תיוג תא והזרקה בפיתוח לבבות עכבר עוברי

Summary

אנו מתארים סדרה של שיטות להזריק צבעים, וקטורי DNA, וירוסים, ותאים במטרה לעקוב אחר שני גורל התא והפנוטיפ של תאי אנדוגני והמורכבים שמקורם בתאים עובריים או pluripotent בעוברי עכברים ביום עוברי (E) 9.5 ושלבים מאוחרים יותר של פיתוח.

Abstract

בדיקת גורלם של תאי גזע עובריים או נגזרי pluripotent במבחנת פרוטוקולים הובילה לתוצאות שנויות במחלוקת, שאינו משקפים בהכרח in vivo את הפוטנציאל שלהם. רצוי, צריכים להיות ממוקמים בתאים אלה בסביבה עוברית תקינה על מנת לרכוש פנוטיפ מובהק שלהם. יתר על כן, שושלת תא התחקות מחקרים בעכבר לאחר סימון תאים עם צבעים או וקטורי רטרווירלי נשארה מוגבלת בעיקר לעוברי עכברים בשלב מוקדם עם איברים עדיין מפותחים. כדי להתגבר על מגבלות אלה, עיצבנו פרוטוקולי microinjection סטנדרטיים ותיווך אולטרסאונד כדי להזריק סוכנים שונים באזורים הממוקדים של הלב בעוברי עכברים בE9.5 ושלבים מאוחרים יותר של התפתחות. explant או עוברים עובריים בתרבית ואז או שמאלה כדי לפתח עוד יותר ברחם. סוכנים אלה כוללים צבעי ניאון, וירוס, shRNAs, או תאי גזע ובתאים שמקורם בתא. הגישות שלנו מאפשרות לשימור של פוnction של האיבר תוך מעקב הגירה וגורלם של תאים שכותרתו ו / או בזריקה. ניתן להאריך בטכנולוגיות אלה לאיברים אחרים ויהיה מועיל מאוד כדי לענות על שאלות ביולוגיות מרכזיות בביולוגיה של התפתחות.

Introduction

לפני יותר מעשור, בתאי גזע עובריים אנושיים (HuESCs) כבר נגזרו מבלסטוציטים אנושי ^1. מאז, תאים אלה הפכו את הנושא של תחום חשוב של מחקר המתייחס לשאלות שלא סופקו בביולוגיה התפתחותית אנושית. HuESCs לי יתר סיפק תקוות ברפואת רגנרטיבית. בשנים האחרונות, תאים אנושיים מושרה גזע pluripotent (iPSCs) כבר נוצרו מהתאים סומטיים מטופל ספציפי, המספקים מודלים של מחלה גנטית ^2. רבים בפרוטוקולי מבחנה להתמיינות של תאי גזע pluripotent עובריים או מושרה כלפי שושלות תאים שונות, כוללים שושלות לב ^3, כבר דיווח. התאים מובחנים לעתים קרובות phenotyped על ידי ניתוח של RNA וביטוי חלבון, immunostaining, ו / או בבדיקות תפקודיות מבחנה. עם זאת, נגזרים בתאי גזע pluripotent צריך להיות ממוקם בסביבה עוברית תקינה על מנת לבדוק אם הם רוכשים את cel מלאגורל ליטר של עמיתו העוברי שלהם ובין אם הם לשחזר את התפקוד vivo באמיתי בתגובה לאותות אזוריות. בעוד הנדסת רקמות היא מבטיח, זה עדיין לא מספק את כל הרמזים ידועים ובלתי ידועים של הראוי in vivo מתפתחים רקמה עוברית ^4,5.

תא תיוג עם צבעים או וקטורי רטרווירלי בעוברים, לרבות עוברי עכברים, הביא מידע חשוב באשר למקור העוברי של שושלות תאים במהלך התפתחות לב ^6. לדוגמא, לצבוע הזרקה אל תוך חלל קרום הלב של עוברי עכברי vivo לשעבר, ואחריו תרבות במבחנה של לבבות בודדים, שימש לתווית תאי epicardial וצאצאיהם ^7. עם זאת, צבע ותיוג תא רטרווירלי כבר מיושמים בעיקר לעוברי עכברים מוקדמים עם איברים עדיין מפותחים, או עוברי עופות, שהם יותר נגישים בקלות ^8. יוצא מן הכלל הוא במוח, שהוא קל יותר למקד בדוארmbryos ^9,10. גישה כזו טרם יושמה אל לב העכבר העוברי הפועם.

כדי להשלים את התיוג ישיר עם צבעים או וירוס ולבצע שושלת התחקות בעוברי שלב מתקדמים יותר בעכבר ועכברים בוגרים, גישת תיוג תא כבר בשילוב עם ניתוח של עכברים הטרנסגניים באמצעות טכנולוגית Cre / לקס. גישת Cre / קס ¹¹ עם זאת תכונות מסוימות מגבלות עקב הספציפיות spatiotemporal של אזורי רגולציה גנומית להשתמש בכונן ביטוי של recombinase, ואת היעילות של רקומבינציה Cre / קס ^12. יתר על כן, גישה זו אינה מתייחסת באופן מלא על השאלות הספציפיות של רכישה מונעת נדידת תאים של גורל תא כפי שהוא יכול רק לתייג מבשר לאחר ההפעלה של אזור הרגולציה להשתמש בכונן ביטוי Cre. כמו כן, לא ניתן להחיל על עוברים אנושיים לסוגיות אתיות ברורות.

בהתחשב במגבלות אלה, עיצבנו סדרה של p החדשrotocols להזרים מגוון של סוכני תיוג תא כגון צבעי ניאון, וירוס, מאפנני ביטוי גנים כגון shRNAs ווקטורי תיוג תא מבוסס ה-DNA, או בתאים בעובר של העכבר בE9.5 ושלבים מאוחרים יותר של פיתוח באזורים ממוקדים של לב.

זריקות ה-DNA / התא להשתמש סטראו ומכשיר microinjection פשוט בשילוב עם vivo לשעבר תרבות עובר עד 48 שעה, או לב מבודד או תרבות explant עוברית ל48-72 שעה. גם אנו מדווחים פרוטוקול microinjection תיווך אולטרסאונד בלב העוברי של עכברים ברחם. טכניקה זו מאפשרת ניטור הפיתוח של עוברים ¹³ ומאפשרת מעקב ארוך טווח של injectates ו / או תאי שכותרתו.

מצאנו כי גישות אלו לשמר את התפקוד של האיברים ולספק סביבה ייצוגית יותר מאשר בדיקה במבחנה של פוטנציאל של תאי גזע. הוא גם מספק את ההזדמנות כדי לעקוב אחר נדידהכותרתו של ו / או הזריק תאים כדי לפקח על גורלם. סופו של דבר, זה אמור להניב הבנה טובה יותר של דפוסים רקמה אזוריים ותהליכים ביולוגיים מרכזיים.

Protocol

1. הכנה

נהלי בעלי חיים

לקבל אישור מועדת אתיקה של בעלי חיים ופעל בהתאם להנחיות מוסדיות לעבודה עם וירוס, HuESC ו / או iPSC (כאשר רלוונטי), כמו גם טיפול בעכבר, קבלת עוברי עכברים, וביצוע ניתוחי עכבר. להזדווגויות מתוזמן, היום של התקע נחשב יום עוברי 0.5 / 0.5 ימים לאחר coitum-(E).

1. מחטי Microinjection:
   עבור לשעבר רחם microinjection, למשוך טפטפות זכוכית (צינורות נימי ורוסיליקט הקוטר חיצוניים 1.2 מ"מ) באמצעות חולץ פיפטה / beveller לקבל מיקרומטר קוטר 1 או 10 פנימי קצה וצורת קצה חדה וחרוטים להזריק DNA או תאים, בהתאמה. זריקות בתיווך אולטרסאונד, שימוש מותאם אישית מחטים סטריליות, אשר יש קוטר חיצוני / פנימי (OD / ID) של 1.14 mm/0.53 מ"מ, עם טיפ 50/35 OD מיקרומטר / זהות.
2. צלחות פטרי מלאות סיליקון:
   הכן סיליקון כפי שמתואר במדריך. למלאצלחת פטרי זכוכית נקייה 60 קוטר מ"מ עם שכבת אלסטומר של ~ 1 סנטימטר. למנוע בועות אוויר.
3. מכשירים:
   שמור את כל מכשירי ניתוח סטרילי לפני ובמהלך ההליך.
4. הכנת ה-DNA:
   הוסף 3 DNA מיקרוגרם ו12 μl Opti-ממ בצינור אחד. הוסף 3 Lipofectamine μl 2000 ו12 μl Opti-ממ בצינור אחר. דגירה במשך 5 דקות ב RT ולערבב את שני הפתרונות. השתמש באופן מיידי.
5. הכנת תא:
   הכן השעיה של 10 ⁶ תאים / מיליליטר DMEM (של Dulbecco נשר בינוני, גלוקוז גבוה ו50% בסרום חולדה). 50 μl של השעיה תא הסופית הוא מספיק ל8-10 עוברים.
6. לצבוע הכנה:
   השתמש בניאון הירוק CDCFDA-SE ב25 מ"ג / מיליליטר DMSO. הכן 20 aliquots μl ולאחסן ב -20 ° C. לדלל 1:100 / 1:200 בתמיסת מלח או PBS סטרילי לפני השימוש.
7. הכנת וירוס:
   השתמש-GFP-לבטא PGK lentivirus דור 3 ^rd מסחרי עם כייל של ~ 10 ⁹ -10 ¹⁰ טרהnsducing יחידות / מיליליטר DMEM. להכנת lentivirus, ראה Tiscornia et al. ¹⁴ ללבוש ציוד מגן אישי ולהשתמש בבטחה ובלהיפטר מנגיף.

2. אוסף של E9.5 וE10.5 עוברים לvivo הזרקה אקס

1. להרדים עכבר בהריון ביום עוברי 9.5 או 10.5.
2. לעקר את החזה והבטן של העכבר עם 70% אתנול.
3. ביצוע חתך קו האמצע הגחון כדי לפתוח את הבטן ולאחזר את קרן הרחם ב RT ב-PBS ולהעביר אותו אחרי שני שוטף PBS לצלחת פטרי המלא בסיליקון עם מדיום M16.
4. הצמד את קרן הרחם עם סיכות חרקים לשכבת סיליקון כך שצד vascularized של הרחם הוא בתחתית.
5. חותכים את פני השטח של הרחם עם מלקחיים בסדר, וכובע של decidua ב1 מ"מ מתחת לפני השטח.
6. בעדינות לשלוף את העובר בצק החלמון ע"י פרישת קירות decidua.
7. אחסן את העוברים על 37 מעלות; C בM16 בינוני לפני הזרקת תא. להזרקה, כל עובר מועבר לצלחת סיליקון מלאה בינוני M16 מראש חימם על 37 ° C.

3. DNA או הזרקת תאים תחת סטראו

1. למלא את פיפטה הזכוכית מהחלק האחורי עם מזרק המילטון ולנער את פיפטה כדי להסיר בועות בקצה.
2. הגדר את פיפטה על בעל microinjection; להגדיר את הלחץ החזק ל50 (DNA) או 30 (תאים) hPa, ולחץ ההזרקה 150 ל( DNA) ל300 (תאים) hPa. קבע את זמן הזרקה ל0.2 שניות (DNA) או 0.5 שניות (תאים). הגדרות אלה עשויות להשתנות מעט בהתאם לסוג של microinjector ופיפטה.
3. הצמד את העובר לתחתית סיליקון דרך שק החלמון בלי לגעת בעובר התקין. צפה באזור של הלב ולפתוח את השק רק מעל אזור זה.
4. הוסף 4 סיכות סביב העובר כדי למנוע כל תנועה במהלך הזרקת תא.
5. שימוש micromanipulator (למצב ידני), slowlמיקום Y קצה פיפטה בזווית של ° 45 מעל קרום הלב, בדיוק מעל האזור של הלב שהוא להיות מוזרקים (איור 1).
6. הזז את פיפטה לתוך האזור של עניין ולעורר את הזריקה. קח את פיפטה מהר ככל האפשר. ודא הלב פועם כהלכה לאחר הזרקת ה-DNA / תא.

4. עובר, לב מבודד, וexplant תרבות

1. תרבות עוברי E9.5 ב25% בינוניים M2 ו75% בסרום עכברים, השלימו עם פניצילין / סטרפטומיצין, מראש חימם על 37 מעלות צלזיוס וחומצן עם 40% O _2.
2. הוסף 2 מדיום תרבות מיליליטר בשפופרת זכוכית 25 מיליליטר, בעדינות להוסיף את העובר, וחמצן עם 40% O ₂ לפני הברגת הכובע על הצינור. דגירה עד 36 שעות על 37 מעלות צלזיוס בעוד סיבוב או טלטול (30 סיבובים / min).
3. בנקודת הזמן הרצויה (למשל 24hr), לנתח את לבם בזהירות עם מלקחיים בסדר, בלי לגעת בלבם, על ידי דה הראשוןcapitating העוברים; הלב הוא קל לבלו על ידי משייכתו החוצה באמצעות מערכת יצוא דיסטלי.
4. תרבות מבודדת לב עבור שעות נוספות 36-48 DMEM עם FCS 50% על הוספת Matrigel מצופה נקבעה ב12 גם צלחת. ראה דאייר ופטרסון (2013) לפרוטוקול משופר של לב תרבות ^15.
5. בצע את כל explant של האזור של עניין. כדוגמא, לנתח את תעלת atrio-חדרית (AVC) ותרבותה ל48 ​​שעות על קולגן סוג 1 ג'ל ^16.

5. הזרקה מונחה אולטראסאונד שבלב n רחם

1. התקנה של מכשיר אולטרסאונד וmicroinjector:
   1. שימוש במערכת אולטרה סאונד ברזולוציה גבוהה עם מתמר 40 MHz והתקנת microinjection על מעקה.
   2. קבע את עוצמת הזריקה על microinjector ב69 NL לכל זריקה. ראה מדריך לmicroinjection של היצרן עבור תכנות microinjector.
2. הכנת microiהתקנת njection והזרקה:
   1. הנח micropipette זכוכית בmicroinjector. כדי להבטיח הזרקה, מעיל ראשון יעיל בצד הפנימי של פיפטה עם שמן מינרלים על ידי aspirating עד הנפח המקסימאלי. ואז להוציא את השמן שוב, ומשאיר 1-2 מ"מ של שמן בתוך המחט.
   2. לשאוב injectate עד לעצמה המרבית. היזהר שלא לגעת במשטחים עם קצה המחט כמו זה יהיה להקהות את החוד ולעשות זריקה קשה יותר.
   3. כדי לייצב את קרן הרחם המכילה את העוברים במהלך הזרקה, השתמש בצלחת פטרי עם הותאם חור באמצע (2.5 ס"מ קוטר), מכוסה על ידי קרום סיליקון דק עם שסע קטן לחתוך במרכז, ולמקם אותו מעל אתר החתך . לייצב את צלחת פטרי על שולחן הטיפול של עכבר על ידי מיקום 3-4 גושים של חימר מתחת לשולי הצלחת.
3. הליך הזרקה:
   1. לגלח את הבטן של עכבר בהריון (בשלב העוברי הרצוי) לפני anestheSIA להסרת שיער. פנק את הבטן עם סוכן הסרת שיער כימי להסרת שיער שייר ולחטא עם 70% אתנול.
   2. הרדימי עכבר בהריון עם החמצן / isoflurane באמצעות מסיכת הפנים. השתמש isoflurane 3-5% ב100% חמצן להרדמה ראשונית, ואחריו 1-1.5% במהלך השאר של ההליך. ודא שהעכבר הוא מורדם כראוי על ידי בעדינות צובט כפות ו / או בזנבו.
   3. מקם את עכבר פרקדן על שולחן הטיפול של עכבר (שנקבע לחום על 37 מעלות צלזיוס) ולכסות את העיניים עם חומר סיכה על מנת למנוע התייבשות של הקרנית.
   4. החל ג'ל האלקטרודה על האלקטרודות וידביק את כפות לאלקטרודות כדי לפקח על קצב לב, קצב נשימה, ואק"ג. מקם מדחום רקטלי כדי לפקח על טמפרטורת גוף.
   5. ודא תחילה שהעכבר הוא בהריון על ידי הדמיה וסופר את העוברים על ידי אולטרסאונד. החל ג'ל אולטרסאונד על הבטן ומקם את סריקת הראש מעל לשלפוחית ​​השתן. לשם עקביות, לדמיין את שלפוחית ​​השתן ראשון,ולספור עוברים בצד השמאל וקרן רחם תקין, החל מהעמדה של שלפוחית ​​השתן. ודא שלב עוברי מכה כרגיל.
   6. אם העכבר הוא בהריון, מקם את צלחת פטרי מעל אתר חתך העתיד עם חימר. לחץ על הצלחת מעט על הבטן, כך שהמנה היא במגע ישיר.
   7. הסר את הצלחת ולעקר את הבטן שוב. ביצוע חתך קו האמצע הגחון 1.5-2 סנטימטר, כ 0.75-1 ס"מ מעל הנרתיק, כדי לפתוח את הבטן והצפק. הימנע מפגיעה באיברים פנימיים.
   8. Exteriorize השמאל או קרן רחם תקין עם מלקחיים, בעדינות למשוך אותו דרך קרום סיליקון של המנה, ולייצב את הצלחת על החימר שוב. למנוע נרחב מושכים או מניפולציה, שכן דבר עלול לגרום לדימום של כלי הרחם והמוות בטרם עת של האישה ו / או עובר.
   9. לספור את העוברים שוב על מנת להבטיח רישומים נאותים של עוברים שהוזרקו.
   10. החל ג'ל אולטרסאונד על uקרנות terine לתמונת הלב ועל מנת למנוע התייבשות.
   11. תמונת העובר הראשון שהוזרק. בדקו מכות נורמליות של הלב העוברי ולשמור תיעוד של את כיוון הגולגולת, הזנב ושמאל וימין של העובר. במידת צורך, למקם מחדש את קרן הרחם מעט כדי להבטיח כיוון נכון. אם זה מוכיח קשה, על מנת להעביר את העובר הבא.
   12. לנקב את הרחם בזהירות עם מחט microinjection כדי למקם את המחט בזווית של ° 45 מעל העובר, מעט מחוץ לקרום הלב (איור 3). לתיוג של תאי epicardial, תמונת הלב בארבעה חדר תצוגה ולמקם את המחט כך שיצביע לכיוון חריץ atrio-חדרית (איור 3). אם הזווית צריכה להיות מותאמת, לשלוף את המחט, ולמקם מחדש. לא להתאים את הזווית עם המחט בתוך הרחם, שכן זה עלול לשבור את המחט. למנוע ניקוב רקמות אחרות, כגון גפיים או שליה.
   13. להזיז את המחטעל קיר קרום הלב ולנקב אותו עם תנועה עדינה, אבל מהירה. באופן כללי, לא תהיה התנגדות מסוימת, אבל הזזת המחט מהר מדי עלולה לגרום לקצה המחט לנקב את הלב עצמו. טיפ צריך בסופו של דבר בחלל קרום הלב של גרוב atrio-חדרית. במקרה של דימום קרום הלב, תאי דם יהיו גלויים כתבנית כמו שלג לבנה. אם זה המקרה, להפסיק להזריק את העובר ולעבור לעובר אחר.
   14. הזרק injectate. הזרק מקסימאלי 700 NL אל תוך חלל קרום הלב כדי למנוע השפעה שלילית על התפתחות לב. לפקח על ההזרקה הנכונה על ידי נפיחות קלה, זמנית של שק קרום הלב.
   15. לאחר הזרקה, למשוך את המחט החוצה ולאשר כי injectate עדיין יכול להיפלט כדי להבטיח שהמחט לא הייתה סתומה על ידי ברי רקמה.
   16. למקם מחדש את שולחן טיפול לתמונה ולהזריק את העובר הבא. שמור את מספר העוברים המוזרקים למקסימאליים 3-4 (בקרן רחם אחת) כדי למנועהרחיב את ההרדמה, כדי לאפשר לעוברי שליטה בקרן הרחם מתנגדת, וכדי להבטיח שההליך לא הפריע התפתחות עוברית.
   17. לאחר שהזריק את המספר הרצוי של עוברים, להסיר ג'ל אולטרסאונד העודף ומניח בעדינות את קרן הרחם בחזרה לתוך הבטן בתנוחה הנכונה.
   18. סגור את הבטן האימהית באמצעות שכבה אחת של תפר להצפק ואת שרירי בטן, ושכבה שנייה של תפר לעור.
   19. הזרק את העכבר עם המנה הראשונה של תרופות לשיכוך כאבים. השתמש בזריקה אחת של 0.05-0.1 דקות מ"ג / קילוגרם עצירות 15 לפני סיום הרדמה ושלוש זריקות נוספות עם 12 מרווחי שעה.
   20. להפסיק את ההרדמה ולנטר את העכבר להתאוששות נאותה מההליך. בית העכבר בהריון בכלוב נפרד למשך הרצוי של מעקב.

תוצאות

שימוש בפרוטוקולי ההזרקה שתוארו לעיל, יכולים להיות מתויגים תאים ו / או מוזרק ללב העכבר העוברי. כהוכחה של מושג, כמה דוגמאות מוצגות בי פרוטוקול ההזרקה וvivo לשעבר explant AVC, לב מבודד, או תרבות עובר כולו אוחדו (איור 1).

איור...

Discussion

לשעבר פרוטוקולי ההזרקה תוך לב vivo שתוארו לעיל נועדו לשמור על תפקוד שריר הלב לפחות 48 שעות באמצע הבמה עוברים (E9.5-E11.5) עכבר. הזרקת גישות אלה מאפשרים להזרקה ממוקדת במרחב של ה-DNA או תאים. כמה דוגמאות שמוצגים איורים 1-3 לספק הוכחה של קונספט להתוויית vivo לשעב?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Setups/Hardware
40 MHz Transducer	VisualSonics	MS550S
Microinjector	VisualSonics
Microinjector	Eppendorf	5242
Micromanipulator	Eppendorf	5171
Nitrogen			required to pressurize the injector
Rail system	VisualSonics
rotator			to rotate glass tube with embryos inside the incubator
Standard incubator			5% CO2, 37 °C
stereomicroscope	Zeiss	Discovery. V8
Vevo 2100	VisualSonics
Microinjection
Borosilicate capillary tubes	World Precision Instrument	KTW-120-6	1.2-μm external diameter
Pipette puller	Sutter	Model P87
Microinjection needles	Origio-Humagen	C060609	OD/ID 1.14 mm/53 mm, with 50/35 μm OD/ID tip
Hamilton syringes
Petri dishes			10-cm diameter
Mineral oil	Sigma	M8410
Silicon membrane	Visualsonics		4.3 x 4.3 cm
Play-Doh
Isoflurane	Vet One
hair removal agent	Nair
Eye lubricant	Optixcare	31779
Electrode gel (Signa)	Parker
Suture	Sofsilk 5-0	S1173
Ultrasound gel	Aquasonic
Buprenex Buprenex (buprenorphine hydrochloride)	Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc.	NDC 12496-0757-1	0.05-0.1 mg/kg in saline
Other
Silicone Elastomer	Dow Corning	Sylgard 184
Glass petridishes	Fine Science Tools		60-mm diameter
Insect pins	Fine Science Tools	26002-20
Media and culture reagents
Optimem medium	Life Technologies	51985026
M2 medium	Sigma	M7167
Dulbecco’s Eagle Medium	Lonza	BE12-640F	high glucose and 50% rat serum
M16 medium	Sigma	M7292
Rat serum	Janvier	ODI 7158
Pennicilin/streptomycin	Life Technologies	15140-12
oxygen 40%	Air liquid		required to oxygenate the embryo culture medium
Fetal calf serum	Fisher	RVJ35882
Matrigel	BD	356230
Collagen type I	BD	354236	to coat culture dishes for explant culture
Culture dishes	Dutcher /Orange	131020
Injectates
CDCFDA-SE	Invitrogen/Molecular Probes	C1165	25 mg/ml DMSO. Store at -20 °C. Dilute 1:100-200 in saline before use.
PGK-GFP-expressing lentivirus			~8E9 transducing units/ml DMEM
Lipofectamine 2000	Life Technologies	11668019