סינתזה מפוצלת וברכה ואפיון של הספרייה אמידה השלישון פפטיד

Summary

אורגני חיבור פפטיד שיישונים (PTAs) הוא superfamily של peptidomimetics שכולל, אך אינם מוגבלים לפפטידים, peptoids ופפטידים מפוגלים-N. כאן אנו מתארים שיטה סינתטית המשלבת את שניהם מפוצלת וברכה ואסטרטגיות תת מונומר לסנתז ספרייה חד מתחם אחד אגל PTAs.

Abstract

Peptidomimetics הם מקורות של ligands החלבון גדולים. טבע oligomeric של תרכובות אלו מאפשר לנו לגשת לספריות סינתטיות גדולות בשלב מוצק באמצעות כימיה קומבינטורית. אחד השיעורים הכי למדו היטב של peptidomimetics הוא peptoids. Peptoids קל לסנתז והוכח להיות proteolysis עמיד ותא חדיר. במהלך העשור האחרון, זוהה רבים ligands חלבון שימושי באמצעות הקרנה של ספריות peptoid. עם זאת, רוב ligands זיהה מספריות peptoid לא להציג זיקה גבוהה, עם יוצאים מן הכלל נדיר. זה עשוי להיות בשל, בין שאר, לחוסר מרכזי כיראליות ואילוצי קונפורמציה במולקולות peptoid. לאחרונה, תאר את המסלול סינטטי חדש לגישה אורגנית חיבור פפטיד שיישונים (PTAs). PTAs הוא superfamily של peptidomimetics שכולל, אך אינם מוגבלים לפפטידים, peptoids ופפטידים מפוגלים-N. עם שרשרות צד שני α-פחמן ואטומי חנקן השרשרת ראשיים,קונפורמציה של מולקולות אלה מוגבלים מאוד על ידי מכשלה sterical ומתח 1,3 allylic. (איור 1) המחקר שלנו מצביע על כך שמולקולות ועד ההורים אלה מובנים מאוד בפתרון וניתן להשתמש בם כדי לזהות ligands חלבון. אנו מאמינים כי מולקולות אלה יכולות להיות מקור עתיד של ligands חלבון גבוה זיקה. כאן אנו מתארים שיטה סינתטית המשלבת את הכוח של שניהם מפוצלת וברכה ואסטרטגיות תת מונומר לסנתז מדגם ספרייה אחת חרוז אחד מתחם (OBOC) של PTAs.

Introduction

Peptidomimetics הם תרכובות המחקות את המבנה של הפפטידים טבעיים. הם נועדו לשמר את הפעילות הביולוגית תוך התגברות על חלק מהבעיות הקשורות פפטידים טבעיים, כוללים חדירות תא ויציבות נגד proteolysis ^1-3. בשל אופי oligomeric של תרכובות אלה, ניתן לגשת אל ספריות סינתטיות גדולות בקלות דרך מסלולים סינטטיים monomeric או תת monomeric ^4-7. אחד השיעורים למדו רוב peptidomimetics הוא peptoids. Peptoids הוא oligomers של glycines N-alkylated שיכול להיות מסונתז בקלות באמצעות אסטרטגיה תת מונומר ^{8, 9.} ligands חלבון שימושי רבים זוהה בהצלחה מהקרנת ספריות peptoid הסינתטי גדולות נגד מטרות חלבון ^{1, 10-14.} יחד עם זאת, "להיטים" זיהו מספריות peptoid רק לעתים נדירות בארכיון זיקה גבוהה מאוד לעבר מטרות חלבון ^1,10-14,22. ma אחדאימונים עם גור הבדל בין peptoids ופפטידים טבעיים הוא שרוב peptoids חוסר היכולת ליצור מבנה משני בשל חוסר מרכזי כיראליות ואילוצי קונפורמציה באופן כללי. על מנת לפתור בעיה זו, אסטרטגיות מרובות פותחו בעשור האחרון, תוך התמקדות במידה רבה בשינוי של רשתות בצד הכלולות באטומי חנקן השרשרת העיקריים ^15-22. לאחרונה, פיתחנו מסלול סינטטי חדש להציג את הרשתות בצד חומצת אמינו טבעיות על גבי עמוד השדרה peptoid ליצור אורגני חיבור שלישוני פפטיד ^23.

אורגני חיבור פפטיד שיישונים (PTAs) הוא משפחת העל של peptidomimetics שכולל, אך אינם מוגבלים לפפטידים (R ₂ = H), peptoids (R ₁ = H) ופפטידים מפוגלים-N (R ₁ ≠ H, R ₂ = Me) . (ראה איור 1) המסלול הסינטטי מעסיק באופן טבעי חומצות אמינו כמקור של רשתות כירליות ולוואי על45; פחמן, ואמינים ראשוניים זמינים מסחרי כדי לספק N-החלפות. לכן, ניתן לחקור שטח כימי גדול יותר מזה של פפטידים פשוטים, peptoids או פפטידים מפוגלים-N. ספקטרום dichroism חוזר הראו כי מולקולות ועד ההורים הן מובנים מאוד בפתרון. אפיונו של אחד מהמתחמים ועד ההורים החלבון ניתן לראות בבירור כי האילוצים קונפורמציה של ועד ההורים נדרשים לכריכה. לאחרונה, יש לנו גם גילינו שחלק מהמולקולות ועד ההורים בעלי חדירות תא השתפרו מאשר עמיתי peptoid ופפטיד. אנו מאמינים כי הספריות ועד ההורים האלה יכולים להיות מקור טוב של ligands גבוה זיקה למטרות חלבון. במאמר זה, נדון בסינתזה של מדגם ספרייה עד הורים חד מתחם (OBOC) חד חרוז בפרטים יחד עם כמה תנאים משופרים לצימוד והמחשוף של תרכובות אלה.

Protocol

1. יסודות של סינתזה הפיצול וברכה

על מנת ליצור מספר רב של תרכובות בשלב מוצק ביעילות, סינתזה מפוצלת וברכה היא מועסק לעתים קרובות כאסטרטגיה כללית. כפי שניתן לראות בתרשים 4, tentagel חרוזים הם פיצול ראשון לשלושה חלקים. כל חלק הגיב במגיב שונה, שהניבו את השאריות הראשונות בחרוזים. לאחר התגובה הראשונה, כל שלוש המנות הם אספו יחד, מעורבבים, ולפצל ואז שוב לשלושה חלקים. כל מנה שוב תגיב עם מגיב שונה, שהניבו את השאריות השניה בחרוזים. אחרי שני צעדים מפוצלים וברכה, תשע תרכובות נוצרות.

בסינתזה תת מונומר, חרוזים מתחלקים לכמה חלקים ראשון להגיב עם חומצות bromo שונות בנוכחות של מגיב צימוד. לאחר שטיפה עם ממס, כל חרוזים יהיו אספו יחד ומעורב, ולאחר מכן חילקו שוב לכמה חלקים כדי להגיב עם שונהאמינים ראשוניים. לאחר amination, כל חרוזים הם אספו יחד ושטפו ביסודיות, שסיימו את מונומר מלא על כל חרוז. ניתן לחזור על תהליך זה עד שהוא הגיע גיוון רצוי.

2. הכנת חומצה ברומיד מטבעית חומצות אמינו

בסינתזה תת מונומר, הסינתזה של כל מונומר מחולקת לשני שלבים נפרדים: 1. צימוד במתיל החומצה ו2 amination עם אמינים ראשוניים (איור 2).. כדי לסנתז אמיד שיישוני פפטיד, קלישאות חומצת כיראליות עם שרשרות צד על פחמן אלפא יהיו מוכנות מחומצות אמינו טבעיות. כאן אנו מתארים את השיטה של ​​הפיכת חומצת אמינו טבעית למתיל בחומצה להתכתב עם נאמנות הגבוהה סטריאו. אנו משתמשים אלנין כדוגמא; חומצות אמינו אחרות, כולל סרין, תראונין, חומצה אספרטית, חומצה גלוטמית, asparagine, גלוטמין, גליצין, ולין, isoleucine, פנילאלנין יכול גם להפוך לחומצות bromo תחת conditio הדומהNS. שים לב שחלק מחומצות אמינו עם קבוצות פונקציונליות כמו פנול, guanidine ואמין צריך להיות מוגן לפני השינוי. הגדרת התגובה מוצגת באיור 3.

בטיחות זהירות: לתגובות הבאות מעורבים HBr, ננו ₂ וכימיקלים קורוזיביים אחרים / רעילים, ציוד בטיחות נאות כמו משקפי בטיחות, מעבדה מעיל, כפפות כימיות עמידות יש צורך. יש לבצע את כל התגובות במנדף ידי כימאי מנוסה.

1. הוספת 370 מיליליטר מים לתוך 630 מיליליטר 48% פתרון HBr כדי להכין 1 ליטר, פתרון HBr 30%. הוסף 500 גליקול מיליליטר אתילן לתוך מיכל אמבט 1 ליטר; להוסיף קרח יבש כדי לשמור על הטמפרטורה ב-10 ° C. זהירות: 48% פתרון HBr הוא מאוד חומצי ומאכל, להתמודד עם טיפול. קראו MSDS לפני השימוש.
2. הוספת D-אלאנין (8.9 גרם, 0.1 mol) וKBR (ז 11.9, 0.1 mol) למיליליטר בקבוק 250 שלושה צוואר עגול תחתון עם בר מערבבים מגנטי. הוספת 100 מיליליטר, וHBr 30% ערוכים tשלב קודם לו. שים את הבקבוק באמבטיה אתילן גליקול מוכן בשלב 2.1 ולשמור על הטמפרטורה ב-10 ° C. ארגון בועה באמצעות מחט ארוכה מהחלק התחתון של הבקבוק עבור 10 דקות כפי שמוצגת באיור 3. מערבבים את הפתרון עם בר מערבבים המגנטי ב300 סל"ד.
3. ממיסים Nano ₂ (ז 8.28, 0.12 mol) בכוס 100 מיליליטר עם 20 מיליליטר מים. להוסיף את הפתרון ללחץ השוואת משפך יורד ולאטום את המשפך יורד עם מחצה. להפוך לאט לאט על השסתום של משפך ההטלה ולתת פתרון Nano ₂ טיפה לתוך הבקבוק. לשלוט בשסתום להתאים את קצב הטפטוף של כ 2 טיפות לשנייה. שמור ערבוב ב300 סל"ד ולשמור על הארגון מבעבע מהחלק התחתון של הבקבוק. הבקבוק צריך להיות כל הזמן באמבטיה אתילן גליקול ב-10 ° C עד שכל ננו ₂ הוא הוסיף. זהירות: בשלב זה יוצר חום וגז בתוספת של ננו ₂ פתרון. שיעור נוטף צריך להיות בזהירות קוןמבוקר ואת המערכת כולה צריכה להיות פתוחה דרך שקע הארגון.
4. שמור ערבוב במשך 3 שעות יותר ולתת לטמפרטורה להתחמם מ-10 ° C לטמפרטורת חדר. הפתרון שהתקבל צריך להיות ברור לצהוב בהיר; אם הצבע כהה מדי, להחיל ואקום כדי להסיר את תחמוצות חנקן העודפות וBr האפשרי ₂ שנוצר במהלך התגובה.
5. חלץ את המוצר מהפתרון עם 3x 35 מיליליטר אתר diethyl באמצעות משפך לחילוץ. מערבבים את השלב האורגני ולשטוף אותו עם מלח רווי. השלב האורגני גם ניתן לכבס עם כמות קטנה של NaHCO ₃ לפני הכביסה עם מלח כדי להסיר את הצבע אם הוא כהה. ייבש את השלב האורגני על Na ₂ SO ₄ ל -6 שעות.
6. לסנן את Na ₂ SO ₄ ולהתאדות הממס תחת ואקום, יש לקבל מוצר גולמי כברור לחיוורים שמן צהוב. מוצר גולמי יכול להיות מטוהר נוסף על ידי זיקוק ב115 ° C, 3 מ"מ כספית, או על ידיעמודת סיליקה עם 03:01 הקסאן: אתיל אצטט.
7. מוצר טהור מתקבל כשמן ברור, 6.6 g (להניב 74%), צפיפות = 1.69 גר '/ מיליליטר, [α] D20 = +24 ° (מתנול), ¹ H NMR (400 MHz, CdCl ₃₎ δ 4.41 (q, J = 7.0 הרץ, 1H), 1.86 (ד, י = 7.0 הרץ, 3H). במקרה של (S)-2-bromopropanoic חומצת ד ₄ (שהוכן מד _{4-L-אלאנין),} מוצר טהור מתקבל כשמן ברור, תניב 78%, צפיפות = 1.72 גר '/ מיליליטר, [α] = D20 -19 ° (מתנול). ¹ H NMR, אין אות H משמעותית הוא ציין. ESI-MS ^- [M-1] ^- = 155.1 (צפויים 154.97). ל( S)--4-2-bromo methylpentanoic חומצה (שהוכנה מL-לאוצין באותו האופן) מוצר טהור מתקבל כשמן ברור, יניב 89%, [α] D20 = +37 ° (מתנול), ¹ H תמ"ג (MHz 400, CdCl ₃₎ δ 4.30 (t, J = 7.7 הרץ, 1H), 1.94 (dd, J = 10.8, 3.9 הרץ, 2H), 1.81 (tt, J = 13.2, 6.5 הרץ, 1H), 0.96 (Dd, J = 18.2, 6.6 הרץ, 7H). במקרה של (S)-2-bromo-3-pheחומצת nylpropanoic (שהוכן מL-פנילאלנין באותו האופן) מוצר טהור מתקבל כשמן צהוב בהיר, תניב 72%, [α] D20 = +17 ° (מתנול), ¹ H NMR (MHz 400, CdCl ₃₎ δ 7.38 - 7.19 (מ ', 5H), 4.42 (dd, J = 8.1, 7.3 הרץ, 1H), 3.47 (dd, J = 14.2, 8.2 הרץ, 1H), 3.25 (dd, J = 14.2, 7.2 הרץ, 1H).

3. תיוג איזוטופי של אלאנין שימוש טרנסאמינזות

בסינתזת ספרייה קומבינטורית, במיוחד בסינתזה מפוצלת והברכה של אחד מתחם ספריות חד חרוז (OBOC), בסכום של מתחם שניתן להשיג מכל חרוז הוא יחסית קטן. (בדרך כלל 1 pmol ל10 nmol). בנוסף, ספקטרומטריית מסה נעשתה שימוש נרחב לזיהוי והאפיון של המתחם הסופי בשל הרגישות הגבוהה שלה. על מנת להשתמש בספקטרומטריית מסה כדי לקבוע סטריאוכימיה המוחלטת במרכזי כיראליות של מוצרים ועד ההורים הסופיים, האננטיומרים חומצת bromo צריכים להיות isotoכותרת pically לפני השימוש. כאן אנו מתארים את השיטה של שימוש טרנסאמינזות ו-D ₂ O ל-L-אלאנין תווית.

1. ממיסים (300 מ"ג, 3.36 מילימול) L-אלאנין עם 10 מיליליטר של D ₂ O בצינור פוליאתילן 50 מיליליטר. הוספת α-ketoglutarate (10 מ"ג, 0.068 מילימול) כמו שיתוף מצע. לחמם את הצינור ל37 מעלות צלזיוס ולהתאים את פ"ד ל8.5-8.7 באמצעות soution 1 M NaOD. הערה: PD נקבע על ידי רצועות בדיקת ה-pH. מד pH אלקטרו מסורתי מצויד באלקטרודת זכוכית סלקטיבית לH ⁺ עשויה לתת שגוי הקריא ^ל+ D.
2. הוספת טרנסאמינזות אלאנין (0.1 מ"ג, EC 2.6.1.2 מלב חזיר, אבחון רוש, אינדיאנפוליס, אינדיאנה) ל8.5 PD - 8.7, 37 פתרון C ° הוכן מהשלב קודם. שים את הצינור ב37 מעלות צלזיוס חממת דגירה אותו הלילה עם רעד קל, 10-30 סל"ד הוא מועדף.
3. לאחר דגירה הלילה, לקחת 0.5 מיליליטר של הפתרון O D ₂ ולבדוק את התקדמות התגובה על ידי ¹ H-NMR. כל האותות של הפרוטוןlanine, δ 3.76 (Q, J = 7.2 הרץ, 1H), 1.46 (ד, י = 7.3 הרץ, 3H), ¹ MHz H NMR 400, צריך להיות מדוכא מאוד עקב deuteration. יותר מ 98% מהפרוטון צריכים להיות מוחלפים לדאוטריום כפי שתוארו לעיל ^23. הערה: D ₂ O ניתן לשחזר באופן חלקי על ידי זיקוק אם התגובה מתבצעת בקנה מידה גדולה (> 200 מיליליטר D ₂ O). בדרך כלל, 60% 80% D ₂ O ניתן לזקק מהפתרון.
4. להקפיא את הפתרון לעיל עם חנקן נוזלי וLyophilize באמצעות lyophilizer להשיג אבקת L-אלאנין deuterated לבן.

4. סינתזה של Peptoid לינקר אזור

אזור מקשר אינו נדרש לסינתזת ספרייה ועד הורים. עם זאת, על מנת להימנע מהרקע הגבוה בטווח הנמוך המשקל המולקולרי (100-600) של ספקטרוסקופית מסת MALDI ולשפר את היינון של התרכובות, משמש מקשר peptoid עם שאריות קוטב מרובות לעתים קרובות. זה peptoid ליןיכול להיות מסונתז משתכשך דרך הליך סינתזת peptoid סטנדרטי. כאן אנו לסנתז pentamer של גליצין N-methoxyethyl כמקשר (כפי שמוצג באיור 5).

1. להתנפח 90 מיקרומטר חרוזים Tentagel עם מקשר זיכרון RAM (1 גרם, 0.27 מילימול / גר ') ב10 מיליליטר DMF לשעה 3 בכור מזרק מיליליטר 12 עם רעד קל.
2. מסננים את DMF מהכור ולהוסיף 10 מיליליטר 20% פתרון DMF piperidine לdeprotect קבוצת Fmoc מהמקשר אמיד רינק. לנער את החרוזים עם 20% פתרון piperidine ל30 דקות. לשטוף עם DMF 5x כדי להסיר את כל piperidine.
3. קח כמה חרוזים מ המזרק ולבדוק את זה עם מבחן chloranil. חרוזים צריכים לפנות בצבע חום כהה (מבחן chloranil חיובי עבור אמין ראשוני) אם Fmoc הוא deprotected בהצלחה.
4. הכן את הפתרונות הבאים: 1. 20 מיליליטר, תמיסת החומצה / DMF bromoacetic 2 מ '; 2 20 מיליליטר, פתרון 2 M דסק"ש / DMF.; 3. 10 מיליליטר, 1 M methoxylethylamine / פתרון DMF.
5. הוסף 5 מיליליטר של 2 פתרון M bromoacetic חומצה / DMF לחרוזים, ללחוץ בעדינות. לאחר מכן להוסיף 5 מיליליטר של 2 פתרון M דסק"ש / DMF לחרוזים; לאטום את המזרק עם הבוכנה ולשים אותו על שייקר. Shake 10 דקות.
6. שטוף את החרוזים עם DMF ביסודיות. הוסף 2 מיליליטר של תמיסת 1 M methoxyethylamine / DMF הוכן מצעד 4.4 לחרוזים. חותם את המזרק עם הבוכנה ולנער אותו על שייקר ל30 דקות.
7. שטוף את החרוזים עם DMF 5x. בדוק כמה חרוזים עם מבחן chloranil, אם חיוביים (חרוזים להכחיל), ולאחר מכן להמשיך לשלב הבא. אחרת, חזור על שלב 4.6.
8. חזור על שלבים 4.5-4.7, 4x כדי להשלים את pentamer.

. 5 סינתזה פיצול וברכה של ספרייה ועד הורים עם (R) - ו( S)-2-bromopropionic חומצות

כאן אנו מתארים את הסינתזה של ספרייה ועד הורים קטנים עם מגוון תיאורטי של 9261 תרכובות באמצעות 1 גרם של חרוזים מצעד 4.8. שים לב שחרוז tentagel 90 מיקרומטר מכיל כ 2.9 מיליון חרוזים לגרם; לכן היתירות שלהספרייה תהיה 2.9 x 10 ^6/9261 = 312 עותקים. אנו נשתמש בחומצת bromoacetic, (R)-2-bromopropanoic ואיזוטופי שכותרתו (S)-2-bromopropanoic חומצת ד ₄ כחומצות, ו7 אמינים שונים (A1 ~ A7, ראו איור 5 לפרטים נוספים) לamination. כורי מזרק וסעפת ואקום ישמשו כדי לבצע את הסינתזה.

1. הוסף 10 מיליליטר של 1:1 DCM: DMF למזרק מצעד 4.8; להשתמש פיפטה 1,000 μl עם קצה פיפטה קטוע לפצל את כל חרוזים 1 גרם באופן שווה לשלושה כורי מזרק 5 מיליליטר. לתייג אותם כB (חומצת bromoacetic), R ((-2-bromopropanoic) R) ו-S ((S)-2-bromopropanoic חומצת ד _4). לשטוף את כל 3 המזרקים עם 3x DCM, ולשטוף את המזרקים שכותרתו עם R ו-S עם THF 3x נטול מים, לשטוף את המזרק שכותרתו עם B עם 3x DMF.
2. R מזרק ו-S. צימוד BTC של חומצת bromopropanoic.
   1. הכן פתרון BTC / THF טרי. הוספהpproximately 200 מ"ג של BTC לתוך הבקבוקון במנדף, לאטום אותו עם הכובע. לשקול את הכמות של BTC בבקבוקון. לחשב את כמות הממס הדרושה ולהוסיף THF נטול מים לתוך הבקבוקון לעשות 20 מ"ג / פתרון BTC / THF מיליליטר.
   2. הכן את / תערובת חומצות BTC bromo. הוספת חומצה (R)-2-bromopropanoic (89 μl, 0.95 מילימול) ו( S)-2-bromopropanoic חומצת ד ₄ (μl 89, 0.95 מילימול) בשני בקבוקונים קטנים בנפרד. לכל בקבוקון, מוסיף 5 מיליליטר של פתרון 20 מ"ג / מיליליטר BTC / THF לעיל. לאטום שני בקבוקונים ולשים אותם במקפיא -20 ° עבור 20 דקות.
   3. הוספת 1,125 μl, 2:1 THF / DIPEA (750 THF μl, 375 DIPEA μl, 2.2 mmol) למזרק R ו-S בנפרד. מערבבים את חרוזים עם קצה פיפטה. תן להם לשבת במשך 5 דקות.
   4. קח שני מקוררים חומצות bromo / תערובות BTC מהצעד 5.2.2, להוסיף 2,4,6-Trimethylpyridine (356 μl, 2.7 mmol) לכל מבחנות. משקעים לבנים יהוו באופן מיידי. החל את ההשעיה המקבילה ישירותלחרוזי basified (R מזרק ו-S בצעד 5.2.3) בהקדם האפשרי ולאחר מכן לשים אותם על שייקר לנער מתחת 120 סל"ד במשך שעה 2.
      הערה: הפתרון בכורי המזרק צריך להיות השעיה צהבהבה חיוורת במהלך הקורס כולו של התגובה. צבע כהה הוא סימן לחום גבוה שפורסם במהלך בנוסף הראשוני של פתרון כלוריד החומצה. זה יכול להיפתר על ידי הרגעות נוספות או לדלל את / תערובת חומצות BTC bromo.
3. מזרק ב '. צימוד חומצת Bromoacetic עם דסק"ש
   1. הכן 20 מיליליטר טרי, תמיסת חומצת bromoacetic 2 M / DMF. הכן 20 מיליליטר, פתרון 2 M דסק"ש / DMF.
   2. הוסף 2 מיליליטר של תמיסת החומצה 2 / DMF bromoacetic M למזרק B, לנער בעדינות. הוסף 2 מיליליטר של תמיסת 2 M דסק"ש / DMF למזרק B, לנער בעדינות.
   3. שים את המזרק ב 'באותו שייקר כR מזרק ו-S , לנער אותו במשך שעה 2. שים לב שתגובת הצימוד של חומצת bromoacetic / דסק"ש נעשית בתוך 30 דקות; זמן תגובה ממושך הוא לנוחיות של סינתזה מפוצלת וברכה.
4. לאחר 2 שעות, לקחת R מזרק, S ו-B שמייקר. שטוף את כל שלושת המזרקים ביסודיות עם DCM 5x. לאחר מכן לשטוף עם DMF 5x. שים לב שR המזרק ו-S לא ניתן לכבס עם DMF לפני שנשטף עם DCM או THF הראשון.
5. בריכה את כל החרוזים ממזרקים R, S ו-B לכור מזרק מיליליטר 12 אחד. שטוף את כל החרוזים עם DMF 5x.
6. הוסף 10 מיליליטר של 1:1 DCM: DMF למזרק; להשתמש פיפטה 1,000 μl עם קצה פיפטה קטוע לפצל את כל החרוזים באופן שווה ל7 2 מיליליטר מזרקים בודדים, לתייג אותם כA1-A7.
7. Amination. הכן 10 מיליליטר, 2 פתרונות האמינים / DMF עיקריים M עבור כל אחד מ -7 האמינים מופיעים באיור 5. הוסף 5 מיליליטר של EACפתרון אמין שעות למזרק המתאים A1-A7. דגירה כל 7 המזרקים בחממה 60 ° C עם רעד הלילה.
8. לאחר דגירה, לשטוף את כל חרוזים ביסודיות עם DMF. קח כמה חרוזים ממזרק ולבדוק עם מבחן chloranil. אם חרוזים הופכים לירוקים (חיובי) בתוך 3 דקות, המשך לשלב הבא. אם שלילי, חזור על שלב 5.7 למזרקים השליליים.
9. חזור על שלבים 5.1-5.8 2x כדי להשלים את trimer. שלב אופציונאלי: לאחר כל מחזור, אנו ממליצים לבדוק את איכות הסינתזה ידי ספקטרוסקופית מסה כפי שיתואר להלן. כל 9261 תרכובות החברה מסונתזים בחרוזי tentagel כספריית OBOC.
10. אישור ספקטרוסקופיות המוני של PTAs.
    PTAs הוא oligomers מובנה מאוד ויש הרבה תכונות משותפות של פפטידים מפוגלים-N. אחת הבעיות הנפוצות של סינתזת שלב מוצקה של פפטידים מפוגלים-N הוא השפלה החומצה במהלך מחשוף TFA. כדי לדכא השפלה חומצה, מחשוף של מולקולות כמו ציקלוספורין מתמיכה מוצקה מתבצעת לעתים קרובות מתחת לטמפרטורה נמוכה. אנחנו לעומת תנאי ביקוע שונים לביקוע מולקולות ועד הורים שונים מהתמיכה מוצקה. מצאנו כי, בדרך כלל, בטמפרטורה נמוכה וריכוז TFA מופחת יכולים יעילות לדכא השפלה חומצה ולספק תרכובות טהורים יותר.
    1. הכן 10 מיליליטר 1:01 פתרון TFA / DCM בצינור 15 מיליליטר. לאטום את הצינור ולשים אותו ב-20 ° C מקפיא למשך 20 דקות.
    2. שטוף את החרוזים שצריכים להיות ביקע עם DCM 5x. לנער את חרוזים בDCM במשך 15 דקות ולשטוף את החרוזים שוב עם DCM 5x.
    3. מסננים את DCM מהמזרק. השתמש במיקרוסקופ אור ופיפטה עם קצה קטום להעביר כל חרוז בודד לתוך צלחת 96 היטב, חרוז אחד בכל טוב.
    4. מכסה את צלחת 96 היטב עם להחליק את מכסה. שים את הצלחת ב-20 ° C במקפיא במשך 15 דקות.
    5. קח את פתרון TFA / DCM מקורר 1:01 מהצעד 5.10.1 ולהוסיף 20 μl לכל אחת מהבארות המכילה חרוז. שים להחליק את המכסה אחורי וpuלא צלחת 96 היטב על שייקר ב-20 ° C המקרר.
    6. Shake עבור 20 דקות. קח את צלחת 96 היטב החוצה ולהתקלף להחליק את המכסה. Blow-לייבש את TFA / DCM מכל טוב על ידי נשיפת אוויר או ארגון על זה. אם יותר מ10 חרוזים הם ביקע, speedvac יכול לשמש לייבוש TFA / DCM מהצלחת כולה. שים לב כי בשלב זה, לא כל התרכובות הם ביקע את חרוזים, אבל התרכובות ביקע צריכה להיות יותר ממספיק כדי לבצע את ניתוח ספקטרוסקופית מסה.
    7. הוסף 20 μl 6:04 ACN: H ₂ O פתרון לפזר התרכובות ביקע מכל טוב. ספוט 0.6 μl של כל פתרון מתחם יחד עם 0.6 μl מטריצת CHCA MALDI על צלחת MALDI.
    8. השתמש בספקטרומטריית מסת MALDI כדי לקבוע את המשקל המולקולרי ורצף (MS / MS) של כל מתחם.

6. מבחן Chloranil

1. הכן את ריאגנטים הבאים טריים עבור כל בדיקה. פתרון: Chloranil 2% (CAS: 118-75-2) בDMF. פתרוןB: אצטאלדהיד 2% (CAS: 75-07-0) בDMF.
2. שילוב של פתרון עם הפתרון של B 100 μl 100 μl לפני הבדיקה בצינור 1.5 מיליליטר; שחרר את חרוזים ובעדינות לנער. אם חרוזים להכחיל תוך 5 דקות, זה מעיד על קיומו של אמין המשני על פני השטח של חרוזים. אמינים ראשוניים נותנים צבע חום כהה במקום להכחיל.

תוצאות

כאן אנו מראים שלושה ספקטרום MALDI נציג מtrimer עד הורים עם מקשר. כפי שניתן לראות באיור 6 א, כשבקע תחת טמפרטורת חדר באמצעות 50% פתרון TFA / DCM, השפלה משמעותית הוא ציין. באיור 6 א, שיא 593 ו484 מתאימות למקשר וtrimer עד הורי בהתאמה, מראים כי כל המולקולה הייתה מסונתזת בהצלח...

Discussion

אורגני חיבור פפטיד שיישונים (PTAs) הוא superfamily של oligomers peptidomimetic. חוץ מפפטידים למדו היטב, peptoids ופפטידים מפוגלים-N, חלק גדול מתרכובות בתוך משפחה זה נשאר understudied, majorly עקב חוסר השיטה סינתטית לגשת פפטידים N-alkylated כלליים. כאן אנו מתארים שיטה יעילה לסנתז PTAs עם אבני בניין כיראליות נ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,4,6 trimethylpyridine	ACROS	161950010	CAS:108-75-8
2-morpholinoethanamine	Sigma-Aldrich	06680	CAS:2038-03-1
48% HBr water solution	ALFA AESAR	AA14036AT	CAS:10035-10-6
Acetaldehyde	Sigma-Aldrich	402788	CAS:75-07-0
Acetonitrile	Fisher	SR015AA-19PS	CAS:75-05-8
Anhydrous tetrahydrofuran (THF)	EMD	EM-TX0277-6	CAS:109-99-9
Benzylamine	Sigma-Aldrich	185701	CAS:100-46-9
bis(Trichloromethyl) carbonate (BTC)	ACROS	258950050	CAS:32315-10-9
Bromoacetic acid	ACROS	106570010	CAS:79-08-3
Chloranil	Sigma-Aldrich	23290	CAS:118-75-2
Cyclohexanemethylamine	Sigma-Aldrich	101842	CAS:3218-02-8
D2O	Cambridge Isotope	DLM-4-99.8-1000	CAS:7789-20-0
D-Alanine	Anaspec	61387-100	CAS:338-69-2
Dichloromethane (DCM)	Fisher	BJ-NS300-20	CAS:75-09-2
Dimethylformamide (DMF)	Fisher	BJ-076-4	CAS:68-12-2
Ethylene glycol	Oakwood	44710	CAS:107-21-1
Isopentylamine	Sigma-Aldrich	W321907	CAS:107-85-7
KBr	ACROS	424070025	CAS:7758-02-3
L-Alanine	Anaspec	61385-100	CAS:56-41-7
3-Methoxypropylamine	Sigma-Aldrich	M25007	CAS:5332-73-0
2-Methoxyethylamine	Sigma-Aldrich	143693	CAS:109-85-3
N-(3-Aminopropyl)-2-pyrrolidinone	Sigma-Aldrich	136565	CAS:7663-77-6
N,N'-Diisopropylcarbodiimide (DIC)	ACROS	115211000	CAS:693-13-0
N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA)	Sigma-Aldrich	D125806	CAS:7087-68-5
NaNO2	ACROS	424340010	CAS:7631-99-4
NAOD 40% solution in water	ACROS	200058-506	CAS:7732-18-5
Piperidine	ALFA AESAR	A12442-AE	CAS:110-89-4
Piperonylamine	Sigma-Aldrich	P49503	CAS:2620-50-0
Propylamine	Sigma-Aldrich	240958	CAS:107-10-8
Trifluoroacetic acid	Sigma-Aldrich	299537	CAS:76-05-1
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid	Sigma-Aldrich	39468	CAS:28166-41-8
α-Ketoglutarate	ALFA AESAR	AAA10256-22	CAS:328-50-7
Tentagel Resin with RINK linker	Rapp-Polymere	S30023
Alanine transaminase	Roche	10105589001	AKA: Glutamate-Pyruvate Transaminase (GPT)
Incubator	New Brunswick Scientific	Innova44
NMR	Bruker	400 MHz
MALDI mass spectrometer	Applied Biosystems	4800 MALDI-TOF/TOF
Lyophilizer	SP Scientific	VirTis benchtop K
Syringe reactor	INTAVIS	Reaction Column	3 ml, 5 ml, 10 ml, 20 ml
Vacuum manifold	Promega	A7231	Vac-Man