הקרנת תפוקה גבוהה לספקטרום רחב כימיים מעכבי RNA וירוסים

Summary

במבחני חוץ גופית כדי למדוד שכפול נגיף כבר השתפר מאוד על ידי הפיתוח של וירוסי RNA רקומביננטי להביע לוציפראז או אנזימים אחרים מסוגלים פליטת אור. כאן אנו פירוט צינור הקרנת תפוקה גבוהה המשלב זני רקומביננטי כגון חצבת והווירוסים chikungunya לבודד antivirals ספקטרום רחב מספריות כימיות.

Abstract

וירוסי RNA אחראים למחלות עיקריות אדם כגון שפעת, ברונכיטיס, דנגה, הפטיטיס C או חצבת. הם גם מייצגים איום מתעורר בגלל חילופים מוגברים ברחבי העולם ואוכלוסיות אנושיות החודרים מערכות אקולוגיות טבעיות יותר ויותר. דוגמא טובה למצב כזה מתעורר היא מגיפות וירוסים chikungunya של 2005-2006 באוקיינוס ​​ההודי. התקדמות של אחרונות בהבנה של מסלולים הסלולר שליטה שכפול נגיפי שלנו מראה כי תרכובות מיקוד פונקציות תא מארחות, ולא את הנגיף עצמו, יכולים לעכב פנל גדול של וירוסי RNA. תרכובות אנטי כמה ספקטרום רחב זוהו עם מבחני מוכוון יעד מארח. עם זאת, מדידת העיכוב בשכפול נגיף בתרביות תאים באמצעות הפחתת השפעות cytopathic כקריאת נתונים עדיין מייצגת אסטרטגית הקרנה בעל חשיבות עליונה. מסכי פונקציונליים כגון שופרו באופן משמעותי על ידי הפיתוח של וירוסי רקומביננטי להביע כתב אנזימי capable של פליטת אור כגון לוציפראז. בדו"ח הנוכחי, אנחנו פירוט צינור הקרנת תפוקה גבוהה, המשלב חצבת רקומביננטי ווירוסים chikungunya עם מבחני כדאיות סלולרית, כדי לזהות תרכובות עם פרופיל אנטי ספקטרום רחב.

Introduction

וירוסי RNA אחראים למגוון רחב של זיהומי אדם, ויש לה השפעה עצומה על אוכלוסייה ברחבי העולם, הוא במונחים של בריאות ציבור ומחיר חסכוני. חיסונים יעילים פותחו נגד מספר וירוסי RNA האנושי, ונמצאים בשימוש נרחב כטיפול מניעתי. עם זאת, עדיין קיים מחסור קריטי של תרופות טיפוליות נגד נגיף RNA. ואכן, חיסונים יעילים אינם זמינים מפני פתוגנים אנושיים גדולים כגון וירוס דנגה, וירוס הצהבת מסוג C או וירוס סינסיציאלי נשימה אנושי (hRSV). חוץ מזה, וירוסי RNA אחראים למרבית מחלות מתפתחות, שגדלו בתדירות בגלל חילופים הגלובליים והשפעת אדם על מערכות אקולוגיות. נגד האיום הזה שמייצגים וירוסי RNA, הארסנל הטיפולי שלנו הוא מאוד מוגבל ולא יעיל יחסית ^1-3. טיפולים קיימים למעשה מבוססים על סוג רקומביננטי אני האינטרפרונים (IFN-α / β) כדי לעורר חסינות מולדת,או הממשל של ribavirin. למרות שאופן פעולה של אנלוגי ribonucleoside זה שנוי במחלוקת וכנראה מסתמך על מנגנונים שונים, העיכוב של IMPDH הסלולרית (דהידרוגנז monophosphate inosine), אשר מכלה את בריכות GTP תאיים, הוא באופן ברור חיוני ^4. Ribavirin, בשילוב עם IFN-α pegylated, הוא הטיפול העיקרי נגד וירוס הצהבת מסוג C. עם זאת, טיפולי IFN-α / β ו ribavirin הם יעילות נמוכה יחסית בvivo מול מרבית וירוסי RNA כפי שהם IFN-α / β ביעילות הבוטה איתות דרך ביטוי של ארסיות גורמים ⁵ ולעתים קרובות לברוח ribavirin ^3. זה הוסיף לעובדה שטיפול ribavirin הוא העלאת בעיות רעילות חשובות, למרות שזה אושר לאחרונה נגד המחלה hRSV חמורה עם הטבות שנויות במחלוקת ^6. לאחרונה, כמה טיפולים ספציפי וירוס כבר משווקים, בפרט כנגד נגיף שפעת עם o הפיתוחמעכבי neuraminidase ו ^3. עם זאת, המגוון הגדול והופעתה הקבועה של וירוסי RNA מונע את פיתוח טיפולים ספציפיים נגד כל אחד מהם בעתיד קרוב יחסית. בסך הכל, זה מדגיש את הצורך באסטרטגיות יעילה כדי לזהות ולפתח מולקולות אנטי חזקות בעתיד הקרוב.

זה טריוויאלי לומר כי מעכב ספקטרום רחב פעיל נגד פנל גדול של וירוסי RNA הייתי לפתור את הבעיה הזו. למרות שמולקולה כזו היא עדיין החלום של ירולוג, ההבנה טובה יותר שלנו מנגנוני הגנה תאיים ומערכת חיסון מולדת מראה כי כמה אפשרויות קיימות ^7,8. מספר מעבדות אקדמיות ותעשייתיות עכשיו מחפשות מולקולות המעוררות היבטים ספציפיים של מנגנוני הגנה תאית או מסלולים מטבוליים כדי להקהות שכפול נגיפי. למרות תרכובות כגון כנראה להראות תופעות לוואי משמעותיים, טיפולים נגד זיהומים נגיפיים אקוטיים יהיו לנהלed לזמן קצר יחסית, מה שהופך אותם מקובלים למרות כמה רעילות פוטנציאלית בטווח הארוך. אסטרטגיות שונות פותחו כדי לזהות מולקולות אנטי ספקטרום רחב כזה. תוכניות מחקר כמה לכוון במציאת מולקולות שיעד מסלולי הגנה או חילוף חומרים ספציפיים. זה כולל, למשל, קולטנים הכרת הפתוגן לעורר ביטוי גנים אנטי ⁹ ולהפעיל גורמים אנטי כגון ¹⁰ RNaseL, מכונות autophagy לקדם השפלה וירוס ^11, סינתזת נוקלאוזידים מסלולי ^12,13, או מפלים אפופטוטיים כדי לזרז מוות של תאים נגועים בנגיף ^14. קבוצות אחרות פיתחו מסכי פנוטיפי שאינם היעד מבוסס ^13,15-17. במקרה זה, מולקולות אנטי פשוט זוהו על ידי היכולת שלהם לחסום את השכפול נגיפי במערכת סלולרית נתון. ההנחה הכללית היא שמתחם עיכוב 2-3 וירוסי RNA שאינם קשורים הייתי לו פרופיל מתאים לרחב spectrum מולקולה אנטי. אופן פעולה של תרכובות להיט שנבחרו עם גישה כזו אמפירית נקבע רק בפעם שנייה וסופו של דבר, עלול להוביל לזיהוי של יעדים סלולריים חדשניים לתרופות אנטי. מעניין לציין, כי ניתוח רטרוספקטיבי של תרופות חדשות שאושרו על ידי הרשות האמריקנית למזון והתרופות אמריקניות בין 1999 ו 2008 הראה כי באופן כללי, הקרנות פנוטיפי כאלה נוטים לבצע טובים יותר מאשר גישות המבוסס על יעד כדי לגלות תרופות מולקולה הקטנה הראשון ב-class ¹⁸ .

שכפול נגיפי במבחנים מבוססי תאי תפוקה גבוהה נקבע בדרך כלל מהשפעות cytopathic וירוס. תאים נגועים ותרבותי ב96 - או צלחות 384 גם בנוכחות של תרכובות שנבדקו. לאחר כמה ימים, שכבות הסלולריות קבועות ומוכתם בצבעים כגון סגול קריסטל. לבסוף, הספיגה נקבעה עם קורא צלחת ותרכובות עיכוב שכפול נגיפי מזוהים על ידי היכולת שלהם לשמר את השכבות סלולריות לכאן ולכאןהשפעת cytopathic מושרה וירוס מ '. לחלופין, השפעות cytopathic באופן ויראלי בתיווכם הוערכו באמצעות מבחני כדאיות סטנדרטיים כגון הפחתת MTS. מבחני כאלה הם צייתנים וחסכוניים מאוד, אך סובלים משלוש מגבלות עיקריות. ראשית, הם דורשים שילוב תאי וירוס שבו שכפול נגיפי הוא cytopathic רק כמה ימים, אבל זה לא תמיד אפשרי, ובכך קורא לאלטרנטיבה גישות ^19. שנית, הם גרועים כמותיים משום שהם מבוססים על אמצעי עקיף של שכפול נגיפי. ולבסוף, ניתן הבקיע תרכובות רעילות כלהיטים חיוביים, ולכן יש לבטל עם מסך דלפק מדידת כדאיות סלולרית. כדי להתגבר על חלק ממכשולים אלה, וירוסים או replicons רקומביננטי כבר מהונדסים על ידי גנטיקה הפוכה לבטא חלבוני כתב, כגון EGFP או לוציפראז, מיחידת שעתוק נוספת או במסגרת עם גנים חלבון נגיפיים (כמה דוגמאות הן ^20-23). כאשר וירוסים אלה לשכפל, יחסי ציבור כתבoteins מיוצר יחד עם חלבונים נגיפיים עצמם. זה מספק assay מאוד כמותית למדוד שכפול נגיפי ולהעריך את הפעילות המעכבת של מולקולות מועמד. זה נכון במיוחד לוירוסי רקומביננטי להביע לוציפראז (או אנזימים אחרים מסוגלים פליטת אור) שכן מערכת הכתב הזה מציגה טווח דינמי רחב עם רגישות גבוהה וכמעט ללא רקע. יתר על כן, אין מקור אור העירור, ובכך למנוע הפרעה לקרינת מתחם ^24.

הנה, אנחנו פירוט פרוטוקול תפוקה גבוהה מסך ספריות כימיות למעכבי ספקטרום רחב של וירוסי RNA. תרכובות נבדקו תחילה על תאים אנושיים נגועים בוירוס חצבת רקומביננטי (MV) להביע גחלילית לוציפראז ²⁵ (rMV2/Luc, איור 1, מסך ראשי). MV שייך לMononegavirales סדר, והוא נחשב לעתים קרובות כחבר טיפוסי של נגיף RNA שלילי גדילes. ככזה, הגנום MV משמש כתבנית על ידי פולימראז הנגיפי לסנתז מולקולות mRNA קידוד לחלבונים נגיפיים. בזן MV רקומביננטי הנקרא rMV2/Luc, ביטוי לוציפראז בא לידי ביטוי מיחידת שעתוק נוסף מוכנסת בין P וגני M (איור 2 א). במקביל, תרכובות נבדקו לרעילות שלהם על תאים אנושיים באמצעות מגיב מבוסס לוציפראז מסחרי שמעריך, על ידי כימות ATP, מספר התאים הפעילים מטבולית בתרבות (איור 1, מסך ראשי). ספריות כימיות כולו יכולות להיות מוקרנת בקלות עם שני מבחני הללו על מנת לבחור תרכובות שאינן רעילים וביעילות לחסום שכפול MV. ואז, להיטים נבדקים מחדש לעיכוב מנת תגובה של שכפול MV, חוסר הרעילות, כמו גם ליכולת שלהם לפגוע בשכפול נגיף Chikungunya (CHIKV) (איור 1, מסך משני). CHIKV הוא חבר של משפחה של Togaviridae והגנום שלו הוא apמולקולת RNA חד גדיל ositive. ככזה, זה לגמרי לא קשורים לחצבת ותרכובות מעכבות גם MV וCHIKV סיכוי גדול לעכב פנל גדול של וירוסי RNA. חלבוני nonstructural CHIKV מתורגמים ישירות מהגנום הנגיפי, ואילו חלבונים מבניים מקודדים על ידי שעתוק ותרגום של מולקולת mRNA subgenomic. assay השכפול שלנו במבחנה לCHIKV מבוסס על זן רקומביננטי הנקרא CHIKV / רן, המבטא אנזים לוציפראז Renilla כחלק ביקע של polyprotein nonstructural באמצעות החדרת גן הכתב בין nsP3 ורצפי nsP4 ²⁶ (איור 2). המדד לפעילות לוציפראז Renilla מאפשר הניטור של שכפול נגיפי בשלב המוקדם של מחזור החיים CHIKV.

פרוטוקול תפוקה גבוהה זה שימש כדי לזהות במהירות תרכובות עם פרופיל מתאים לantivirals ספקטרום רחב בספרייה מסחרית של 10,000 Molecules מועשר לגיוון כימי. תרכובות בעצם עקבו אחרי השלטון של חמש של יפינסקי, עם משקולות מולקולריות הנעות 250-600 daltons, והיכנסו ערכי D מתחת ל -5. רוב המולקולות אלה היו גופים כימיים חדשים אינו זמינים בספריות מסחריות אחרות.

Protocol

1. הכנת צלחות בת 96 היטב עם תרכובות

1. הזז צלחות אם 96 היטב המכילות 10 פתרונות מניות מ"מ של תרכובות כימיות בDMSO מ-20 ° C לטמפרטורת חדר. תרכובות לדלל 5x בDMSO להשיג צלחות דילול 96 היטב ביניים ב2 מ"מ. דילול מושגת על ידי pipetting 5 μl ל20 μl של DMSO וערבוב.
2. פיפטה μl 1 מצלחות דילול לתוך בארות יבשות של צלחות 96 היטב תרבית רקמה לבנה, מסומן בבר. סט ראשון זה של צלחות בתו (D1) ישמש כדי להעריך את הרעילות של תרכובות בריכוז סופי של 20 מיקרומטר. צלחות בתו חנות ב -20 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
3. לדלל תרכובות שוב 1:10 ידי pipetting 4 μl מצלחות דילול ל36 μl של DMSO וערבוב. μl פיפטה 1 לתוך בארות יבשות של חלק תחתון לבן, שטוח, תרבית רקמה המסומנת בשורת צלחות 96 בארות. סט שני זה של צלחות בתו (D2) ישמש כדי להעריך את העיכוב של replicatio MVn על ידי תרכובות בריכוז סופי של 2 מיקרומטר. צלחות בתו חנות ב -20 מעלות צלזיוס עד לשימוש.

2. הכנת תא תרבויות לקביעת רעילות מתחם

1. לגדל תאי HEK-293T ב 37 ° C ו 5% CO ₂ במדיום של הנשר (DMEM) שונה Dulbecco עם L-גלוטמין התייצב ותוספת 10% בסרום עוברי עגל (FCS), סטרפטומיצין (100 מיקרוגרם / מיליליטר) ופניצילין (100 IU / ml). תאי passaged ידי trypsinization כל 4-5 ימים, ובדילול מלא 01:10 לתוך בקבוק טרי. תאים צריכים להיות בשלב יומן לניסויים.
2. ביום של הניסוי, לשחזר תאים על ידי trypsinization ולבצע ספירת תאים. גלולה תאים על ידי צנטריפוגה, וresuspend אותם ב3 x 10 ⁵ תאים / מיליליטר במדיום התרבות. קח בחשבון ש12.5 מיליליטר של השעיה תא נדרשים לכל צלחת הקרנה.
3. העברת תאים לשוקת, ולוותר על השעיה תא 100 μl בצלחות D1 מכילים compo הכימי ממוסמרunds. תא השעיה בתוך השוקת נסערת באופן קבוע, כדי למנוע שקיעה.
4. ספייק שליטת בארות A1, C1, E1, G1, A12, C12, E12 וG12 עם μl 1 של DMSO. בארות מקבילים תשמש כנקודת התייחסות לתאי חיים (לא רעיל). ספייק B1 בארות שליטה, D1, F1, H1, B12, D12, F12 וH12 עם 1 μl של DMSO ו2.5 μl של פתרון IGEPAL 0.5% כדי להרוג תאים. בארות מקבילים תשמש כנקודת התייחסות לתאים מתים (רעילות גבוהה).
5. דגירה תאים עבור 24 שעות על 37 ° C ו 5% CO _2.

3. הכנת תרביות תאים נגועות על ידי rMV2/Luc

1. לצמוח ולהתאושש תאים כמתואר ב2.1 ו2.2. שוב, תאי resuspend ב3 x 10 ⁵ תאים / מיליליטר במדיום התרבות. קח בחשבון ש12.5 מיליליטר של השעיה תא נדרשים לכל צלחת הקרנה.
2. אופציונאלי: מדיום תרבות תוסף עם uridine ב20 מיקרוגרם / מיליליטר.
   הערה: כאשר הקרנת ספריות כימיות לreplicatio ויראליn מעכבים, נראה כי תרכובות מיקוד שלבים מוקדמים של מסלול ביוסינתזה פירימידין לעתים קרובות מבודדים ^13,16,27,28. התוספת של uridine למדיום התרבות משמשת לסינון מולקולות אנטי כזה. ואכן, זה ביעילות משחזר את השכפול נגיפי, כאשר אנזימים במעלה הזרם של מסלול ביוסינתזה פירימידין חסומים.
3. להציל 1:10 של השעיה תא לבארות שליטה עם תאים שאינם נגועים, ולהמשיך לזיהום עם נפח שנותר.
4. להפשיר את הנפח המתאים של פתרון מניות rMV2/Luc. פתרונות מניות MV הם בדרך כלל ב10 ⁶ -10 ⁸ חלקיקים זיהומיות לכל מיליליטר. תרבות חייבת להיות נגועה ב0.1 חלקיקים זיהומיות של rMV2/Luc לתאי מטרה, אשר תואמים את 0.1 ריבוי של זיהום (משרד הפנים). הערה: rMV2/Luc נגזר מחיסון MV (זן שוורץ) והוא מניפולציה בסביבת BSL2.
5. מוסיף את הווירוס להשעיה תא ומערבבים בעדינות. העבר את התאים נגועים לשוקת, ולוותר 100μl של השעיה תא נגועה בעמודות 2-11 של צלחות D2 המכילות תרכובות כימיות ממוסמר. תא השעיה בתוך השוקת היא מעורבת באופן קבוע בעדינות.
6. בעמודות 1 ו 12, לוותר של תאים שאינם נגועים 100 μl גם על שניים. תאים נגועים הם ויתרו בבארות אחרות.
7. דגירה תאים עבור 24 שעות על 37 ° C ו 5% CO _2.

4. מודד את פעילות בלוציפראז וניתוח נתונים

1. הסר צלחות D1 מהחממה, ולקבוע כדאיות סלולריות על ידי הוספת 50 μl של מגיב כדאיות מבוסס לוציפראז ישירות לבארות תרבות. לערבב דגירה עבור 10 דקות בטמפרטורת חדר. קראו צלחות עם luminometer. זמן אינטגרציה מוגדר היטב לכל 100 אלפיות שניים.
2. הסר צלחות D2 מהחממה, ולקבוע את פעילות על ידי הוספת לוציפראז 50 μl של מצע לוציפראז ישירות לבארות תרבות. דגירה במשך 6 דקות בטמפרטורת חדר, ולקרוא צלחות עם luminometer כdescriמיטה לעיל.
3. חישוב גורם Z'לכל צלחת D1 של assay הרעילות כדי להצדיק את האיכות של המסך ^29. Z '= 1-3 (σ + + σ-) / (μ + * - μ-), שבו μ + ו σ + מתאימות לאמצעי הארה וסטיות תקן לתאי HEK-293T עם DMSO לבד (לא רעיל), וμ-וσ-הוא אמצעי להארה וסטיות תקן לבארות התרבות טופלו IGEPAL כדי להרוג תאים. Z "צפוי להיות מעל 0.5, או הצלחת המקבילה נמחקת.
4. הגדרת סף רעילות בμ + / 2. בטל תרכובות עם ערכי הארה להלן (איור 3 א) ניתוק זה.
5. חישוב גורם Z'לכל צלחת D2 של assay אנטי. הנה, μ + ו σ + מתאימות לאמצעי הארה וסטיות תקן לתאים נגועים בתרבית עם DMSO לבד, וμ-וσ-הם אמצעי להארה וסטיות תקן לתאים שאינם נגועים. שוב, צלחות עם Z & #39; ערכים מתחת 0.5 מבוטלים.
6. לחשב את העיכוב בשכפול נגיף כמו בצע: אחוז העיכוב = (μ + - פעילות לוציפראז לX מתחם) / (μ + - μ-) * 100. הגדרת סף עיכוב ב75%, ובחר תרכובות ששני להפחית ערכי הארה מתחת חתך זה (איור 3 ב) ואינן רעילים על פי קריטריונים שתוארו ב4.4.

5. מסך משני לרעיל וספקטרום הרחב אנטי פעילות

1. ודאו 01:02 דילולים סידוריים עבור כל נפגעו מתחם בDMSO, החל מ500 מיקרומטר עד 4 מיקרומטר (8 דילולים). מלא צלחות הלבנות, המסומן בשורת רקמת תרבות עם 50 μl של מדיום התרבות. הוסף 1 μl של דילול כל מתחם בבארות תרבות. חזור פעמיים יש 3 צלחות תרבות עם דילולים סדרתי כפולים עבור כל מתחם להיט.
2. הכן 37.5 מיליליטר של השעיה תא HEK-293T ב6 x 10 ⁵ תאים / מיליליטר במדיום התרבות כפי שתוארו לעיל (ב2.1 ו22). לוותר 2x 12.5 מיליליטר בצינורות בז ולהדביק תאים עם או rMV2/Luc במשרד הפנים = 0.1 או CHIKV רקומביננטי להביע לוציפראז Renilla (CHIKV / רן) במשרד הפנים = 0.2. מערבבים על ידי היפוך.
   הערה: CHIKV / רן נגזר מזן פראי סוג של CHIKV ולכן צריך לטפל בסביבת BSL3. ניתן להעביר צלחות מBSL3 לBSL1 פעם מצע Renilla נוספה בארות תרבות (ראה להלן).
3. לוותר 50 μl של תאים נגועים ב-רן נגוע, rMV2/Luc-infected, או CHIKV / בתרבות צלחות המכילות דילולים סדרתי של תרכובות להיט. דגירה 24 שעות על 37 ° C.
4. הוסף 50 μl של מצע גחלילית בלוציפראז לקבוע פעילות גחלילית לוציפראז בבארות rMV2/Luc-infected. הוסף 50 μl של מצע לוציפראז Renilla לקבוע פעילות לוציפראז Renilla בCHIKV בארות / נגועים ברן. לבסוף, להוסיף 50 μl של מגיב assay הכדאיות מבוסס לוציפראז לתאים נגוע כדי לקבוע כדאיות סלולרית.
5. נתונים עלילה (Figure 4) ולקבוע ריכוזי מתחם פגעו המעכבים MV ושכפול CHIKV ידי 50%. להתעלם מתחם מראה כמה רעילות בassay זה.

תוצאות

צינור הקרנה זו נסמך ראשון על הבחירה של תרכובות המעכבות שכפול MV ולא מראה שום רעילות סלולרית משמעותית (איור 1, מסך ראשי). זה לוקח את יתרון של מבחני מבוססי לוציפראז כדי לקבוע רעילות סלולרית והעיכוב בשכפול נגיף. כל רכישת צעדי pipetting והנתונים יכולה להתבצע בהגדרת תפו...

Discussion

צינור ההקרנה המתואר כאן שואף בבחירת תרכובות עם פרופיל מתאים כמו מעכבי ספקטרום רחב של וירוסי RNA. כאשר ספרייה של 10,000 תרכובות הוקרן עם פרוטוקול זה וקריטריונים לסינון האמורים יושמו, כלומר עיכוב של שכפול MV מעולה ל75%, 40 תרכובות (0.4%) הבקיע חיובי. חוץ מזה, כמחצית מהם הראתה ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Freedom EVO platform	TECAN		Robotic platform
96-well polystyrene cell culture microplates, white	Greiner Bio One	655083
CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay	Promega	G7570	Luciferase-based viability assay
Bright-Glo Luciferase Assay System	Promega	E2610	Reagent containing firefly luciferase substrate
Renilla-Glo luciferase Assay System	Promega	E2710	Reagent containing Renilla luciferase substrate
Britelite plus Reporter Gene Assay System	Perkin-Elmer	6016761	Reagent containing firefly luciferase substrate. Can be used as an alternative to Brigh-Glo reagent to determine luciferase activity.