הדמיה חיה של מיטוזה בCortex עכבר עוברי פיתוח

Summary

מיטוזה העצבית היא פרמטר קריטי הנוירוגנזה. חלק גדול מההבנה של מיטוזה העצבית שלנו מבוסס על ניתוח של רקמה קבועה. הדמיה בשידור חי בפרוסות מוח עובריים היא טכניקה צדדי כדי להעריך מיטוזה עם רזולוציה של זמן ומרחב גבוה בסביבה מבוקרת.

Abstract

למרות של זמן קצר, מיטוזה היא תהליך רב שלבים מורכב ודינמי בסיסי להתפתחות של איברים, כולל המוח. בפיתוח קליפת המוח, מיטוזה חריגה של אבות עצביים יכולה לגרום למומים בגודל המוח ותפקודו. לפיכך, יש צורך קריטי בכלים להבין את המנגנונים של מיטוזה העצבית. התפתחות קליפת המוח במכרסמים היא מודל יוצא דופן ללימוד התהליך הזה. מיטוזה העצבית נבחנה בדרך כלל בחלקים במוח קבועים. פרוטוקול זה יתאר בפירוט גישה להדמית חיה של מיטוזה בvivo לשעבר פרוסות מוח עובריים. נתאר את השלבים הקריטיים בהליך זה, הכולל: שאיבת מוח, הטבעת מוח, חתך vibratome של פרוסות מוח, מכתים וculturing של פרוסות, וזמן לשגות הדמיה. אז תוכל להפגין ולתאר בפירוט כיצד לבצע ניתוח שלאחר הרכישה של מיטוזה. אנו כוללים fr תוצאות נציגאום assay זה באמצעות הצבע Syto11 החיוני, עכברים הטרנסגניים (היסטון H2B-EGFP וcentrin-EGFP), וelectroporation ברחם (mCherry-α-טובולין). נדון כיצד הליך זה יכול להיות מותאם הכי טוב ואיך זה יכול להיות שונה למחקר של רגולציה הגנטית של מיטוזה. הדמיה חיה של מיטוזה בפרוסות מוח היא גישה גמישה על מנת להעריך את ההשפעה של גיל, אנטומיה, והפרעות גנטיות בסביבה מבוקרת, ולייצר כמות גדולה של נתונים ברזולוציה של זמן ומרחב גבוה. מכאן פרוטוקול זה ישלים כלים קיימים לניתוח של מיטוזה העצבית.

Introduction

המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא לתאר כיצד לבצע הדמיה חיה של מיטוזה העצבית בפרוסות מוח עובריים. באמצעות הדמיה חיה של פרוסות מוח בתרבות, פרוטוקול זה מספק שיטה פשוטה לassay היבטים רבים של מיטוזה בתאי אב עצבי בסביבה דומה מאוד להגדרת in vivo. זה יכול להיות מיושם על מוחם של בעלי חיים שעברו מוטציה ו / או מוח שעברו מניפולציה עם electroporation ברחם) ^1-5. טכניקה זו היא גם אידיאלית כדי לבחון את ההשפעה של סוכנים תרופתיים במיטוזה 'המבשרים עצביים, פשוט על ידי הוספת סוכן למדיום לתרבות. לסיכום, במאמר זה להפוך את פרוטוקול מאתגר מבחינה טכנית נגיש ללומדי נוירוגנזה.

במהלך נוירוגנזה, אוכלוסיות עצביות שונות לעבור חטיבות מדויקות כדי לייצר נוירונים שסופו של דבר יתרמו לשש שכבות בקליפת המוח של המבוגרים הניאוקורטקס ^6-8. בשלב מוקדם בהתפתחות קליפת המוח, הבריכה העצבית המבשרת מתרחבת כneuroepithelial תאים (NE) לחלק באופן סימטרי לחידוש עצמי. תאי NE לאחר מכן להמיר לתאי גלייה רדיאלי (RGCs). בתחילה RGCs לחלק באופן סימטרי כדי לייצר שתי RGCs החדש, לעומת זאת בחלק הארי של נוירוגנזה, המצב העיקרי 'RGCs של החלוקה הוא סימטרי. בחלוקה סימטרית, 1 RGC מוליד RGC חדש וגם נוירון לאחר mitotic, או אב מתמחה יותר (או מבשר קצר עצבי (SNP), גליה חיצונית רדיאלי (ORG), או אב ביניים (INP) ^2,3,7,9. INPS, SNPs, וorgs אז ניתן להפיק תאי עצב בתת חדרית, חדרית, ואזורי בסיס של קליפת המוח, בהתאמה. לפיכך, חלוקת תא של אבות הוא תהליך בסיסי ליצירת נוירונים של קליפת מוח.

מחקרים רבים מצביעים על קשר בין תכונות ספציפיות mitotic של RGCs וגורלם של תאי בת. חיידר ואח'. ואל טקהאשי et.הראו כי משך המיטוטי RGC ולהגדיל את אורך מחזור התא כתמורת נוירוגנזה, ממצא הדהד במעקב מחקרים ^10-13. מספר המחקרים הציעו כי ציר mitotic אורינטציה ביחס לחדר משפיע על היבטי הנוירוגנזה וcorticogenesis, כוללים סוגים של נוירונים שנוצרו ומיקום של צאצאים במוח, בהתאמה ^3,10,14-16. האם נטייה מטוס המחשוף משפיעה ישירות על גורל תא הוא שנוי במחלוקת, אבל המסקנה היא שנוירוגנזה משפיע פרמטר המיטוטי זה. יתר על כן מדגישה את החשיבות של מיטוזה היא התצפית כי גנים רבים המעורבים במכניקה של מיטוזה הם קריטיים עבור הנוירוגנזה להתפתחות מוח תקינה ^17-20.

מיטוזה היא תהליך דינמי, אך עד כה רוב המחקרים המפרטים מיטוזה העצבית לנצל ניתוח של סעיפים קבועים רקמה או הדמיה של אבות עצביים באמצעות תרבית תאים במבחנה. לכן, שיטות הזרם המרכזי כדי להעריך מיטוזה רק לספק תמונת מצב של תהליך זה ולא מצליחים לגלות כיצד תאים להתנהג ברקמות. הדמיה חיה של מיטוזה העצבית הפכה יותר ויותר כלי קריטי להבנת תפקוד עצבי. לדוגמאות ראו אזכור אלה ^{4,8,10,21-25.} כמה פרוטוקולים מצטיינים כבר פורסמו לעריכה ולהדמיה של פרוסות מוח ^26,27. עם זאת נכון להיום, פרוטוקול מקיף להדמיה וניתוח של מיטוזה לא תואר ולא הוכיח בוידאו.

טכניקה זו מציעה כמה יתרונות משמעותיים על פני ניתוח קבוע של חלקים במוח. ניתוח זמן לשגות של פרוסות המוח מאפשר דור של באופן משמעותי יותר נקודות נתונים שיכולים להיות מנותח באופן גמיש. ראשית, הנתונים שנאספו בנקודות זמן בודדות במהלך כמה דקות או כמה שעות. אפשר לנתח את נקודות זמן בודדות (כדי ליצור מונטאז' סטטית) אוניתן לשלב נקודות זמן שונות לסרטים. שנית, ההדמיה confocal של פרוסות מאפשרת דור של נתונים בסעיפי Z שונים בפרוסות מוח. כתוצאה מכך, ניתן לנתח קטעים בודדים. לחלופין, ערימות של חלקים בודדים ניתן לשלב הקרנת עוצמה מקסימלית. שלישית, ניתוח נעשה בהקשר של רקמה, וחושף כיצד תאים מתחלקים ביחס לתאים ומבנים שכנים. רביעית, הוא אידיאלי לניתוח מוטציות שמראות כמה עדויות של פגמים mitotic. יחד פרוטוקול זה יעזור להבהיר את השלבים קריטיים כדי לסייע לחוקרים המבקשים לבצע הדמיה חיה של מיטוזה העצבית במעבדות שלהם.

Protocol

1. הכנת מדיה (איור 1, שלב 1)

1. פורסים תרבות בינונית
   1. 25 מיליליטר של מדיום התרבות הפרוסה הוא מספיק כדי להכין את מנות תחתית זכוכית 5 עם 2 פרוסות בכל טוב.
   2. בצינור חרוטי 50 מיליליטר, להוסיף 250 μl של פתרון N2 100x ו500 μl של פתרון 50x B27 ללא ויטמין A. הוספת DMEM/F12 להיקף של 22.5 מיליליטר.
   3. סנן לעקר פתרון ולאחר מכן להוסיף 1.25 מיליליטר של סרום סוס מומת חום ו1.25 מיליליטר של סרום שור העובר.
   4. דגירה פתרון באמבט מים על 37 מעלות צלזיוס למשך הכנת פרוסות.
   5. הוספת גורמי גדילה (FGF וEGF, ריכוז סופי של 10 ng / ml ו20 ng / ml, בהתאמה) מייד לפני תחילתה של התרבות. ההרכב של המדיום הזה בצורה מיטבית כדי לקדם את הישרדותם של תאים בתרבית ולהגביר את קצב ההתפשטות של אבות עצביים. זו ובכך תהיה למקסם את ההסתברות ללהתבונן תאי mitotic בפרוסה.
2. מלא HBSS Dissection פתרון
   1. הכן 500 מיליליטר של HBSS המלא על ידי הוספת 50 מיליליטר של 10x HBSS, 1.25 מיליליטר של 1 M Hepes (pH 7.4, FC 2.5 מ"מ), 6 מיליליטר של 2.5 M D-גלוקוז (FC 30 מ"מ), 2.2 מיליליטר של 0.9 M NaHCO ₃ (4 מ"מ FC) וautoclaved diH ₂ O לנפח סופי של 500 מיליליטר.
   2. פתרון סנן לעקר ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס עד האוסף של קרנות רחם מהעכבר בהריון. פתרון זה יכול להיות כל הזמן על 4 מעלות צלזיוס במשך שבועות.
   3. שמור HBSS על קרח במהלך ההליך כולו לנתיחה.
3. הטבעת פתרון
   1. להטבעה של 4 מוחות עובריים, להכין 30 מיליליטר של 3% agarose התכה הנמוך בפתרון HBSS המלא. בצינור 50 חרוטי מיליליטר, להוסיף 0.9 גרם של התכה נמוכה agarose וHBSS המלא ל30 מיליליטר.
   2. מערבבים את הפתרון עם מיקסר מערבולת, ולהמס במיקרוגל עם מעמד הצינור והכובע פתוח.
   3. בעוד במיקרוגל, לפקח על הפתרון לעמהצפת Revent בשל רתיחה מוגזמת. כשרותח מתחילה, לעצור את המיקרוגל ומערבולת הפתרון.
   4. חזור על שלבים אלה עד שכל agarose נמס.
   5. אחסן את הצינור באמבט מים ב42 ° C.

2. Dissection של העוברים (איור 1, שלב 2)

1. לאחר המתת חסד זהירה של העכבר בהריון, לאסוף את קרן הרחם ולהעביר אותם לתוך צלחת 10 ² סנטימטר פטרי המכילה 1x HBSS מלא קר. גיל העובר יכול להשתנות בהתאם למחקר. פרוטוקול זה שמש בהצלחה לculturing פרוסות מוח מE12.5 ימים עובריים כדי E17.5. בשל גודלם, מוחות צעירים נוטים להיות יותר קשה לעבוד איתו.
2. לאסוף את העוברים ולנתח את המוח העוברי כפי שתואר לעיל בחולדה והעכבר ^26,27, עד שמוח עוברי מלא כולל המוח האחורי והמוח הקדמי עם שתי אונות המוח מתקבל. אלה יכולים להיותשמר על RT עד שכל המוחות היו גזורים.
3. לאסוף את העוברים ולנתח את המוח העוברי כפי שתואר לעיל בחולדה והעכבר ^26,27, עד שמוח עוברי מלא כולל המוח האחורי והמוח הקדמי עם שתי אונות המוח מתקבל. יכולים להיות כל הזמן אלה ב RT עד שכל המוחות היו גזורים.

3. הטבעה של המוח עוברי (איור 1, שלב 3)

1. בדלי קרח המכיל, ליצור חור בקרח כדי להכניס את תבניות הטבעה ל.
2. יוצקים את מדיום agarose 3% לתוך תבנית פלסטיק ומניח את התבנית שלתוך החור שהוכן בקרח.
3. מערבבים את מדיום agarose עם הקצה של מדחום דיגיטלי עד שהטמפרטורה מגיעה 35 ° C.
4. מייד להעביר את המוח למדיום ההטבעה.
5. שלב קריטי: כדי להסיר את HBSS העודף בממשק שבין המוח וagarose, בזהירות ובעדינות נפילה / לסובב את המוח שוב ושובבפתרון ההטבעה עם המלקחיים.
6. כרית agarose gelled תהווה בחלק התחתון של העובש במגע עם הקרח. ברגע שהכרית יכולה להיות מורגשת עם הקצה של המלקחיים תוך ערבוב המוח, מקם את המוח עם הצד עד הגב. המוח לא צריך לשקוע בתחתית מאוד של העובש.

4. הכנת Agarose הבלוק (איור 1, שלב 4)

1. בואו agarose להקשיח בקרח למשך 5 דקות לפחות.
2. באמצעות סכין גילוח, סעיף הפינות של העובש.
3. לגלף בזהירות בלוק agarose סביב המוח באמצעות סכין גילוח. נסה לצמצם את מספר הקיצוצים כדי להימנע מביך את המוח המוטבע.
4. ודא שיש לו את הבלוק שטח פנים גדול יותר באזור הזנב של המוח (לעומת האזור מקורי, ראה איור 1, שלב 4) כדי להגדיל את היציבות של הגוש על הכן חתך.
5. הקיצוץ האחרון צריך להיות אחד בצד הזנב של מוח;הקיצוץ הזה יגדיר את מטוס חתך הנכון עם vibratome.
6. לעשות זאת על ידי יישור הלהב בניצב לציר rostro-הזנב של המוח ובלוק agarose. להחליק במורד הלהב caudally לאורך ציר rostro-הזנב והגיע לגמר כ -5 מ"מ מאזור הזנב ביותר של המוח.
7. הגדר את בלוק agarose / המוח בצד ולחזור על הטבעה של מוחות אחרים.

5. העברה של המוח המשובץ לתוך מגש של Vibratome (איור 1, שלב 5)

1. הוסף טיפה של דבק על החלק התחתון של מגש vibratome. הנח דבק כך שאובניים agarose ימוקם בהישג ידו של הלהב הרוטט.
2. הנח את צד הזנב בלוק agarose / מוח על הקצה של המרית, עם כ -50% המפנה לחסום מעבר לקצה של המרית.
3. להחיל את פניו הזנב של בלוק agarose לדבק ולהחליק את המרית משם, שמירה על בלוק agarose לתחתית המגש עם יםhoulder של פינצטה. אל תתנו מרית קשר ישירות עם הדבק.
4. תן הדבק לחזק בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות.

6. חתך של המוח המשובץ (איור 1, שלב 6)

1. מלא את מגש vibratome עם HBSS.
2. הגדר את מיקומי ההתחלה וסיום של להב vibratome.
3. צור 200-250 מיקרומטר פרוסות. עם vibratome VT1000s, השתמשו בפרמטרים הבאים: המהירות 2 - 4, בתדר 8.
4. מוציאים בזהירות את הפרוסות מvibratome כפי שהם נחתכים. מעביר את הפרוסות עם מרית והקצה האחורי של פינצטה ל12 מנות גם מלאים בHBSS מלא. לחלופין כמה חוקרים השתמשו במכחול במקום פינצטה נקודת מפתח:. במהלך העברה, דואגים שפרוסות המוח להישאר מחוברות לagarose שמסביב.

7. Syto11 הכתמה של פרוסות (איור 1, שלב 7)

1. לדלל Syto11 לריכוז סופי של.5-1 מיקרומטר במדיום התרבות הפרוסה בתוספת גורמי גדילה.
2. בבאר של צלחת 12 היטב, דגירה פרוסות ממוח אחד ב2.5 מיליליטר של הפתרון מכתים עבור שעה 1 ב 37 ° C.
3. לשטוף את הפרוסות ב2.5 מיליליטר של מדיום התרבות הפרוסה ללא כתמי פתרון עבור 20 דקות.

8. הרכבה פרוסות בצלחת זכוכית תחתונה (איור 1, על השלבים 8, 9)

1. הכן 15 μl של הטבעת פתרון קולגן לכל פרוסה. הכן פתרון 1.5 מ"ג / מיליליטר קולגן על ידי ערבוב 375 μl של 3 מ"ג / מיליליטר פתרון אני סוג קולגן עם 75 μl של 10x DMEM, 9.4 μl של 1 M NaOH, ו290 μl של H ₂ O. אחסן על קרח.
2. מניחים ירידת 15 μl של פתרון קולגן בתחתית צלחת microwell תחתית זכוכית 35 מ"מ. מורחים אותו עם קצה pipet כדי להתאים את הגודל של הפרוסה.
3. מעביר את הפרוסה לירידה של קולגן עם מרית ופינצטה נקודת מפתח:. הרכבה מספר פרוסות בשונותמנות ent מגדילה את ההסתברות לרכישת פרוסות מתאימות להדמיה. מסך באמצעות פרוסות שונות ולבחור את אלה שהכי הטובים עומדים בקריטריונים שיפורטו להלן בסעיף "נציג התוצאות".
4. בואו פרוסות לדגור על RT עבור 10 דקות לפני העברתן לחממת 37 ° C עם 5% CO _2.
5. אחרי 20 דקות, להוסיף 1.2 מיליליטר של מדיום התרבות הפרוסה לתוך צלחת microwell תחתית הכוס. הוספת 600 μl של מדיום בכל פעם ולהפיץ אותו עם קצה פיפטה.
6. לכידת תמונה בהגדלה נמוכה של פרוסת המוח כדי להקליט את הרמה ויושרה האנטומי של הפרוסה.

9. הדמיה חיה של פרוסות (איור 1, צעדי 10, 11)

1. בואו פרוסות להתאושש בחממה במשך שעה לפחות 1 ו30 דקות ב 37 ° C עם 5% CO ₂ לפני הדמיה בשידור חי.
2. תמונת פרוסות עם המיקרוסקופ של בחירה, תוך התחשבות כי Syto11 הוא נוטה מאוד photobleaching. הנה Inverמיקרוסקופ confocal דיסק מסתובב טד משמש (מיקרוסקופ confocal הדיסק מסתובב מהפכה אנדור XD). לחלופין לייזר סריקת מיקרוסקופ confocal ניתן להשתמש. הפרמטרים הבאים הם למיקרוסקופ הדיסק מסתובב ההגדרה.
3. במהלך פגישת ההדמיה חיה כולה, לשמור על פרוסות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ בתא דגירה humidified המחובר למיקרוסקופ.
4. תאי תמונה עם אובייקטיבי 60x סיליקון שמן עם מרחק עבודה של 300 מיקרומטר, וצמצם מספרי של 1.3 (לדוגמאות ראו 3B דמויות, 3C, 3E, 3F, 4 א, ​​4 ב). מטרת שמן 100X עם מרחק עבודה של 130 מיקרומטר וצמצם מספרי של 1.4 (לדוגמא ראה איור 4C) יכולה לשמש גם. הרזולוציה של המצלמה היא 512 x 512.
5. תמונת התאים בZ-מחסנית 30 מיקרומטר, עם המרכז של Z-המחסנית ממוקמת כ 40 מיקרומטר מתחת לפני השטח של הפרוסה. מנסה תמונה עמוקה יותר לתוך הרקמה יכול לגרום למטרה להוסיףלחץ מכאני על הפרוסה. זה יכול להשפיע על השלמות של פרוסת המוח. אם מתכנן לעשות שחזורי 3D של התאים, השתמש Z-מרווח של לא יותר מ 2 מיקרומטר.
6. להתאים את כוח הלייזר וזמני חשיפה להגביל photobleaching. השתמש בזמני חשיפה נעים 30-200 אלפיות שניים, תלוי בעוצמת אות Syto11.
7. עם במה ממונעת, מספר עמדות תמונה על פני מספר פרוסות רכובים בצלחת 1. לדוגמא, תמונה עד 20 עמדות פזורות על פני 4 פרוסות שונות במנה אחת 1.
8. הדמיה חיה, השתמש ברזולוציה זמנית של פחות מ -5 דקות, כדי לאפשר זיהוי של השלבים השונים של מיטוזה. שימוש Syto11 ו / או היסטון H2B-EGFP, 4 - 5 שעות של הדמיה חיה מספיקות כדי לבחון מספר משמעותי של תאי mitotic. עם זאת, אם הדמיה שכותרתו בדלילות תאי mitotic (כגון אלה שהושגו על ידי ב electroporation ברחם), ואז פרמטר כבר הדמיה (לילה) הוא מתאים ועובדיםll.
   הערה: שימוש בפרוטוקול זה, אנו בדרך כלל להתבונן בממוצע 10 תאים mitotic למשרה. כאמור לעיל, מספר רב של הדמיה רכוב פרוסות מגדיל את ההסתברות שיש ניסוי מוצלח. עם גישה זו בדרך כלל אנו מזהים תאי mitotic כמעט בכל הניסויים שבוצעו עם Syto11 או היסטון H2B-EGFP.

10. לאחר רכישת ניתוח של מיטוזה (איור 2)

כל ההליכים בסעיף זה כבר מותאם בפיג'י (ImageJ), אשר יש יתרון משום שהיא תוכנת קוד פתוח בחינם. פתרונות תוכנה אחרים זמינים כדי לבצע את אותן משימות, כמו Metamorph, Imaris, ועמירה.

1. זיהוי של mitotic איורים בפיג'י
   1. לאחר פתיחת בסיס הנתונים לעמדה אחת כ" hyperstack ", בחר Z-מטוס אחד (ראה איור 2 א למיקום של פס הגלילה) שבו הרקמות ותאים נראים בריאים (ראה קריטריונים בסעיף הדיון).לגלול על פני ממד הזמן כדי לזהות תאים עוברים anaphase, כפי שהוא בשלב mitotic הכי קל לזהות.
   2. לגלול אחורה בזמן כדי לזהות את נקודת הזמן שבו התא נכנס מיטוזה (עיבוי ה-DNA). התא עשוי לנוע על פני Z-מטוסים, אבל הרזולוציה של הזמן ופרמטרי Z-המחסנית שתוארו קודם לכן היו מותאם כדי לאפשר את התהליך הזה.
   3. בגיליון אלקטרוני, להקליט 4D קואורדינטות של התא בhyperstack (X, Y, Z וזמן, ראה איור 2 א לדמיין את המיקום של דמויות אלה בממשק פיג'י) כפי שהוא נכנס מיטוזה. ידיעת קואורדינטות אלה תמנע סופרים את אותו התא מספר פעמים.
   4. לגלול קדימה בזמן, ורשום את הזמן שבו התא עם התקדמות משלב אחד למשנו. לתעד את משך הזמן של כל שלב mitotic לתא נתון אחד.
   5. המשך עם תאים אחרים, מעבר לבסיס נתונים המלא (מספר תאים בתוך ובין עמדות).
2. 3D בנייה מחדשיון של התאים וQuantitation של הרוטציה במהלך Metaphase (מעובד מתוך חיידר ואח', 2003) (איור 2).
   1. לאחר שזיהה תאי mitotic מרובים, השתמש בקואורדינטות של תא ולגלול קדימה בזמן עד לתחילת metaphase.
   2. סובב "hyperstack" השלם, כך שגבול חדרית הוא מישורי (באמצעות "תמונה / המרה / סובב ..." הפקודה). השתמש בכלי "הזווית" כדי לקבוע את הזווית להגיש בקשה לסיבוב זה.
   3. זהה את Z-המטוס שבו התא של עניין הוא הבולט ביותר. במישור זה, להשתמש בכלי "מלבן בחירה" לצייר מבחר הכולל את התא כולו.
   4. זהה את Z-המטוסים הכוללים את התא של עניין. השתמש בפקודה "תמונה / כפל" כדי ליצור "תת מחסנית". בתיבת הדו שיח, יעזוב "hyperstack כפול" בדק. "פרוסות (z)" פרמטר תואם את Z-המטוסים כוללים את כל cell, ו" מסגרות (t) "פרמטר מתאים לנקודת הזמן הנוכחית.
   5. אם ההחלטה היא גרועה, להגדיל את הגודל של "תת הערימה" באמצעות "תמונה / התאם / גודל ..." הפקודה.
   6. ליצור שחזור 3D של התא בנקודת הזמן הנוכחית באמצעות "פרויקט Image/Stacks/3D ..." הפקודה. הפרמטרים לפקודה זו מוצגים באיור 2. "מרווח Slice" מתאים למרווח הזמן בין כל אחת מתמונות המטוס-z (מיקרומטר). חשוב: לוודא כי הממד הפיזי (מיקרומטר) של משנה הערימה כבר נשמרים. אם לא, אינטרפולציה של פיקסלים בממד z תהיה שגויה, ושחזור 3D יהיה לא מדויק.
   7. שימוש בפס הגלילה, לסובב את שחזור 3D וכתוצאה מכך שהקצה של צלחת metaphase גלוי. מספר המסגרת מתאים לזווית בטא המתוארת באיור 3 ב, להקליט מספר זה. באמצעותבאפשרות "הזווית" ועל "נתח / מדוד ..." הפקודה, למדוד את הזווית בין אופקי וקו שחצה את צלחת metaphase בניצב (איור 2). זוהי אלפא הזווית.
   8. הקלט את הזוויות הללו לכל נקודות זמן metaphase של התא של עניין. זווית הסיבוב בין נקודות זמן (t) ו( t-1) שווה לערך המוחלט של ההפרש בין זווית (t) וזווית זו ב( t-1).
3. מדידת כיוון של מטוס המחשוף
   1. 3D לשחזר תא של עניין בנקודת זמן אחת במהלך anaphase ביצוע ההוראות תיארו לשחזור 3D של צלחות metaphase.
   2. סובב את השיקום עד לקצותיהם של שתי הצלחות שהוקמו על ידי הכרומוזומים ההפרדה גלויים.
   3. השתמש בכלי הזווית כדי למדוד את הזווית בין האופקי (קצה חדרית) וקו מקביל לשתי צלחות שהוקמו על ידי הכרומוזומים ההפרדה. זוהי הזווית של מישור המחשוף (איור 2 ג).
4. דור של סרטים
   1. כתאים לעתים קרובות לעבור על פני Z-מישורים שונים, לזהות z-המטוסים שנכבשו על ידי התא במהלך פגישת ההדמיה חי. צור "הקרנת עוצמה המרבית" של Z-מטוסים אלה באמצעות "סטאקס פרויקט תמונה / / ת ..." הפקודה. שמור את הערימה וכתוצאה מכך כקובץ ". TIF".
   2. פתח את הקובץ בגרסה 1.45 של ImageJ כמו פיג'י אינה כוללת תוסף יציב לדור של קבצים ". Avi" ". Mov" או.
   3. השתמש "קובץ / שמירה בשם / ..." פיקוד ImageJ כדי ליצור סרט בפורמט תואם עם היישומים במורד הזרם שלך.

תוצאות

ההצלחה של assay זה וההתבוננות בתאי mitotic המרובים במהלך פגישת הדמיה חיה אחת תלויה במידה רבה על שניהם את השלמות והרמה האנטומי של הפרוסה שבו רכישות נעשות. כפי שנראה להלן, ברמה האנטומי של הפרוסה היא גורם חשוב. איור 3 א מציג rostro-הזנב והמדיאלי לרוחב במקומות בהם יש לנו ה?...

Discussion

היתרון העיקרי של הפרוטוקול שתארנו הוא שהיא מספקת פתרון זמני דינמי של מיטוזה של אבות עצביים. בדרך כלל, מבחני לדמיין מיטוזה במוח המתפתח מבוצעים באמצעות immunofluorescence של חלקי רקמות קבועים. אך גישה זו מספקת רק תמונת מצב של מיטוזה בנקודת זמן אחת.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100X N2	Life technologies	17502048	for culture medium
50X B27 without vitamin A	Life technologies	12587010	for culture medium
DMEM/F12	Life technologies	11320033	for culture medium
Heat-inactivated horse serum	Sigma Aldrich	H1138-500ml	for culture medium
Heat-inactivated calf serum	Sigma Aldrich	F4135-500ML	for culture medium
FGF	R&D Sytems	3139-FB-025	for culture medium
EGF			for culture medium
10X HBSS	Life technologies	14065-056	for the dissection of the embryos
Hepes Free Acid	Sigma Aldrich	H4034	dilute to 1 M (pH 7.4)
2.5 M D-Glucose	Sigma Aldrich	G8769	for the dissection of the embryos
0.9 M NaHCO3	Life technologies	25080-094	for the dissection of the embryos
Low-melting agarose	Fisher	BP165-25	for generating slices
Syto11	Life technologies	S7573	Make 5µl aliquots
3 mg/ml collagen type I	Life technologies	A1048301	for culturing slices
Glass bottom dish	MatTek	P35G-1.5-14-C	for culturing slices
Petri dishes			for dissection of the embryos
Digital thermometer			to measure the temperature of the agarose
Spatula			to transfer brains
Paintbrush			alternative to transfer brains
Vibratome	Leica	VT1000s	for generating slices
Dissecting microscope			dissecting out embryos
Imaging microscope			A confocal microscope is required, it needs to be equipped with an incubation chamber