח על ידי צנטריפוגה ב430XG במשך 5 דקות ב 4 ° C ו השלכת supernatants לאחר כל שטיפה. בשטיפה האחרונה, להשליך supernatant ולשמור את הכדור. הערה: ברגע שהתאים crosslinked, הם יכולים להיות מאוחסנים ב -80 מעלות צלזיוס, אם לא נעשה שימוש באופן מיידי.
  2. הכנת גרעינים
    1. Resuspend כל גלולה תא ב10 מיליליטר תמוגה חוצץ (טבלת 1). דגירה של 10 דקות ב 4 ° C עם רוטציה. צנטריפוגה ב430 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C. מחק את supernatants; לשמור על כדורים גרעיניים.
    2. Resuspend כל גלולה גרעינית ב10 מיליליטר כביסה חוצץ (טבלת 1). דגירה בטמפרטורת חדר למשך 10 דקות על גלגל מסתובב.
    3. צנטריפוגה ב430 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C. מחק את supernatants ולאסוף את כדורים.
    4. Resuspend כל כדורים גרעיניים ב3 מיליליטר שבב דגירה חוצץ (טבלת 1). שמור על קרח.
  3. sonication הכרומטין ובקרת איכות
    1. Sonicate ch. Romatin ב200 W (מחזורים של 30 שניות "על" ו 1 דקות "כבוי"), בBioruptor התקרר, לפצל הכרומטין הערה: מספר המחזורים ומרווחי sonication תלוי בסוג התא ועל האורך הממוצע של nucleosomal למתוח רצוי. בדרך כלל, 30 דקות של sonication נחוצות כדי ליצור שברי DNA של 300-500 נ"ב באורכים, המקביל ל-di ותלת nucleosomes. הבחירה של גודל שברים תלוי בסוג של תחום הכרומטין תחת חקירה.
    2. קח 2% מתשומות בסך הכל, להפוך את crosslinking על ידי דגירה על 65 מעלות צלזיוס למשך התקופה מינימאלית של 1 שעות בשבב הדגירה הצפת. חלץ את ה-DNA על ידי ערכת טיהור PCR, elute ב50 μl TE הצפת ולטעון את ה-DNA על ג'ל agarose כדי לבדוק את פיצול הכרומטין.
  4. דגירה של הכרומטין עם נוגדן
    1. הוספה של 10% טריטון X-100 1/10 נפח הכרומטין sonicated. צנטריפוגה ב XG 12,000 עבור 10 דקות ב 4 ° C עד גלולה דהברית מילה.
    2. לחסוך 50 μl של קלט הכרומטין מהתאים כבדים לבדיקת רמת שילוב של חומצות אמינו SILAC בתאי שכותרתו ולאפיון חלבון.
    3. מוסיף את הנוגדן של בחירת שכותרתו הכרומטין הכבד וקל שנותר sonicated ודגירת הלילה בשעה 4 ° C על הגלגל מסתובב. בערוץ האור, תוסיף גם קיפול עודף של פפטיד המסיסים. דגירה הלילה ב 4 ° C על גלגל מסתובב הערות:. המצב האופטימלי בין מיקרוגרם של נוגדנים ואת החומר המוצא של תאים נבחר מקרה לגופו, כפי שפורט ב2.5.3. Molarity הקיפול העודף האופטימלי של הפפטיד המסיסים בביחס לנוגדנים חייב להיות טיטרציה בזהירות כל מקרה לגוף.
  5. בידוד של הכרומטין באמצעות חרוזים מגנטיים
    1. לאזן ולחסום חרוזים מגנטיים מצמידים חלבון G על ידי ביצוע השלבים המתוארים ב2.6 ובאמצעות שבב דגירה הצפת.
    2. הוספה של b החסומה 100 μlEADS לדגימות הכרומטין ולדגור על גלגל מסתובב במשך 3 שעות ב 4 ° C. צנטריפוגה ב XG 340 דקות 1 לספין למטה המדגם מהמכסה של הטיפים. שים במעמד מגנטי כדי גלולה את החרוזים. Supernatant הוא הזרימה דרך (FT), המכיל nucleosomes מאוגד. לשטוף חרוזי ארבע פעמים בכביסה חוצץ (טבלת 1) עם ריכוז מלח הגדלת (שני שוטף ב150 מ"מ ושני ב300 מ"מ NaCl).
    3. דגירה חרוזים ב30 דוגמא טוען SDS-PAGE μl חוצץ (טבלה 1) ועבור 25 דקות ב 95 מעלות צלזיוס לשני elute וחלבוני immunoprecipitated דה Crosslink. חלבונים נפרדים על 4-12% ג'לי טרומי-SDS Bis-טריס acrylamide (איור 3D).

4. לדוגמא הכנה לפני MS

  1. ב- ג'ל עיכול של ההיסטונים מועשרים מN-שבב
    הערה: במהלך פעולות עיכול חלבון ומיצוי פפטיד דואגותכדי למזער את זיהומי קרטין שמפריעים LC-MS/MS, כפי שתואר 22, 23 בעבר.
    1. פרוסות ג'ל Cut המתאימות ללהקות ההיסטונים ליבה (1D איור). De-להכתים את חתיכות ג'ל עם אצטוניטריל 50% (ACN) בDDH 2 O, לסירוגין עם 100% ACN לכווץ את הג'ל. חזור על פעולה עד חתיכות ג'לי לחלוטין דה מוכתמים ולייבש אותם בצנטריפוגה בואקום.
    2. הוספת D 6-אצטית אנהידריד 1:09 (V / V) באמוניום ביקרבונט 1 M (NH 4 HCO 3) (בדרך כלל הנפח הסופי הוא 60-100 μl) ו3 נתרן אצטט μl (CH 3 COONa), כזרז. דגירה במשך 3 שעות על 37 מעלות צלזיוס עם רעד חזק הערה:. המדגם עלול ליצור בועות בדקות הראשונות לאחר ההרכבה של התגובה: זה חשוב לטפל בזהירות ולשחרר את הגז שנוצר, פתיחה מהעת לעת את הצינורות במהלך דגירה.
    3. יש לשטוף את חתיכות ג'ל מספר פעמים wNH-i 4 HCO 3, חלופי עם ACN באחוז הולך וגדל (מ -50% ל 100%), במטרה לחסל את השאריות של אנהידריד 6 אצטית D לחלוטין.
    4. לכווץ את חתיכות ג'ל בACN 100%; לייבש אותם בצנטריפוגה בואקום כדי להבטיח דה הידרציה מלאה. חתיכות ג'ל מימה מחדש עם קר כקרח 100 ng / μl פתרון טריפסין ב50mm 4 NH HCO 3 ו דגירה הלילה בשעה 37 ° C. הערה: השילוב של שינוי הכימי של lysines באמצעות אנהידריד אצטית deuterated ועיכול טריפסין יוצר "Arg- C כמו "בדפוס עיכול ג'ל של ההיסטונים 21,24.
    5. מחק את הפתרון העודף ולהוסיף נפח 50 מ"מ NH 4 HCO 3 כדי לכסות את חתיכות ג'ל לחלוטין; דגירה הלילה בשעה 37 ° C.
    6. לאסוף פפטידים מתעכלים מסיסים בצינור Eppendorf חדש. Lyophilize פפטידים. Resuspend אותם ב0.5%% acid/0.1 חומצה אצטית trifluoracetic (TFA). Desalt ולהתרכזפפטידים בשלב התהפך "כריך" C 18 / פחמן וכרומטוגרפיה חילופי יונים (SCX) על microcolumns בעבודת יד (StageTip) 25.
    7. הכן את microcolumns StageTip ידי לשים דיסקי meshwork טפלון המכילים C המשותק 18 / פחמן ("סנדוויץ'") וחרוזים SCX ב200 טיפים μl. השג את "הכריך" על ידי טעינת microcolumn 18 C על גבי קצה שני נטען עם מסנן פחמן הערה:. פפטידים קצרים מאוד, שאינם נשמרים במסנן 18 C, עובר בזרימה דרך שנטען ישירות על פחמן עצה, אשר בדרך כלל לוכדת אותם. StageTips SCX יכול להעשיר פפטידים ספציפיים, כגון H3 פפטיד (3-8), לא נשמר ביעילות על ידי כרומטוגרפיה שלב מהופך.
    8. טען 50% מפפטידים על "StageTip הכריך" 18 C / פחמן ו50% על StageTips SCX. Elute מהם טיפים 18 C / פחמן באמצעות 80%% ACN/0.5 ac אצטיתid ומטיפי SCX עם 5% אמוניום הידרוקסיד (NH 4 OH) מתנול / 30%. לאחר פפטידים lyophilization, resuspend ב 0.1% FA ולנתח על ידי LC-MS/MS.
  2. עיכול בג'ל של חלבוני immunopurified
    עיכול בג'ל של חלבונים מתבצע כ22 שתוארו קודם לכן, עם שינויים קלים.
    1. חותכים כל מסלול בעשר פרוסות (איור 3D) וכל פרוסה בקוביות קטנות של 1 מ"מ 3. De-להכתים את חתיכות ג'ל עם 50 אתנול 4 HCO 3/50% מ"מ NH ולהוסיף אתנול מוחלט לכווץ את ג'לי. חזור על פעולה עד ג'לי לחלוטין דה צבעונית.
    2. הוסף חוצץ הפחתה (לוח 1) לחתיכות ג'ל לשעה 1 ב56 מעלות צלזיוס, ואחריו התוספת של חיץ אלקילציה (טבלה 1) ל45 דקות בטמפרטורת חדר, בחושך. לשטוף ולייבש את חלקי ג'ל בצנטריפוגות ואקום.
    3. רעננותם חתיכות ג'ל עם ng 12.5 קר כקרח / סול טריפסין μlution ב50 מ"מ NH 4 HCO 3 ולדגור על קרח עד להחזרת נוזלים של חתיכות ג'ל מלאים. הסר טריפסין עודף.
    4. הוסף 50 מ"מ NH 4 HCO 3 כדי לכסות את חתיכות ג'ל לחלוטין. דגירה הלילה בשעה 37 ° C.
    5. אסוף את החלק הנוזלי. הוסף את חיץ החילוץ (טבלת 1) לחתיכות ג'ל; דגירה עם תסיסה חזקה ל10 דקות בטמפרטורת חדר. חזור על פעולה פעמיים.
    6. דגירה חתיכות ג'ל בACN עבור 10 דקות עם תסיסה חזקה. חזור על פעולה פעמיים וברכה כל supernatants.
    7. Lyophilize פפטידים. Resuspend פפטידים מיובשים ב0.5%% acid/0.1 אצטית TFA.
    8. Desalt ולהתרכז פפטידים על שלב התהפך C 18 StageTip, כפי שתואר 26, 27.
    9. Elute פפטידים מStageTip 18 C באמצעות 80%% ACN/0.5 חומצה אצטית. הסר את הממס האורגני ידי מתאדה בצנטריפוגה ואקום וresuspend פפטידים ב0.1% FA (בדרך כלל 5-10 &181 #; ליטר), כאשר מוכן לניתוח הטרשת הנפוצה.

5. LC-MS ניתוח

  1. ניתוח כרומטוגרפיה נוזלי
    1. לארוז עמודת האנליטיות ב15 סנטימטר פולט סיליקה התמזגו (75 מיקרומטר קוטר פנימי, 350 מיקרומטר קוטר חיצוני), תוך שימוש הפוך שלב (RP) C 18, 3 שרף מיקרומטר במתנול, בלחץ מתמיד הליום (50 בר) באמצעות מכשיר פצצה-מטעין, כפי שתואר לעיל 28.
    2. כמה הפולט ארוז (עמודת RP 18 C) ישירות ליציאה של שסתום 6 נמל HPLC באמצעות (25 מיקרומטר קוטר פנימי) ארוך 20 סנטימטר התמזגו סיליקה ללא שימוש לפני עמודה או מכשיר מפוצל.
    3. טען את פפטידים מתעכלים בC 18 עמודת RP בזרימת 500 NL / min שלב נייד (0.1% 5% ACN FA / DDH 2 O).
    4. לאחר טעינת מדגם, להפריד את פפטידים באמצעות מילויים הבאים:
      1. החל 0-40% שלב נייד B (0.1% ACN% FA/99DDH 2 O) בשעה 250 / דקות NL מעל 90 דקות ואחריו שיפוע של 40-60% ב 10 דקות ו60-80% מעל 5 דקות, עבור elution של פפטידים הנובעים מההיסטונים (ראו 2).
      2. החל 0-36% שלב נייד B ב 250 מעל 120 דקות NL / דקות ואחריו שיפוע של 36-60% ב 10 דקות ו60-80% מעל 5 דקות, עבור elution של פפטידים הנובעים מחלבונים immunopurified (ראה 3).
  2. ניתוח ספקטרומטריית המסה באמצעות LTQ-FT-ICR-Ultra ספקטרומטר המסה
    1. לפעול ברכישת נתונים תלויים מצב (DDA) כדי לעבור באופן אוטומטי בין MS ורכישת MSMS. ספקטרום סריקה מלא MS נרכש, בדרך כלל בטווח מ '/ z מ200-1,650, היא נרכשה עם R ברזולוציה = 100,000 ב 400 מ' / z. חמישה היונים אינטנסיביים ביותר (Top5) מבודדים לפיצול במלכודת היונים ליניארי באמצעות ניתוק הנגרם התנגשות (CID) בשווי יעד של 5,000.
    2. השתמש בפרמטרים המפורטים בטבלה 2 עבורr קובץ הרכישה "כוונון".
    3. הגדר את הגדרות רכישה סטנדרטיות כפי שמופיע בטבלה 2.

6. ניתוח נתונים

  1. תווית כימות ללא שינויי היסטון שיתוף מועשרים בתחומים הכרומטין
    1. להמיר את קבצי גלם שנרכש לקבצי MGF באמצעות תוכנת Raw2msm (גרסה 1.10) 29.
    2. חיפוש שינויי היסטון באמצעות קמע Deamon (גרסה 2.2.2), הגדרת הפרמטרים שתוארו בטבלה 3.
    3. ברשימת פפטיד פלט הקמע, להסיר פפטידים עם ציון נמוך מ 15 או עם יותר מ -5 PTMs המשוער 29 הערה:. עבור כל זהות פפטיד יחידה, בחר את הפפטיד עם הציון הגבוה ביותר הקמע ולסנן את כל פפטידים מיותרים האחרים עם אותו ID .
    4. לבנות chromatograms חילוץ יון (XIC) לכל מבשר המתאים לכל פפטידים שונה, based על הערך מ '/ z, באמצעות QualBrowser. לחשב את השטח מתחת לעקומה (AUC) עבור כל שיא (איור 2 א).
    5. לאמת את כל הפפטידים שזוהו המכילים שינויים על ידי בדיקה ויזואלית של ספקטרום MS / MS באמצעות QualBrowser (איור 2).
    6. לחשב את השפע היחסי עבור כל פפטיד שונה. לחשב את ההעשרה היחסית של כל שינוי בחומר שבב עורך הערה:. שפע יחסי מחושב כיחס שבין AUC של כל פפטיד הותאם ספציפי על הסכום של AUC של כל הצורות שונה וללא שינוי של אותו פפטיד, ואילו ביחס העשרה כיחס של השפע היחסי של שינוי המסוים בשבב על הקלט (איור 2 ג).
  2. ניתוח כמותי של חלבוני proteomic משותפים הקשורים בתחומי הכרומטין
    1. לחלבוני זיהוי וכימות להשתמש בחבילת MaxQuant(Http://www. Maxquant.org /) 30. הגדר את מנוע החיפוש המובנה של "אנדרומדה" באמצעות AndromedaConfig.exe יום 31 ולהגדיר את הפרמטרים החיפוש מפורטים בטבלה 3.
  3. מבחן התאגדות
    1. להעריך את מידת שילוב של חומצות אמינו כבדות לחלבונים שבכותרת כבד קלט הכרומטין, באמצעות תוכנת MaxQuant, כדלקמן:
      1. הגדר את הפרמטרים כפי שמתואר ב6.2 אבל השבתת האפשרות מחדש לכמת.
      2. לחשב את אחוז התאגדות החלת הנוסחה הבאה ליחסי פפטיד לא יתירים:. התאגדות (%) = יחס / יחס (H / L) (H / L) + 1 × 100 (איור 3) הערה: קבל רק אם התאגדות> 95 %.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

immunoprecipitation הכרומטין היא טכניקה רבת עוצמה המשמשת לפרופיל הלוקליזציה של חלבון או שינוי היסטון לאורך הגנום. במקבילת פרוטאומיקה, שבב ואחריו פרוטאומיקה מבוססת MS לזהות איכותי וכמותית hPTMs, גרסאות היסטון ומחייב חלבוני הכרומטין שimmunoprecipitated יחד עם השינוי או חלבון של עניין, המ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

יש לנו לאחרונה תיארתי ChroP, אסטרטגיה כמותית לאפיון בקנה מידה גדולה של רכיבי החלבון של הכרומטין. ChroP משלב שתי גישות משלימות בשימוש בתחום אפיגנטיים, שבב וטרשת נפוצה, מרוויח מנקודתי החוזק שלהם ולהתגבר על המגבלות שלהם. שבב מצמידים את רצף עמוק (שבב Seq) מאפשר מיפוי הגנום של שי?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

Acknowledgements

מחקר זה פורסם במקור בפרוטאומיקה הנייד מול. סולדי מ 'וBonaldi ט proteomic חקירת תחומים פונקציונליים הכרומטין חושף Synergisms הרומן בין ברור heterochromatin הרכיבים MCP. 2013; 12: 64-80. © האגודה האמריקנית לביוכימיה וביולוגיה מולקולרית. אנו מודים לרוברטה Noberini (האיטלקי מכון טכנולוגי ולIEO, איטליה) לקריאה ביקורתית של כתב היד. עבודת TB נתמכת על ידי מענקים מArmenise-הרווארד תכנית ג'ובאני קרן לפיתוח קריירה, האיטלקית האגודה לחקר הסרטן ומשרד בריאות האיטלקית. עבודת MS נתמכה על ידי מענק FIRC.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEM LonzaBE12-614F
FBSInvitrogen10270-106
SILAC DMEMM-MedicalFA30E15086
Dialyzed FBSInvitrogen26400-044
Lysine 0 (12C6 14N2 L-lysine)Sigma AldrichL8662
Arginine 0 (12C6 14N4 L-arginine)Sigma AldrichA6969
Lysine 8 (13C6 15N2 L-lysine)Sigma Aldrich68041
Arginine 10 (13C6 15N4 L-arginine)Sigma Aldrich608033
Micrococcal NucleaseRoche10 107 921 001
Complete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail TabletsRoche04 693 132 001
Spectra/Por 3 dialysis tubing, 3.5K MWCO, 18mm flat width, 50 foot lengthSpectrumlabs132720
QIAquick PCR purification kitQIAGEN28104
Anti-Histone H3 tri-methylated K9-ChIP gradeAbcamab8898
Histone H3 peptide tri-methyl K9 Abcamab1773
Dynabeads Protein GInvitrogen100.04D
NuPAGE Novex 4-12%                            Bis-Tris Gel InvitrogenNP0335BOX
Colloidal Blue Staining KitInvitrogenLC6025
LDS Sample BufferInvitrogenNP0007
FormaldheydeSigma AldrichF8775
Aceti anhydride-d6Sigma Aldrich175641-1G
[header]
Formic AcidSigma Aldrich94318-50ML-F
Iodoacetamide ≥99% (HPLC), crystallineSigma AldrichI6125
DL-DithiothreitolSigma Aldrich43815
Sequencing Grade Modified Trypsin, Frozen 100 μg (5 × 20 μg)PromegaV5113
Nanospray OD 360μm x ID 75μm, tips ID 8 μm uncoated Pk 5Microcolumn SrlFS360-75-8-N-5-C15
ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 3 µm   15% CDr. Maisch GmbHr13.aq.
Carbon extraction disk, 47 mmAgilent Technologies12145040
Cation extraction diskAgilent Technologies66889-U

References

  1. Kornberg, R. D. Chromatin structure: a repeating unit of histones and DNA. Science. 184, 868-871 (1974).
  2. Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389, 251-260 (1997).
  3. Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128, 693-705 (2007).
  4. Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Res. 21, 381-395 (2011).
  5. Taverna, S. D., Li, H., Ruthenburg, A. J., Allis, C. D., Patel, D. J. How chromatin-binding modules interpret histone modifications: lessons from professional pocket pickers. Nat Struct Mol Biol. 14, 1025-1040 (2007).
  6. Jenuwein, T., Allis, C. D. Translating the histone code. Science. 293, 1074-1080 (2001).
  7. Spotswood, H. T., Turner, B. M. An increasingly complex code. J Clin Invest. 110, 577-582 (2002).
  8. Soldi, M., Cuomo, A., Bremang, M., Bonaldi, T. Mass spectrometry-based proteomics for the analysis of chromatin structure and dynamics. Int J Mol Sci. 14, 5402-5431 (2013).
  9. Sidoli, S., Cheng, L., Jensen, O. N. Proteomics in chromatin biology and epigenetics: Elucidation of post-translational modifications of histone proteins by mass spectrometry. J Proteomics. 75, 3419-3433 (2012).
  10. Britton, L. M., Gonzales-Cope, M., Zee, B. M., Garcia, B. A. Breaking the histone code with quantitative mass spectrometry. Expert Rev Proteomics. 8, 631-643 (2011).
  11. Taverna, S. D., et al. Long-distance combinatorial linkage between methylation and acetylation on histone H3 N termini. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 2086-2091 (2007).
  12. Garcia, B. A., Shabanowitz, J., Hunt, D. F. Characterization of histones and their post-translational modifications by mass spectrometry. Curr Opin Chem Biol. 11, 66-73 (2007).
  13. Villar-Garea, A., Imhof, A. The analysis of histone modifications. Biochim Biophys Acta. 1764, 1932-1939 (2006).
  14. Plazas-Mayorca, M. D., et al. One-pot shotgun quantitative mass spectrometry characterization of histones. J Proteome Res. 8, 5367-5374 (2009).
  15. Ohta, S., et al. The protein composition of mitotic chromosomes determined using multiclassifier combinatorial proteomics. Cell. 142, 810-821 (2010).
  16. Vermeulen, M., et al. Selective anchoring of TFIID to nucleosomes by trimethylation of histone H3 lysine 4. Cell. 131, 58-69 (2007).
  17. Vermeulen, M., et al. Quantitative interaction proteomics and genome-wide profiling of epigenetic histone marks and their readers. Cell. 142, 967-980 (2010).
  18. Bartke, T., et al. Nucleosome-interacting proteins regulated by DNA and histone methylation. Cell. 143, 470-484 (2010).
  19. Dejardin, J., Kingston, R. E. Purification of proteins associated with specific genomic Loci. Cell. 136, 175-186 (2009).
  20. Lambert, J. P., Mitchell, L., Rudner, A., Baetz, K., Figeys, D. A novel proteomics approach for the discovery of chromatin-associated protein networks. Mol Cell Proteomics. 8, 870-882 (2009).
  21. Soldi, M., Bonaldi, T. The proteomic investigation of chromatin functional domains reveals novel synergisms among distinct heterochromatin components. Mol Cell Proteomics. 12, 764-780 (2013).
  22. Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nat Protoc. 1, 2856-2860 (2006).
  23. Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O., Mann, M. Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels. Anal Chem. 68, 850-858 (1996).
  24. Bonaldi, T., Regula, J. T., Imhof, A. The use of mass spectrometry for the analysis of histone modifications. Methods Enzymol. 377, 111-130 (2004).
  25. Cuomo, A., Moretti, S., Minucci, S., Bonaldi, T. SILAC-based proteomic analysis to dissect the "histone modification signature" of human breast cancer cells. Amino Acids. 41, 387-399 (2011).
  26. Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nat Protoc. 2, 1896-1906 (2007).
  27. Rappsilber, J., Ishihama, Y., Mann, M. Stop and go extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics. Anal Chem. 75, 663-670 (2003).
  28. Olsen, J. V., Ong, S. E., Mann, M. Trypsin cleaves exclusively C-terminal to arginine and lysine residues. Mol Cell Proteomics. 3, 608-614 (2004).
  29. Jung, H. R., Pasini, D., Helin, K., Jensen, O. N. Quantitative mass spectrometry of histones H3.2 and H3.3 in Suz12-deficient mouse embryonic stem cells reveals distinct, dynamic post-translational modifications at Lys-27 and Lys-36. Mol Cell Proteomics. 9, 838-850 (2010).
  30. Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nat Biotechnol. 26, 1367-1372 (2008).
  31. Cox, J., et al. Andromeda: a peptide search engine integrated into the MaxQuant environment. J Proteome Res. 10, 1794-1805 (2011).
  32. Lachner, M., O'Carroll, D., Rea, S., Mechtler, K., Jenuwein, T. Methylation of histone H3 lysine 9 creates a binding site for HP1 proteins. Nature. 410, 116-120 (2001).
  33. Bannister, A. J., et al. Selective recognition of methylated lysine 9 on histone H3 by the HP1 chromo domain. Nature. 410, 120-124 (2001).
  34. Ram, O., et al. Combinatorial patterning of chromatin regulators uncovered by genome-wide location analysis in human cells. Cell. 147, 1628-1639 (2011).
  35. Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129, 823-837 (2007).
  36. Beck, H. C. Mass spectrometry in epigenetic research. Methods Mol Biol. 593, 263-282 (2010).
  37. Ernst, J., Kellis, M. Discovery and characterization of chromatin states for systematic annotation of the human genome. Nat Biotechnol. 28, 817-825 (2010).
  38. Tipton, J. D., et al. Analysis of intact protein isoforms by mass spectrometry. J Biol Chem. 286, 25451-25458 (2011).
  39. Young, N. L., et al. High throughput characterization of combinatorial histone codes. Mol Cell Proteomics. 8, 2266-2284 (2009).
  40. Boyne, M. T. 2nd, Pesavento, J. J., Mizzen, C. A., Kelleher, N. L. Precise characterization of human histones in the H2A gene family by top down mass spectrometry. J Proteome Res. 5, 248-253 (2006).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

86translational hPTMsSILACimmunoprecipitationchromatomehPTMs

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved