Glycopeptide לכידת לפרוטאומיקה פני התא

Summary

חלבונים בתא שטח הם חשובים מבחינה ביולוגית וglycosylated באופן נרחב. אנחנו מציגים כאן גישת glycopeptide ללכוד לsolubilize, להעשיר, וdeglycosylate חלבונים אלה לניתוחי proteomic מבוססים LC-MS קליל.

Abstract

חלבונים פני תא, כוללים חלבונים תאיים מטריקס, משתתפים בכל התהליכים העיקריים הסלולריים ופונקציות, כגון צמיחה, בידול, ושגשוגם. אפיון מקיף של חלבונים אלו מספק מידע עשיר לגילוי סמן ביולוגי, זיהוי סוג התא, ובחירת תרופות יעד, כמו גם לעזור לקדם את ההבנה של ביולוגיה ופיזיולוגיה סלולריות שלנו. חלבוני פני השטח, לעומת זאת, מציבים אתגרים משמעותיים אנליטיים, בגלל השפע שלהם מטבע הנמוך, גבוהה הידרופוביות, ולאחר translational שינויים כבדים. ניצול של glycosylation הנפוץ בחלבוני פני השטח, אנחנו מציגים כאן גישת glycopeptide ללכוד תפוקה גבוהה, המשלבת את היתרונות של כמה אמצעי N-glycoproteomics קיימים. השיטה שלנו יכולה להעשיר glycopeptides נגזר מחלבונים פני השטח ולהסיר glycans לפרוטאומיקה הקלילה באמצעות LC-MS. N-glycoproteome נפתר כולל information זהות חלבון וכמות כמו גם באתריהם של glycosylation. שיטה זו יושמה לסדרה של מחקרים בתחומים שונים, לרבות סרטן, תאי גזע, ורעילויות תרופה. המגבלה של השיטה טמונה בשפע הנמוך של חלבוני קרום פני השטח, כך שכמות גדולה יחסית של דגימות הנדרשות לניתוח זה בהשוואה למחקרים התמקדו בחלבוני cytosolic.

Introduction

חלבונים בתא שטח באינטראקציה עם הסביבה תאית ולהעביר אותות מבחוץ לחלק הפנימי של תא. לפיכך, חלבונים אלה, כוללים חלבוני מטריצת חוץ תאיים, ממלאים תפקידים קריטיים בכל ההיבטים של ביולוגיה ופיזיולוגיה, החל שגשוג, צמיחה, הגירה, בידול להזדקנות וכן הלאה סלולריות. חלבוני פני השטח לתפקד על ידי אינטראקציה עם תאים אחרים, חלבונים ומולקולות קטנות ^1-3. אפיון מולקולרי של חלבונים על פני קרום התא הוא עניין רב לא רק לביולוגים, אלא גם לחברות תרופות, שכן יותר מ -60% מתרופות ממוקדים לחלבונים על פני קרום תא ^4.

ספקטרומטריית טנדם מסה (MS), עם הרגישות שלה מעולה, דיוק, ותפוקה לזיהוי של חלבונים ופפטידים, כבר כלי רב עוצמה למחקרים proteomic הגלובליים ^5,6. עם זאת, חלבוני פני השטח להוות אתגר משמעותי לפרוטאומיקה מבוססת MS, כפירוב חלבוני פני השטח קיימים בכמויות נמוכות ועם שינויים כבדים. האזורים פורש הקרום של חלבוני פני השטח לעבד אותם הידרופובי; זה נכון במיוחד במקרה של חלבונים הטרנסממברני multipass. זה קשה ובכך לפזר חלבוני קרום בתמיסות מימיות ללא העזרה של חומרי ניקוי; עם זאת השימוש בחומרי הניקוי, בדרך כלל מדכא את הביצועים של HPLC ו-MS ^1,7,8 בזיהוי חלבון. לכן, חלבוני קרום היו מאופיינים בצורה גרועה בפרוטאומיקה מבוססת LC-MS הישירה.

Glycosylation הוא אחד לאחר translational השינויים החשובים והנפוצים ביותר המתרחשים בחלבונים על פני קרום תא ^9. מורכבות ואת ההטרוגניות עצומות של glycans לעכב MS אות 'פפטידים ^10. עם זאת, במספר שיטות proteomic השתמשו השינוי הזה ייחודי להעשרת חלבוני פני השטח ולהסיר את moieties הסוכר מחלבונים לפני ניתוח LC-MS. שיטה אלהים כולל לכידה מבוססת קטיני זיקת ¹¹ ולכידה כימית המבוסס על חומצה בורית או מבוסס hydrazide ¹² כמו גם פרידות כרומטוגרפיה הידרופילי ^8,13. הסרת glycans הופכת חלבונים בממברנה לחלבונים רגילים ומפשטת באופן דרסטי את אפיון הטרשת הנפוצה. בגלל glycosylation גם מתרחש בחלבונים מופרשים שיש מסיסות גבוהה בניגוד לחלבוני קרום, שיטות רבות glycoproteomic מותאמות לחלבונים מסיסים, ונוטות להיות סלקטיביות glycopeptide נמוכה ורגישות כשנפרס קרום חלבונים ^8,14. שיטות אחרות קיימות גם להעשיר, בפרט, חלבונים על פני קרום תא, כגון אלה באמצעות ultracentrifugation ¹⁵ ואסטרטגיות תיוג ^16. השוואה מפורטת בין השיטה שלנו ושיטות קיימות אחרות לאפיון חלבוני קרום נערכה לאחרונה ^17, והתוצאות הצביעו על כך שהשיטה שלנו יכולה לבצע באותה מידה, אם לא, אבל עם יותר טובים, יותר מכל שיטות פרוטאומיקה הקרום לעומת פשטות גבוהה יותר.

כדי לסייע לחוקרים להשתמש בשיטה זו, אנו נפרט כאן פרוטוקול כללי. שיטה זו משלבת מספר יתרונות של אסטרטגיות glycoproteomics קיימות והוא המציא במיוחד עבור גליקופרוטאינים קרום, אך השיטה עובדת פחות טובה לחלבונים מופרשים. המאפיינים של שיטה זו כוללים: 1) solubilization של חלבונים בממברנה מלא, 2) העשרת glycopeptides במקום גליקופרוטאינים לחסל את הפרעה סטרית הפוטנציאלית בעת שימוש במצע הלכידה מוצק, 3) השימוש בכימית hydrazide ליצירת קשרים קוולנטיים בין glycopeptides ומצע לכידה, כך שglycopeptides מלוכד יכול לסבול שוטף מחמיר לגבוה glycoselectivity, ו -4) את היכולת לנהל את ההליך כולו ללכוד בצינור אחד לאובדן מדגם מופחת ומשך הליך מקוצר. לאחר יישום שיטה זו ללימוד ואריאתי של דגימות ביולוגיות כוללים תאים ורקמות, ראה סלקטיביות גבוהה (> 90%) לגליקופרוטאינים ^8,17,18.

Protocol

1. ממברנות הקציר

1. הוסף חוצץ hypotonic (10 מ"מ טריס-HCl, 10 מ"מ KCl, 1.5 מ"מ MgCl _2, pH 8.0) עם מעכבי פרוטאז קוקטייל על תא גלולה (~ 10 ⁸ תאים) ו דגירה של 15-30 דקות על קרח. Lyse התאים על ידי העברת הדגימה באמצעות מחטי מזרק (5-10 עובר) או שמאחד את המדגם על ידי homogenizer Dounce (15-30 שבץ). השתמש hemocytometer וכתמי כחולי trypan כדי לבדוק את היעילות של תמוגה.
2. השג את שבריר microsomal ידי צנטריפוגה ההפרש של lysate ב3,000 דקות 15 GX ולאחר מכן ב100,000 GX 2 שעות. צנטריפוגה הראשונה משיגה גלולה שהוא שבריר הגרעיני, וצנטריפוגה הבאה של supernatant מייצרת גלולה שנייה, המהווה את חלק microsomal המכיל קרום הפלזמה, כמו גם האברונים קרום הנכנס ^8. Supernatant הסופי הוא שבריר cytosolic. אחסן את השברים microsomal במקפיא -80 מעלות צלזיוס למשך analys נוסףהוא כמפורט להלן.

2. ממיסים, לפגל, וחלבונים בממברנה Digest

1. ממיסים את חלקיק microsomal במאגר denaturation (40 מ"מ טריס, 10 mM EDTA, 10 מ"מ TCEP, 0.5% Rapigest, pH 8) ולאחר מכן דגירה הפתרון ב100 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
2. לקרר את הפתרון המחומם לטמפרטורת חדר, להוסיף אבקת אוריאה גבוהה במיוחד טוהר לפתרון ל8 ריכוז סופי M ודגירה המדגם ב37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
3. הוספת פתרון מניות iodoacetamide למדגם ל15 מ"מ ריכוז סופי, ודגירת הפתרון בחושך במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר לalkylate thiols בחינם במדגם. הוספת פתרון מניות DTT המדגם לריכוז סופי 10 מ"מ ודגירת הפתרון עוד 10 דקות בטמפרטורת חדר כדי להרוות את iodoacetamide המוגזמת.
4. לדלל את 10x הפתרון שהושג עם 40 חיץ מ"מ טריס ב-pH 8, ולאחר מכן להוסיף טריפסין לדוגמא ביחס 1:20 של trypsin לחלבון בסך הכל. שמור את תגובת מערכת העיכול בלילה בתנור 37 ° C כדי להבטיח התגובה הושלמה.
5. לסיים את מערכת העיכול על ידי acidifying פתרון המדגם ל-pH 1 עם HCl, מצב זה גם מפרק את חומרי הניקוי, כלומר Rapigest. לבזות את Rapigest ב-C ° 37 עבור שעה 1, ולהסיר את המשקעים שפותחו על ידי צנטריפוגה.
6. נקה את supernatant המכיל פפטידים מדגם על ידי מחסנית C-18 מיצוי שלב מוצק (SPE) ולייבש את הדגימה המתקבלת על ידי speedvac.
7. לבצע ניתוח SDS-PAGE של דגימות לפני ואחרי טריפסין עיכול כדי לאשר את יעילות העיכול.

3. לכידת glycopeptide

1. ממיסים את פפטידים ניקו בחיץ הצימוד (אצטט 100 מ"מ נתרן, pH 5.5). הוספת periodate נתרן לתוך תמיסת פפטיד בריכוז 10 מ"מ סופי ל30 דקות בחושך, בטמפרטורת חדר. זה יהיה לחמצן קבוצות cis-דיאול בglycans לאלדהידים, המאפשרת glycans לבני זוג השרף דרך הכימיה hydrazide. להרוות את periodate המופרז על ידי סולפיט נתרן בריכוז 20 מ"מ סופי וה-pH 5 ל10 דקות בטמפרטורת חדר.
2. להציג את שרף derivatized hydrazide לתוך תמיסת פפטיד ביחס של 1:4 (שרף לפתרון) לזוג glycopeptides לשרף. דגירה התגובה על 37 מעלות צלזיוס למשך 1-2 ימים עם סיבוב מקצה לקצה עבור צימוד שלם.
3. הסר את פפטידים מאוגדים על ידי שטיפת השרף פעמיים עם 1 מיליליטר של כל אחד מאלה: המים DI, 1.5 M NaCl, מתנול ואצטוניטריל 80%. לבסוף, לשטוף 3x השרף עם 1 מיליליטר של 100 מ"מ NH ₄ HCO ₃ ב-pH 8 להחליף את החיץ של המערכת ל100 מ"מ NH ₄ HCO _3.
   1. לאסוף את supernatant והשוטף לניתוח של פפטידים מאוגדים (אופציונליים).
4. שחרר את N-glycopeptides מהשרף על ידי PNGase F בדגירת לילה בשעה 37 ° C עםn מקצה לקצה רוטציה. לאסוף את הפפטידים שפורסמו על ידי צנטריפוגה ולשטוף אצטוניטריל 80%. ייבש את הפתרון שהתקבל בspeedvac לניתוח LC-MS.

4. היפוך חלוק נוסף (אופציונאלי)

כדי לפשט את מורכבות מדגם נוסף, fractionate N-glycopeptides מתקבל. לדוגמא, redissolve פפטידים המיובשים לתוך formate האמוניה 10 מ"מ, pH 3 עם אצטוניטריל 20% ולהשתמש בתמורת קטיון חזקה כרומטוגרפיה (SCX) לfractionate פפטידים. ייבש את eluent שהושג, ולאחר מכן לנתח את שברי פפטיד מתקבלים על ידי הפוך השלב LC-MS ^8,17,18.

5. ניקוי של N-glycopeptides פורסם (אופציונלית)

אם חששות לעלות לזיהום הפוטנציאלי של פפטידים, redissolve פפטידים המיובשים לתוך 0.1% חומצה פורמית ולהשתמש בעמודת MCX SPE לנקות עוד יותר את פפטידים לפני ניתוח LC-MS להפוך שלב.

הערה: פרמטרים חיפוש מסד נתונים.

במהלך המחשוף סלקטיבית של N-glycopeptides את השרף, PNGase F ממיר asparagine מקושר N-סוכרים לחומצה אספרטית. לכן, יש שינוי מסת דה 0.9840 של N-glycopeptides המשוחרר. כדי לזהות במדויק את הפפטידים האלה, שינוי זה צריך להוסיף לפרמטרי החיפוש יחד עם שינויים נפוצים כגון carbamidomethylation של ציסטאין והחמצון של מתיונין.

תוצאות

תרשים זרימת נציג של הליך הניסוי מסוכם באיור 1. התיוג וצעדי חלוקה נוספים הם אופציונליים ופרטים מתוארים בפרסום האחרון ^18. אפשרות נוספת היא לנתח את פפטידים ללא שינוי, שאינו מגיבים עם השרף. היתרונות של ניתוח פפטידים ללא שינוי כוללים את זיהוי הפוטנציאל של פפ?...

Discussion

כאן אנחנו מציגים אסטרטגית glycopeptide ללכוד לאפיון חלבונים על פני קרום תא. השיטה יכולה להיות מיושמת כדי ללמוד חלבונים מופרשים, כגון אלה בדם, כמו גם בנוזלי גוף אחרים או בתקשורת תרבות תא.

ההצלחה של השיטה מסתמכת על העיכול של דגימות המלאה; ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DTT	Sigma	646563
TCEP	Sigma	646547
Iodoacetamide	Sigma	A3221
Rapigest SF	Waters	186001860
Sodium periodate	Sigma	311448
PNGase F	New England Biolabs	P0704S
Affi-Gel Hz hydrazide gel	Bio-Rad	153-6047
Trypsin	Worthington Biomedical	LS02115
Sep-Pak C-18 cartridge	Waters	WAT054955
Oasis MCX cartridge	Waters	186000252
Protease inhibitor coctail	Sigma	P8340
Urea	Amersco	568
Sodium sulphite	Caledon	8360-1
Invertase	Sigma	I0408
α-1 trypsin	Sigma	F2006
Ribonulease B	Sigma	R7884
Avidin	Sigma	A9275
Ovalbumin	Sigma	A5503
Conalbumin	Sigma	C0755