Bioenergetics וחמצוני פרץ: הפרוטוקולים לבידוד ולהערכה של לויקוציטים אדם וטסיות הדם

Summary

כדוריות דם לבנות וטסיות דם יכולים לשמש כסמן לבריאות bioenergetic הכללי של אדם ולכן יש לו את הפוטנציאל לפקח על תהליכים פתולוגיים ואת ההשפעה של טיפולים. כאן אנו מתארים שיטה לבודד ולמדוד את תפקוד המיטוכונדריה ופרץ חמצוני בתאים אלה.

Abstract

תפקוד המיטוכונדריה ידוע לשחק תפקיד משמעותי במספר מצבים פתולוגיים כגון טרשת עורקים, סוכרת, הלם ספטי, ומחלות ניווניות אך הערכת שינויים בתפקוד bioenergetic בחולים מאתגרת. למרות שמחלות כמו סוכרת או טרשת עורקים הנוכחית קליניות עם ליקוי איבר מסוים, רכיבים מערכתיים של פתולוגיה, כגון היפרגליקמיה או דלקת, יכולים לשנות את תפקוד bioenergetic במחזור לויקוציטים או טסיות דם. תפיסה זו זכתה להכרה לכמה זמן, אבל היישום הנרחב שלה כבר מוגבל על ידי המספר הגדול של תאים ראשוניים הנדרשים לניתוח bioenergetic. מגבלה טכנית זו כבר להתגבר על ידי שילוב ספציפי של הטכניקות מגנטי בידוד חרוז, טכניקות הידבקות תא, המאפשרות לתאים שיצורפו ללא הפעלה לmicroplates, והרגישות של טכנולוגיות חדשות המיועדות למיקרופון תפוקה גבוההrespirometry roplate. דוגמא לציוד זה היא מנתח השטף תאי. מכשור כזה משתמש בדרך כלל בדיקות רגישות חמצן וה-pH למדידת שיעורי השינוי בפרמטרים האלה בתאים חסיד, אז מה שיכול להיות קשור לחילוף חומרים. כאן אנו מפרטים את השיטות לבידוד והציפוי של מונוציטים, לימפוציטים, נויטרופילים וטסיות דם, ללא הפעלה, מהדם של בני אדם והניתוח של תפקוד bioenergetic המיטוכונדריה בתאים אלה. בנוסף, אנו מדגימים כיצד חמצוני פרצו במונוציטים ונויטרופילים יכולים גם להימדד בדגימות אותו. מאז שיטות אלה להשתמש רק 8-20 מיליליטר דם אדם שיש להם פוטנציאל לניטור דור חמצן מגיב מינים וbioenergetics בסביבה קלינית.

Introduction

ניטור בריאות bioenergetic של תאים חיסוניים (מונוציטים, לימפוציטים, נויטרופילים) וטסיות דם מהוכר במשך זמן מה ככלי אבחון שעשוי להיות שימושיים כדי להעריך את בריאות bioenergetic הכללית של אדם. יש גוף מתעוררים של ספרות מייחס מספר המחלות כגון סרטן, מחלות לב וכלי דם ומחלות ניווניות ^ל1,2 תפקוד המיטוכונדריה. זה חשוב מבחינה קלינית מאז תפקוד המיטוכונדריה יכול ליזום סדרה של אירועים הסלולר שיקדמו מסלולי איתות הפרו דלקתיים או להוביל למוות של תאים. מספר מחקרים מאופיינים תפקוד המיטוכונדריה של תאים היקפיים mononuclear הדם וטסיות דם במצבים כגון פיברומיאלגיה, סוכרת, הלם ספטי, והמחלה ^3-7 אלצהיימר. לדוגמא, מחקר שנערך לאחרונה העריך את bioenergetics של טסיות דם כסמן לתפקוד המיטוכונדריה ומצא כי טסיות דם מסוג 2 Diabetחולי ic פחתו ^7,8 צריכת החמצן במיטוכונדריה. מממצאים אלה ואחרים, ברור שמונוציטים, לימפוציטים, נויטרופילים, וטסיות דם יכולים לשמש כסמנים פונדקאיות כשינויים בbioenergetics תחת מצבים פתולוגיים שכן הם יסקור את מחזור הדם המערכתי ועשויים לשקף שינויים מטבוליים מקומיים והעולמיים. כדי לקבוע אם גישה זו יש ערך פרוגנוסטי או אבחון בשיטת תפוקה גבוהה של ניתוח ושיטה עקבית להכנת תא נדרשת.

השיטות כדי למדוד את התפקוד המיטוכונדריה בלויקוציטים וטסיות דם שמעורבים בעבר בידוד של המיטוכונדריה או הערכה של bioenergetics הסלולר בתאים שלמים ^4,9. היתרון של הערכת bioenergetic הסלולרית באמצעות שטף תאי מנתח (XF) הוא שהפונקציה של המיטוכונדריה בתאים ניתן להקים עם מצעי אנדוגני ופרמטרי נשימה כגון דליפת פרוטון ונשימה מקסימליקיבולת ניתן לקבוע. אנו ואחרים השתמשו בטכנולוגיה זו כדי להראות שפרופילי bioenergetic בטסיות דם, ניתן להקים מונוציטים ולימפוציטים מבודדים מהדם של בני אדם והשוואה בין סוגי תאים ^8. בנוסף, שניהם נויטרופילים ומונוציטים בעלי קיבולת פרץ חמצוני בי oxidases NAPDH מופעלים וצורכים חמצן ליצירת superoxide. חשוב מכך, מסלול זה הוא מרכיב מרכזי של חסינות מולדת, והוא מווסת על ידי דלקת מערכתית. לדוגמא, זה כבר הראה כי שינויים בקיבולת פרץ חמצוני קשורים עם מחלות אוטואימוניות שונות, כגון טרשת נפוצה, דלקת פרקים, וזיהומים חוזרים ונשנים ^10,11. כרגע אין מבחני כמותיים תפוקה גבוהה זמינים כדי למדוד את פרץ חמצוני בדגימות קליניות. זה חשוב מכיוון שמאפיין את קיבולת פרץ חמצוני של נויטרופילים ומונוציטים יכולים גם לשמש ככלי אבחונים חשובים מכמה patholoחיס.

האתגרים הטכניים המפתח היו רגישות נמוכה למדידה של צריכת חמצן תוך שימוש בטכניקות polarographic קונבנציונליות ואת הצורך להשתמש בתאים מצורפים בעת שימוש בטכניקות fluorometric microplate רגישות יותר. בסרטון מעשי זה, אנו מתארים את הפתרון הטכני לבעיות אלו. אנחנו פירוט השיטות לבידוד, ציפוי והמדידה של bioenergetics של מונוציטים, לימפוציטים, נויטרופילים, וטסיות דם ופרץ חמצוני של מונוציטים ונויטרופילים מהדם אנושי. שיטה זו מתאימה להערכה קלינית של bioenergetics ופרץ חמצוני לחוקרים שיש להם גישה לאוכלוסייה מטופלת ואת היכולת להשיג דגימות דם טריות.

Protocol

כל הפרוטוקולים שתוארו בכתב היד הזה לאיסוף דם, בידוד וניתוח כבר נבדקו ואושרו על ידי דירקטוריון סקירה המוסדי באוניברסיטת אלבמה בבירמינגהם.

1. בידוד תא (השתנה מHistopaque סיגמא אולדריץ פרוטוקול מס 1119 וMiltenyi יוטכנולוגיים microbead חיובי ופרוטוקולי סלקציה שליליים)

1. דם צנטריפוגה כולו (שנאסף בACD או צינורות EDTA) בשעה XG 500 במשך 15 דקות בצנטריפוגה עם הרוטור מתנדנד דלי (תאוצה = 5-6, ולא בלם).
2. להסיר את השכבה העליונה המכילה פלזמה העשירה טסיות (PRP) עם טפטפת העברה עד 1 סנטימטר נשאר מעל שכבת התאים (מעיל כדורית אדומה / באפי). מניח בצד PRP בטמפרטורת חדר לעיבוד מאוחר יותר.
3. העבר את המעיל באפי לצינור חרוטי 50 מיליליטר סטרילי, לדלל ל24 מיליליטר עם RPMI הבסיסי או לפחות 4x מתחיל באפי מעיל הנפח.
   הערה: חיצו העליון של שכבת RBC עשוי have להיכלל אם כי זה יגרום להגדלת נפח RPMI באופן יחסי.
4. הכן את שיפוע הצפיפות באמצעות צפיפות נמוכה Ficoll עם משקל סגולי של 1.077 (1077) לשכבה העליונה וFicoll צפיפות הגבוהה עם משקל סגולי של 1.119 (1119) לשכבה התחתונה בשלושה צינורות 15 מיליליטר חרוטי (3 מיליליטר כל אחד). כדי לבצע שלב זה, להוסיף ראשון 1077 לצינור אחד. בעזרת פיפטה צרה 5 מיליליטר להוסיף 1119 לחלק התחתון של הצינור על ידי הצבת קצה פיפטה מתחת 1077 ולאט לאט לשחרר מגיב ללא ערבוב עם השיפוע העליון. סכום כולל של 6 מיליליטר של תקשורת שיפוע צפיפות צריך להיות נוכח בשלב זה עם שלב גלוי של הפרדה בסימן מיליליטר 3.
5. באמצעות פיפטה אוטומטית, להוסיף 8 מיליליטר של דם מדולל (משלב 1.3) בעדינות על צינור אחד שיפוע באמצעות הגדרת צריכת החשמל הנמוך כדי למנוע מלהפריע לשכבות הצבע. הנפח הכולל צריך להיות 14 מיליליטר בשלב זה.
6. צינורות צנטריפוגה ב XG 700 ל30 דקות בטמפרטורת חדר (acceleמנה 6, לא בלם).
   הערה: בשלב זה, שלוש להקות תא נפרדות צריכים להיות (איור 1 א) מאליו. הלהקות העליונות (בין 1077 ופלזמה) מכילה תאים חד גרעיניים (MNC) וטסיות דם, והלהקה באמצע (בין 1007 ו1119) מכיל תאי polymorphonuclear (PMNs) ורצועה תחתונה (מתחת 1119) מכיל תאי דם אדומים.
7. לאסוף את MNC וPMN בנפרד באמצעות טפטפות זכוכית סטרילית מבלי להפריע להקות תא האחרות. לשלב את אוכלוסיית MNC מצינור לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר סטרילי. חזור על פעולה זו עבור אוכלוסיית PMN גם כן.
8. הוסף 4 כרכים של RPMI על צינור אחד המכיל את השברים MNC וPMN בהתאמה לדלל את שיפוע הצפיפות.
9. צינורות צנטריפוגה ב XG 700 ל10 דקות בטמפרטורת חדר.
10. גלולה resuspend MNC תא ותא גלולה PMN בRPMI 1 מיליליטר מכיל 0.5% אולטרה טהור שומן נטול חומצת BSA (RPMI-BSA) ולהעביר לסטרילי 1.5 צינורות מיליליטר. גלולה התאים באמצעות picofuge המעבדתיים ל30שניות.
11. בטל supernatant ו resuspend כל גלולה תא ב80 μl RPMI-BSA.
12. הוסף 20 μl של נוגדן שכותרת antiCD14 חרוז המגנטי לצינור המכיל את חלק MNC לסלקציה חיובית של מונוציטים. לצינור המכיל את החלק היחסי של תאי PMN, להוסיף 20 μl של נוגדן שכותרת antiCD15 חרוז המגנטי לסלקציה חיובית של נויטרופילים. דגירה כל השעיה תא ל15 דקות ב 4 º C.
13. לשטוף כל השעיה תא עם 1 מיליליטר תקשורת RPMI-BSA וגלולה כמו קודם וresuspend כל גלולה ב500 μl RPMI-BSA.
14. תאי שכותרתו מופרדים בשדה המגנטי של תא מגנטי מיון הפעיל מפריד (MACS). הכן את עמודות LS MACS (אחד לכל השעיה תא) על ידי הצבת הטור על מפריד MACS וכביסה עם 3 מיליליטר של RPMI-BSA לפני הוספת ההשעיה התא.
15. לאחר החלת השעיות תא, לשטוף כל עמודה 3x עם 3 מיליליטר של תקשורת RPMI-BSA (לוודא לתת דראי התקשורתn בין שוטף לחלוטין). אסוף את ההשעיה תא זרימה דרך שטיפות עמודה לתוך צינור סטרילי.
16. כדי לבודד מונוציטים ונויטרופילים, להסיר את העמודה מהשדה המגנטי לאחר לשטוף הסופי וelute התאים חיובי שנבחרו לתוך צינור סטרילי עם 5 מיליליטר של RPMI-BSA באמצעות בוכנת העמודה.
17. כדי לבודד ימפוציטים גלולה שבריר זרימה דרך השטיפה של MNCs מצעד 1.15 XG 300 10 דקות. בטל supernatant ו resuspend התא גלולה ב μl 80 RPMI-BSA. הוסף 20 μl של נוגדני CD61 וCD235a דגירה תא השעיה ל15 דקות ב 4 º C. חזור על הפרדת MACS כמו קודם ולאסוף את הזרימה למרות שמכיל לימפוציטים.
18. כדי גלולה מונוציטים, נויטרופילים, ושברים לימפוציטים, צנטריפוגות כמו קודם (שלב 1.9) וזורקים supernatants. כדורי תא צריכים להיות מושעים ב 1 מיליליטר תאי שטף תקשורת (XF-DMEM) לספירה.
    הערה: 8 מיליליטר של דם מלא צריך לגרום 1-5 x 10 ⁶ מיליליטר מונוציטים / ו5-20 x 10 ימפוציטים ⁶ ונויטרופילים / מיליליטר.
19. כדי לבודד טסיות דם, PRP צנטריפוגה (שלב 1.2) עבור 8-10 דקות ב 1,500 XG בטמפרטורת חדר. הסר את הפלזמה ולשטוף תא גלולה פעם אחת עם 5 מיליליטר סטרילי PBS בתוספת 1 ​​מיקרוגרם / מיליליטר PGI _2, repellet ולהשעות גלולה סופית ב 1 מיליליטר של PBS-PGI חיץ _2.
20. לקבוע ספירת הטסיות על ידי turbidimetry פעם טסיות מושעות ב-PBS-PGI חיץ ₂ על ידי ספקטרופוטומטר כפי שתוארו על ידי Walkowiak אח' באמצעות המשוואה הבאה: [6.23 / (2.016 - אבס _800)] - 3.09 גורם לדילול x = # x 10 ^8. טסיות דם / מיליליטר ^12.

2. ציפוי של התאים

1. הכנת Cell-Tak (דבק תא): הוסף דבק תא 90 μl 180 μl diH ₂ 0, 540 μl של 0.1 N דו נתרןקרבונט (pH 8.0), ולהתאים את ה-pH ל 7.2-7.8 באמצעות 1 N NaOH. הכן את צלחות XF (24 גם, V7 microplates) על ידי ציפוי היטב עם כל 30 μl של דבק תא מוכן.
   הערה: דבק התא צריך להיות מוכן טרי לכל שימוש.
2. דגירה צלחת על 37 º C ל20-30 אז דבק תא לשאוב דקות ולשטוף בארות עם PBS פעמיים (1 מיליליטר / טוב).
3. לבצע ספירת תאים במונוציטים המבודדים, לימפוציטים, נויטרופילים וטסיות דם ומביא לנפח מתאים באמצעות XF-DMEM כדי לאפשר צפיפות זריעה של 250k תאים / גם למונוציטים, לימפוציטים, נויטרופילים ו, ו25 x 10 ⁶ / גם לטסיות דם. לחלופין, כדי למדוד את תגובת פרץ חמצוני, ניתן זורעים הנויטרופילים ב125k תאים / היטב. זריעת הנפח הסופי עבור כל השעיה תא צריך להיות 200 μl / טוב.
4. צנטריפוגה את הצלחת ב XG 200 ל1 שניות ללא בלם. סובב את הצלחת 180 ˚ ו צנטריפוגות שוב עם בלם לא ב300 x גרם.
5. להביא כרך גם סופיUme ל660 μl עם XF-DMEM ולדגור על 37 º C למשך 30 דקות לפני assay XF. הערה: Photomicrographs של תאים מצופים לפני ואחרי assay יכול לשמש כדי להבטיח ציפוי הולם ולשלול ניתוק תא.

3. הכנת 24 גם פלייט התאי השטף Assay (XF24)

1. מימה XF בדיקות עם פתרון calibrant למינימום של 2 שעות לפני assay.
2. הכן 10x מניות של 0.5 מיקרוגרם / מיליליטר oligomycin, 0.6 מיקרומטר FCCP, ו10 מיקרומטר antimycin בXF-DMEM ועומס 75 μl של פתרונות מניות ליציאות הזרקת דיו בצו הנ"ל. אם מדידות פרץ חמצוני הן שיתקבל, הזרקה של 10x המניה של 100 PMA מיליליטר / ng ניתן להזריק אחרי antimycin-.
3. כייל את מחסנית התייבשות וטעונה ולבצע את assay XF. השיטות מפורטות לניתוח ופרשנות של שינויים הן את צריכת החמצן וחומציות תוארו בפרסומים קודמים ^9,13,14 ואינם דiscussed בפירוט כאן.
4. לאחר assay XF, לשאוב את כל אבל 50 μl האחרון של XF-DMEM אחרי assay כדי למנוע אובדן של תאים מהצלחת ולהוסיף 50 מאגר תמוגה תא μl הריף ולבצע assay חלבון לנורמליזציה.

תוצאות

על מנת להעריך bioenergetics של תאי דם, כל דם שנאסף מבני אדם על ידי venipuncture בצינור איסוף Vacutainer EDTA או ACD. הבידוד של לויקוציטים וטסיות דם הבא איסוף דם הוא מדמיין באיור 1 א כמפורט בפרוטוקול. דגימות דם כולו מעובדות בתוך 8 שעות של אוסף, כדי למנוע מוות של תאים והפעלה. זמני אחסון מורחבים יותר מ -8 שעות לא נבדקו אך עלול לגרום לbioenergetics שינו ולהיות פחות נציג של תנאים פיסיולוגיים. צינורות דקסטרוז החומצה ציטראט (ACD-8 מיליליטר) וVacutainer EDTA שימשו במשך בידודי תא עם כל השפעה שנצפתה בתפקוד bioenergetic של תאים מבודדים. תרופות נגד קרישת דם נחוצות כקרישים לצמצם את מספר התאים שהושגו, להפריע להיווצרות שלב הנכון במהלך צנטריפוגה שיפוע Ficoll, ולגרום לא מעט טסיות דם שהושגו בסרום centrifuged. כל הדם מייצג Biologמפגע iCal וציוד מגן אישי מתאים חייבים להיות מיושמים לאורך כל ההליך גם לאחר אוכלוסיות תאים מבודדות או lysates תא נוצרים. דוגמאות הן להיות מסולקים בהתאם לתקני הסילוק פסולת האנושיים של המוסד.

כל הדם הוא centrifuged להפריד הפלזמה העשירה טסיות מהמעייל באפי, השכבה הלבנה שמעל תאי הדם האדומים ארוזים המכילה כדוריות הדם לבנות. המעיל באפי מוחל הדרגתיים בצפיפות וcentrifuged להשיג תאי הדם ההיקפיים mononuclear (מונוציטים ולימפוציטים) ותאי polymorphonuclear (גרנולוציטים). זיהום RBC של שלבי תא הבודדים MNC וPMN הוא שכיח בשלב זה וצריך להיפתר במהלך טיהור MACS. לאחר מכן סוגי התאים השונים מתקבלים על ידי דגירה עם נוגדנים מגנטיים כדי להשיג שברים טהורים. מונוציטים נאספים על ידי דגירה של שבריר PBMC עם CD14, הזרימה דרך מtהוא מונוציטים להכיל לימפוציטים, אשר לאחר מכן מתרוקנים RBCs וטסיות דם. נויטרופילים מתקבלים על ידי דגירה של שכבת תאי polymorphonuclear עם נוגדן CD15 (איור 1 א). לאחר מכן, ניתן pelleted טסיות הדם על ידי צנטריפוגה של הפלזמה העשירה טסיות ורחצו להסיר רכיבי פלזמה אחרים. לאחר בחירות אלה טסיות הדם, CD14 + מונוציטים, לימפוציטים, ניתן לספור CD15 + נויטרופילים ומצופים על צלחת הידבקות תא מצופה בינונית XF מנתח לbioenergetics וניתוח פרץ חמצוני.

כל שלב של ההליך צריכה להתבצע בתנאים סטריליים והוא עודד כדי למנוע את ההפעלה המוקדמת של תגובת פרץ חמצוני במונוציטים ונויטרופילים. אינדיקטור של פחות מתנאים סטריליים בבידוד לידי ביטוי כאשר הנויטרופילים, שבו יש לא מעט צריכת חמצן בתנאים בסיסיים, להתחיל assay השטף תאי עם מדידות OCR גבוהות שלהגדיל בהדרגה או לדחות לאורך assay. אנו מדגישים את החשיבות של תאי הדמיה באמצעות מיקרוסקופ אור ב200X או גדול יותר כדי לוודא ששום סימנים מורפולוגיים של הפעלה התרחשו לפני assay. לדוגמא, בדרך כלל להציג נויטרופילים מעוגלים לצורה לא סדירה עם גבולות תא בולטים כפי שניתן לראות באיור 1. עם זאת, תאים אלו יהיו לרדד על המשטח של הצלחת כאשר מופעלים ולאבד את המורפולוגיה של התאים שונה שלהם. יש לנו הדיווח בעבר השינויים מורפולוגיים של לויקוציטים וטסיות דם מופעל באמצעות פרוטוקול זה ויש לנקוט בצעדים נוספים כדי להבטיח תנאים סטריליים, אם נתקלים בהפעלה ^8.

ערכה פשוטה של הפרוטוקול ניתן לראות באיור 2 כלוח זמנים שבו הצעדים הראשוניים של בידוד התא, הכנת צלחת XF, וassay XF הם מפורטים. בידוד מורכב מהפרדת שיפוע הצפיפות של סוגי תאים וואחרי הפרדה מגנטית. במקביל לתהליך בידוד תא, הכנת צלחת XF היא הכרחית כדי למנוע עיכובים בציפוי תא או תחילת assay XF. זה קריטי, כי עיכובים משמעותיים יכולים להוביל להפעלת תא ופרמטרי bioenergetics פחתו.

ריכוזי תא לקויים לאחר הבידוד הם בעיה ואופטימיזציה של כל תהליך צנטריפוגה נפוצה היא נחוצה כדי למנוע אובדן תא. בידודים מוצלחים בוצעו על קטן כמו 6 מיליליטר של דם, אך שינויים יכולים להתבצע בהתאם למחזור ריכוזים של סוג התא הרצוי. אם שיפוע הצפיפות מוכן כראוי, שלבי תא נפרדים לא יכולים להיות גלויים לעין ואובדן של תאים יכול להתרחש (ראה סרט ההדרכה יופיטר להפגנה חזותית). טסיות הדם אין מספיק מבודדים מPRP הוא נדירה אך חל אם חיץ כביסה אינו מכיל PGI ₂ או אם הבידוד מתרחש מתחת לטמפרטורת חדר. הסיכון של טסיות דםctivation לעתים קרובות למנוע אם טסיות דם הם התאים שעבר להיות מבודדים, אך אם טסיות להישאר בחיץ כביסה לתקופות ממושכות bioenergetics יהיה מושפע. היו מקרים של אוכלוסיות טסיות דם קטנות יותר שלא גלולה בצנטריפוגה 1,500 XG וbioenergetics של תאים אלה לא התאפיינו בהרחבה. ראה טבלה 2 למדריך לפתרון בעיות שלם יותר.

פרופילי bioenergetic של לויקוציטים וטסיות דם ניתן לקבוע באמצעות מנתח XF, אשר מודד O ₂ הצריכה בזמן אמת בתאי noninvasively. כל סוג תא מצופה על צלחת XF24 עם חמש חזרות כפי שמוצג באיור 3 א. טבלת 1 מציינת את ערכים צפויים בסיסיים ופרץ חמצוני על ידי סוג התא במהלך assay וריכוזי חלבון הממוצע בכל טוב. טכנולוגיות תפוקה גבוהות יותר זמינות, כגון XF96, המאפשרארבעה תורמים להיות מוערך בו זמנית כפי שמוצג באיור 3. לאחר assay, הנתונים מיוצאים למחשב תחנת עבודה לניתוח באמצעות תוכנת XF המתאימה ו-Microsoft Excel. ערכי OCR היו מנורמלים לתכולת חלבון בסך הכל בבארות המקבילות והביעו כpmol / דקות / חלבון מ"ג. פרופילי פרץ bioenergetic-חמצוני הנציג של כל סוג תא דווחו לאחרונה על ידי הקבוצה שלנו ^8. ניתוח נוסף של פרמטרים bioenergetic של assay (בסיסי, ה-ATP צמודה, דליפת פרוטון, מקסימאלי, nonmitochondrial ופרץ חמצוני) ניתן לחשב עבור בארות בודדות כפי שהוצג קודם ומתואר להלן ^8.

שיעור צריכת חמצן הבסיסי (OCR) היא הוקמה על ידי 3 המדידות הראשונות, כפי שמוצגים באיור 4 א. Oligomycin (0.5 מיקרוגרם / מיליליטר), מעכב של ATP-synthase המיטוכונדריה מוזרק לתוך מדיום XF להעריך OCR מצמידים את סינתזת ATP וייצוג טד כATP למדד. OCR שיורי מינוס OCR nonmitochondrial ניתן לייחס לדליפת פרוטון. אז FCCP uncoupler מתווסף לקבוע OCR המקסימאלי, ואחריו antimycin-, מעכב של נשימה המיטוכונדריאלי, כדי לקבוע מקורות nonmitochondrial של צריכת חמצן. קיבולת מילואים היא מדד של הכמות של ה-ATP שניתן לייצר תחת דרישה אנרגטית ויכול להיות מחושב כהפרש בין השיעור המרבי של נשימה והבסיס. על מנת לקבוע את קיבולת פרץ חמצוני, phorbol 12 Myristate 13 יצטט (PMA) אגוניסט PKC מוזרקת להגברת פעילות מונואמין NADPH, והעלייה בשיעור צריכת חמצן בעקבות גירוי PMA ניתן למדוד באמצעות מנתח XF. איור 4B להראות כיצד לחשב את הפרמטרים השונים של תפקוד המיטוכונדריה ופרץ חמצוני.

"Src =" 1301/51301fig1highres.jpg / files/ftp_upload/51301/51301fig1.jpg "/>
איור 1. בידוד של לויקוציטים וטסיות דם מהדם כולו. א) דגימות שנאספו טרי מופרדות לפלזמה שלהם ומרכיבים תאיים על ידי צנטריפוגה ומטוהרות על ידי שיפוע צפיפות Ficoll, ותא הופעל מגנטי מיון (MACS) על ידי חיוביים (מונוציטים ונויטרופילים) או סלקציה שלילית (לימפוציטים), בעוד טסיות מבודדות על ידי גבוה תמונות במהירות צנטריפוגה של הפלזמה העשירה טסיות. ב ') של אוכלוסיות תאים המבודדות resuspended פעם אחת בXF DMEM ומצופים בצפיפויות תא שצוינו. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

"Src =" ghres.jpg / files/ftp_upload/51301/51301fig2.jpg "/>
איור 2. הכנת צלחות XF24 ללימודי bioenergetic של לויקוציטים וטסיות דם. ציר זמן מפורט להכנת צלחת assay XF24 ידי בידוד תא וציפוי ולחות מחסנית וטעינת נמל הזרקה.

איור 3. הפריסה של לויקוציטים וטסיות דם על צלחות XF24 וXF96 מנתח.) Leukocytes (תאי 125-250k / טוב) וטסיות דם (25 x 10 ⁶ תאים / טוב) מאותו תורם הם מצופים על צלחת assay XF24 בין רקע פקדים. 75 μl של 10x מניות של oligomycin (0.5 מיקרוגרם / מיליליטר), FCCP (0.6 מיקרומטר), antimycin-(10 מיקרומטר), וPMA (100 ng / ml) בדילול מלא בתקשורת XF נטענים בליציאות הזרקה המצוינות. B) Leukocytes (תאי 75-150k / טוב) וטסיות דם (10 x10 גם ⁶ תאים /) מכמה שיותר ארבעה תורמים יכולים להיות מצופים בXF96 בנפח כולל של 180 μl XF-DMEM. 20 μl של 10x מניות של oligomycin (1.0 מיקרוגרם / מיליליטר), FCCP (0.6 מיקרומטר), antimycin-(10 מיקרומטר), וPMA (100 ng / ml) בדילול מלא בXF-DMEM נטען לתוך יציאות הזרקה המצוינות.

איור 4. ניתוח של מדדי bioenergetic.) עקבות נציג של קצב צריכת חמצן (OCR) על ידי המיטוכונדריה ופרץ חמצוני במונוציטים. בסל OCR הוא הוקם (3 שיעורים הראשונים שמסומנים על ידי מספרים בעיגולים). לאחר מכן נוספה רציף של oligomycin (O; 0.5 מיקרוגרם / מיליליטר), FCCP (F; 0.6 מיקרומטר) ואנטיmycin-(; 10 מיקרומטר) מוזרקים כדי לקבוע המיטוכונדריה ונשימה nonmitochondrial של תאי nonactivated. לבסוף, PMA (100 ng / ml) הוא הוסיף למדוד פרץ חמצוני. ב ') ניתוח מודולרי של תפקוד המיטוכונדריה ופרץ חמצוני מחושבים על ידי ההבדלים בשיעורי כפי שצוין.

	צפיפות זריעה אופטימלית	ממוצע. בסל OCR (O pmol 2 / min)	ממוצע. פרץ חמצוני OCR (2 / דקת O pmol)	ממוצע. חלבון (מיקרוגרם) / טוב
מונוציטים	250k תאים / טוב	83.9 (± 13.0)	300.3 (± 58.8)	19.0 (± 2.4)
נויטרופילים	250k תאים / טוב	6.1 (± 2.2)	1411.8 (± 233.3)	20.6 (± 2.7)
לימפוציטים	250k תאים / טוב	52.9 (± 7.7)	15 (± 4.1)	13.2 (± 2.1)
טסיות דם	25 x 10 6 תאים / טוב	199.4 (± 20.3)	24 (± 2.7)	47.5 (± 3.1)

טבלת 1. פרמטרים רגיל עבור assay XF24: הבסיס הממוצע (שיעור 3) ופרץ חמצוני (שיעור 7) OCR לא תוקן לOCR או חלבון nonmitochondrial מוצגים על ידי סוג התא מצופה בצפיפות התא שצוינה. תכולת החלבון הממוצעת לכל גם מוצגת כפי שבוצע על ידי assay DC לורי. נתונים אלה מייצגים את הערכים הממוצעים של6-8 תורמים בריאים עם סוגריים המכילים ± SEM.

שלב	בעיה	סיבה אפשרית	פתרון
1.2	פלזמה ברורה	טסיות pelleted במהלך צנטריפוגה	להקטין את זמן צנטריפוגה ל10 דקות או איטי לXG 400
	פלזמה חלבית	שומנים עודפים	להימנע מאיסוף לאחר ארוחה
1.6	להקות תא שלמות נוצרו	שדהכנת שיפוע רופר, מגיב קר	למנוע שיבוש הדרגתי במהלך pipetting, מגיב בטמפרטורת חדר שימוש
	גושים בלהקות תא	קרישת דם ייתכן שאירעה	איסוף דם באמצעות תרופות נגד קרישת דם, כגון ACD או EDTA
1.10	אין תא גלולה	ראה שלב 1.6	אם מעורפל supernatant ראה להלן
	supernatant המעורפל	זיהום שיפוע Ficoll הכבד, זיהום של טסיות דם	להגדיל את מהירות צנטריפוגה ל900 XG, diלאוטה עם יותר RPMI
1.16, 1.17	תשואה נמוכה של כדוריות דם לבנות	זיהום RBC כבד, כולו דם לא מספיק, קרישה	כרכי נוגדן זוגי וRPMI-BSA, לאסוף יותר דם, להוסיף נוגד קרישה
1.19	אגרגציה של טסיות דם	PGI 2 מושמט, חשיפה לתקשורת קרה, אחסון ממושך בפלזמה	להוסיף PGI 2 לחיץ לשטוף טסיות דם, חומרים כימיים בטמפרטורת חדר שימוש
1.20	ספירת טסיות נמוכה	הפסד במהלך צנטריפוגה ראשונית, אגרגציה של טסיות דם	לראותצעדים 1.2 ו1.19
2.3	זיהום RBC		חזור על הפרדת MACS

טבלה 2. פתרון בעיות בידוד ויקוציטים וטסיות דם. הטבלה מפרטת בעיות נפוצות נתקלו במהלך ויקוציטים וטסיות בידוד תא מדם כולו ופתרונות שעשויים להדריך את המשתמשים בתהליך פתרון הבעיות.

Discussion

פרוטוקול זה מייצג את האוסף של כמה טכניקות מנוצלים בדרך כלל לבידוד תאי דם באופן מתאים לניתוח bioenergetics. הטכניקות רציפות שהוצגו הן יתרון לשיטות אחרות בידוד (כלומר ניתוח FACS) ליכולת שלהם לבודד מספר גדול של תאים בתנאי תקשורת מבוקרים עם לחצים מינימאליים מונחים על התאים המבודדים. יש לו את החסרון של בידודים ממושכים גם עם הפרעות מינימליות. פרוטוקול זה משמש כבסיס לבידוד של תאי דם עיקריים מבני אדם, שניתן להסיק להגדרות קליניות ומחקר translational.

הפרדת MACS היא טכניקת בידוד תא אמינה שמציעה את האפשרות של בידוד תאים ישירות מדם כולו, עם זאת, שיטה זו דורשת כמויות גדולות יותר של נוגדנים ואינה אופטימלי לבידוד של כל ארבעת סוגי התאים שונים כפי שמתוארים בשיטה זו. שם יש בeen אין ראיות כדי להראות שהסלקציה החיובית של לויקוציטים ידי תוצאות הפרדת MACS בהפעלה באמצעות פרוטוקול הבידוד שלנו. עמודות MACS לפעול באמצעות קיבוע של תאים שכותרתו בשדה מגנטי באמצעות נוגדנים מצומדות כדי 50 חלקיקי פאראמגנטי ננומטר. לאחר מכן תאים שכותרתו eluted את הטור. בחירות חיוביות ושליליות מיושמות בפרוטוקול זה כדי להבטיח בידוד וטוהר מהירים. אם מספרי תא לקויים מתקבלים מבידוד או טוהר הוא בשאלה, ניתן להוסיף יותר נוגדנים למדגם לפי ההוראה של הספק והמעבר שני דרך עמודת LS עלול לגרום לטוהר גבוה יותר (טבלה 2). המעבדה שלנו מצאה טוהר גבוה ויעילות ציפוי באמצעות הפרוטוקול הקיים על ידי ניתוח השעיות תא סופיים על ידי ניתוח FACS ^8.

יש מנתחי שטף תאיים היכולת לפקח גם צריכת חמצן והחמצת תקשורת בזמן אמת מעל זה של otאלקטרודות. צריכת החמצן כפי שנצפה על ידי תגובת פרץ חמצוני במונוציטים ונויטרופילים היא מונואמין NADPH תלוי כפי שמוצג על ידי עיכוב עם DPI ^8. שראינו בהפסד תלוי בזמן בקיבולת פרץ חמצוני עם בידודים ממושכים או מבחני XF מורחבים. פרוטוקול זה תוכנן ופותחו לשימוש בXF24 אבל גם תואם עם XF96 כבשליש עד חצי מהתא XF24 זריעת צפיפות (איור 3).

בעיצוב של פרוטוקול זה, היצמדות לפרוטוקולים קיימים עבור כל טכניקה הנדרשת לביצועים אופטימליים עם שינויים שנעשו אך ורק כדי לשלוט בתנאי תקשורת לניתוח bioenergetic. לאחר שליטה בטכניקות, פרוטוקול כזה יכול לשמש במגוון רחב של יישומי translational ומחקר כדי למדוד את הרעילות או יעילות של אסטרטגיות טיפול, לחקור מאפיינים המטבולי של מחלה, וייצור חמצון על ידי מונוציטים וneutrophils במצבים דלקתיים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
QuadroMACS Starting Kit includes QuadroMACS Separator and MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-094-833
CD235a (Glycophorin A) MicroBeads, human	Miltenyi Biotec	130-050-501
CD61 MicroBeads, human  for platelets	Miltenyi Biotec	130-051-101
CD14 MicroBeads, human  for monocytes	Miltenyi Biotec	130-050-201
CD15 MicroBeads, human  for granulocytes	Miltenyi Biotec	130-046-601
LS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401
BD Vacutainer ACD Blood collection tubes	Fisher	02-684-26
RPMI 1640	Gibco	11835-030	with L-glutamine and without phenol red
Prostaglandin I2, sodium salt	Cayman	18220
1.5 ml semi-micro cuvettes	Phenix Research Products	SC-2410
Histopaque density gradient, specific gravity 1.077	Sigma	10771
Histopaque density gradient, specific gravity 1.119	Sigma	11191
Bovine Serum Albumin Fraction V	Roche	3117405001	fatty-acid ultra-free
Phorbol 12-myristate 13-acetate	Sigma	P8139
XF24 FluxPak	Seahorse Biosciences	100850-001
DMEM	Fisher	MT90113PB	w/o Glucose, L-Glutamine, Pyruvate, Phenol Red, and Bicarbonate
L-Glutamine, 200 mM (100x)	Invitrogen	25030-081
D-Glucose	Sigma	G7528
Sodium Pyruvate	Sigma	P8574
Cell-Tak (cell adhesive)	BD Biosciences	CB-40242
Oligomycin	Sigma	O4876
Antimycin A	Sigma	A8674
(FCCP) Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone	Sigma	C-2920
DC Protein Assay Reagent A	Bio-Rad	500-0113
DC Protein Assay Reagent S	Bio-Rad	500-0015
DC Protein Assay Reagent B	Bio-Rad	500-0114
Seahorse	Seahorse Biosciences
QuadroMACS Separator and MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-090-976 and 24039
Spectrophotometer