JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

The ubiquitous second messenger c-di-GMP controls growth and behavior of many bacteria. We have developed a novel Capture Compound Mass Spectrometry based technology to biochemically identify and characterize c-di-GMP binding proteins in virtually any bacterial species.

Abstract

התקדמות ניכרת נעשתה בעשור האחרון לזיהוי והאפיון של אנזימים מעורבים בסינתזה (cyclases diguanylate) והשפלה (phosphodiesterases) של השליח השני ג-di-GMP. בניגוד לכך, מעט מידע זמין לגבי המנגנונים המולקולריים ומרכיבים תאיים שדרכו מולקולת איתות זה מסדיר מגוון רחב של תהליכים תאיים. רוב חלבוני מפעיל הידועים שייכים למשפחת פילץ או הידרדרו cyclases diguanylate או phosphodiesterases שויתר על קטליזה ואמצה פונקצית מפעיל. לכן, כדי להגדיר טוב יותר את רשת ג-di-GMP הסלולרי במגוון רחב של חיידקי שיטות ניסיוניות נדרשות לזהות ולאמת effectors רומן שאמין בתחזיות סיליקון ולהיכשל.

יש לנו לאחרונה פיתחתי תרכובת רומן לכידת ספקטרומטריית מסה (CCMS) המבוססת על טכנולוגיית ככלי רב עוצמה לביוכימית לזהות ולאפיין מחייבים חלבוני c-di-GMP. טכניקה זו כבר דווחה בעבר להיות ישים למגוון רחב של אורגניזמים 1. כאן אנו נותנים תיאור מפורט של הפרוטוקול שאנו מנצלים לחקור רכיבי איתות כזה. כדוגמא, אנו משתמשים Pseudomonas aeruginosa, הפתוגן אופורטוניסטי שבי ג-di-GMP משחק תפקיד קריטי בשליטת ארסיות וbiofilm. CCMS זיהה 74% (38/51) של הרכיבים הידועים או צפויים של רשת ג-di-GMP. מחקר זה מסביר את הליך CCMS בפירוט, וקובע אותה ככלי רב עוצמה ורב-תכליתי לזהות רכיבי רומן מעורבים באיתות מולקולה קטנה.

Introduction

ג-di-GMP הוא שליח שני מרכזי המשמש את רוב החיידקים לשלוט בהיבטים שונים של הצמיחה והתנהגותם. לדוגמא, c-di-GMP מסדיר התקדמות תא מחזור, תנועתיות והביטוי של exopolysaccharides וadhesins משטח 2-4. באמצעות התיאום של תהליכים כאלה ג-di-GMP מקדם היווצרות biofilm, תהליך אשר מזוהה עם זיהומים כרוניים של מגוון רחב של חיידקים פתוגניים 5. ג-di-GMP הוא synthetized על ידי אנזימים הנקראים cyclases diguanylate (DGCs) כי נמל תחום GGDEF קטליטי 4. DGCs כמה בעלי אתר מעכב שלמטה מסדיר את פעילות cyclase על ג-di-GMP מחייב. השפלה של c-di-GMP היא זרז על ידי שני סוגים שונים של phosphodiesterases (PDEs) חסה או EAL קטליטי או HD-גיפ תחום 6,7.

רוב חלבוני מפעיל הידועים כי ישירות לאגד ג-di-GMP שייך לאחד משלושה סוגים של חלבונים: קטליטיתחומים ברית פעילים GGDEF או EAL ותחומים פילץ, מתגים מולקולריים קטנים שעוברים שינויי קונפורמציה על ג-di-GMP מחייב 8. חלבוני DGCs, PDEs ופילץ מאופיינים היטב וניתן לחזות תחומיהם בסיליקון ויחסית בשלום. עניין מיוחד מתמקד כעת על זיהוי של סוגים חדשים של effectors ג-di-GMP. effectors חלק ג-di-GMP עם מוטיבים שונים מחייבים תוארה כזה לאחרונה כCRP Bcam1349 / FNR משפחת החלבון בBurkholderia cenocepacia או FleQ רגולטור תעתיק בפ aeruginosa 9,10. בנוסף, riboswitches ג-di-GMP ספציפי זוהו לאחרונה ומוצג לשלוט ביטוי גנים באופן c-di-GMP תלוי 11. המוטיבים ג-di-GMP המחייב של effectors שונה רק בצורה גרועה נשמרת ביצוע תחזיות bioinformatic של חלבונים כגון קשות. כדי לטפל בבעיה זו, פיתחנו שיטה ביוכימית, המבוסס על השימוש בSPE ג-di-GMPבשילוב מגרש לכידת cific עם ספקטרומטר מסת 1,12,13.

יש לנו לאחרונה מהונדס מתחם לכידת ג-di-GMP trivalent רומן (CDG-CC, איור 1) 1. פיגום כימי זה מורכב מ: 1) מחצית ג-di-GMP שימש כפיתיון כדי ללכוד ג-di-GMP מחייב חלבונים, 2) קבוצה תגובתי UV-photoactivatable נהגה לחצות קישור CDG-CC לחלבונים מחויבים ו 3) ביוטין לבודד את החלבונים שנתפסו באמצעות חרוזים מגנטיים streptavidin מצופה. CDG-CC ניתן להשתמש ישירות ובאופן ספציפי כדי ללכוד effectors ג-di-GMP מתערובת מורכבת של מקרו-מולקולות כlysates תא. מתחם לכידת מבוסס וגישות המבוססות פרוטאומיקה כימיות בעבר כבר דיווחו להיות ישים למגוון רחב של אורגניזמים, למשל Caulobacter crescentus, typhimurium serovar enterica סלמונלה וP. aeruginosa 1,14.

במאמר המתודולוגי הזה,אנו מספקים בתיאור מעמיק של הליך CCMS באמצעות תמציות של פ aeruginosa כדוגמא. מחקר זה קובע CCMS ככלי רב עוצמה ורב לזהות ביוכימית רכיבי רומן המעורב באיתות מולקולה קטנה.

Protocol

1. הכנת lysate

  1. לגדול P. תאי aeruginosa בLB לOD הרצוי.
    הערה: לקבלת הדרכה: להשתמש ≈ 100 מיליליטר תרבות / מדגם לתרבויות שלב נייחים ו -500 ≈ cultur מיליליטר / מדגם לתרבויות שלב יומן (600nm OD = 0.5).
  2. גלולה ידי צנטריפוגה למשך 20 דקות ב 5000 x גרם.
  3. ז Resuspend 0.5-1 של גלולה במאגר תמוגה 1 מיליליטר (6.7 מ"מ MES, 6.7 מ"מ HEPES, 200 מ"מ NaCl, 6.7 מ"מ כץ, 1 DDT מ"מ, pH 7.5) ולהוסיף מעכבי פרוטאז (מיני מלא, ללא EDTA) וכן כDNaseI.
  4. Lyse את התאים על ידי 3 מעברים דרך תא לחץ צרפתי, ב -20,000 psi (ראה חומרי רשימה).
  5. Ultra-צנטריפוגה lysate התא בg x 100,000 עבור שעה 1 על 4 מעלות צלזיוס.
  6. שמור את supernatant (עבור לשלב 2).
  7. שטוף את הכדור עם 1 מיליליטר 1x חיץ תמוגה על ידי pipetting מעלה ומטה.
  8. Ultracentrifuge בg x 100,000 עבור שעה 1 ב 4 מעלות צלזיוס.
  9. Flash-להקפיא את גלולה בחנקן נוזלי ולאחסן ב -20 ° C עד משמשים ללכידתו של חלבונים בממברנה (ראה שלב 3).

2. ההסרה של נוקלאוטידים חינם ג-di-GMP ואחרים (שבר מסיס בלבד)

  1. לשטוף טור desalting PD10 (חומרים לראות רשימה) עם 10 מיליליטר של חיץ תמוגה הקר.
  2. יוצקים את supernatant (≈ 1 מיליליטר) על PD10 על מנת להסיר נוקלאוטידים.
  3. Elute עם 4 מיליליטר חיץ תמוגה הקרה (500 צעדי μl).
  4. בחר את השברים מרוכזים ביותר, כפי שנקבע על ידי assay ברדפורד, וברכתם.

3. גלולה Resuspension וsolubilization (שבר ממברנה בלבד)

  1. Resuspend גלולה ב500 עד 1,000 μl של חיץ לכידת 1x (ללא חומר ניקוי) (ראה טבלה 1).
    הערה: גלולה קשה resuspend. מומלץ פיפטה עד ראשונה ומטה עם טפטפת לכ resuspend גלולה, אז להשתמש במזרק 27 G לhomogenize הפתרון טוב.
  2. הוסף 1% (w / v) n-dodecyl-β-D-maltopyranoside (DDM).
  3. דגירה על 4 מעלות צלזיוס לפחות 2 שעות (או O / N) על גלגל מסתובב.
  4. Ultracentrifuge בg x 100,000 עבור שעה 1 ב 4 מעלות צלזיוס.
  5. קציר supernatant.

מדידת ריכוז חלבון 4.

  1. למדוד את ריכוז החלבון על ידי assay ברדפורד (על ידי assay BCA לשבריר הקרום).
  2. הגדר את ריכוז החלבון הכולל עד 10 מ"ג / מיליליטר.

5. לכידה

  1. מערבבים 300 מיקרוגרם של חלבון עם 1 מ"מ מהתמ"ג, GTP, ATP, CTP, ו -20 μl של חיץ לכידת 5x (100 מ"מ HEPES, 250 מ"מ כץ, 50 מ"מ MgAc, גליצרול 5%, pH 7.5) (טבלת 1). התאם את נפח התגובה ל -100 μl עם H 2 O.
    הערה: הנפח הכולל כולל את הנפח של CDG-CC וג-di-GMP במקרה של שליטת התחרות (ראה שלב 5.3 וטבלה 2).
    הערה: כל הניסויים בוצעו בשנת 200 ורצועות l 12-צינור PCR (Thermo Scientific); # 181.
    הערה: לשבריר הקרום, לוודא תמיד לשמור על ריכוז DDM מעל ריכוז micelle הקריטי (0.01% w / v) עד שלב solubilization החלבון ב 8 M אוריאה (שלב 7.1).
  2. דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות על גלגל מסתובב.
  3. להוסיף 10 מיקרומטר CDG-CC (ריכוז סופי).
    הערה: כוללת שליטה ללא CDG-CC (המכונה בשם "שליטת חרוז"), ושליטה בתוספת 1 ​​מ"מ ג-di-GMP ("שליטת תחרות") (ראה טבלה 2).
    הערה: ריכוז CDG-CC יכול להיות מותאם 1-10 מיקרומטר.
  4. דגירה על 4 מעלות צלזיוס לפחות 2 שעות (O / N לשבריר הקרום) על גלגל מסתובב, בחושך.
  5. לאחר סיבוב קצר, קישור צולב על ידי הפעלה של מחצית התגובה של CDG-CC עם אור UV למשך 4 דקות, באמצעות CaproBox (ראה חומרי רשימה, λ = 310 nm, irradiance ≥10 mW / cm², מרחק מהמקור = 2 סנטימטר). הערה: להסיר את המכסה של הרצועות cross-linking לפני.
  6. הוסף 25 μl 5x חיץ לשטוף (5 M NaCl, 250 מ"מ טריס, pH 7.5) ו -50 μl של חרוזים מגנטיים streptavidin גם מושעים, בעדינות homogenize.
  7. דגירה על 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 על גלגל מסתובב.

6. שלבי כביסה

הערה: (מגנט: ראה חומרי רשימה). התחל עם לכידתו של חרוזים המגנטיים במכסה רצועת PCR, עם המגנט. לאחר מכן להחליף את רצועת PCR על ידי אחד חדש המכיל את פתרון הכביסה הבא. הסר את המגנט וresuspend את החרוזים, דגירה 2 דקות. ספין למטה ולהחליף את המכסה על ידי מכסה טרי.

  1. צעדי כביסה (חלק מסיס בלבד)
    1. לשטוף 6 פעמים ב 200 חיץ הכביסה μl 1x.
    2. לשטוף פעם אחת בכיתת ח HPLC 200 μl 2 O.
    3. לשטוף 6 פעמים ב 200 אצטוניטריל 80% μl.
    4. לשטוף 2 פעמים בH הכיתה HPLC 200 μl 2 O.
  2. צעדי כביסה (membraחלק ne בלבד)
    1. לשטוף 5 פעמים ב 200 חיץ הכביסה 1x μl DDM + 0.1%.
    2. לשטוף 2 פעמים ב 200 חיץ הכביסה 1x μl DDM + 0.05%.
    3. שטפי פעם ב -200 כביסה חיץ 1x μl DDM + 0.025%.
    4. שטפי פעם ב -200 כביסה חיץ 1x μl DDM + .0125%.
    5. לשטוף 3 פעמים ב200 μl 100 מ"מ ABC (אמוניום ביקרבונט, NH 4 CO 3) + 2 M אוריאה.

7. הכנת מדגם MS

  1. Resuspend חרוזים (ישירות במכסה) ב -20 μl 100 מ"מ ABC (100 מ"מ ABC + 8 M אוריאה לשבריר הקרום) ולהעביר לתוך צינורות 1.5 מיליליטר.
  2. חלק קרום רק: לדגור על 60 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, רועד ב 500 סל"ד.
  3. הוסף 0.5 μl 200 מ"מ TCEP (טריס (2-carboxyethyl) phosphine) ולדגור על 60 מעלות צלזיוס במשך שעה 1, רועד ב 500 סל"ד. להתקרר עד 25 מעלות צלזיוס.
  4. הוסף 0.5 μl של מוכנים טרי 400 מ"מ iodoacetamide ולדגור על 25 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, רועדt 500 סל"ד ובחושך.
  5. הוסף 0.5 μl 0.5 -acetyl-ציסטאין M N ולדגור על 25 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, רועד ב500 סל"ד.
  6. חלק קרום רק: להוסיף μl 1 ליס-C ולדגור על 37 מעלות צלזיוס, O / N.
  7. הוסף 2 מיקרוגרם טריפסין ודגירת O / N ב 37 מעלות צלזיוס, רועדת ב 500 סל"ד (לעטוף בParafilm כדי למנוע התייבשות).
    הערה: ניתן לאחסן הדגימות ב -20 ° C בשלב זה.
    הערה: חלק קרום רק: להוסיף 100 מ"מ ABC כדי להתאים את ריכוז האוריאה ל< 2 M לפני תוספת של טריפסין.
  8. בקצרה ספין למטה הצינורות ולאסוף החרוזים עם המגנט.
  9. מעביר את supernatant לתוך צינור 1.5 מיליליטר חדש (חזור על שלב זה אם חרוזים הם עזבו).
  10. הוסף 5 μl 5% TFA (חומצת trifluoroacetic) + 1 μl 2 M HCl (15 μl 5% TFA + 5 μl 2 M HCl לשבריר הקרום).
  11. עמודות המצב C18 MicroSpin (קבוצת קן, מסצ'וסטס, ארה"ב) 150 עם μl אצטוניטריל (ספין 20 שניות ב2,400 סל"ד).
  12. שוהlibrate עמודות C18 2 פעמים 150 עם μl 0.1% TFA (ספין 20 שניות, 2,400 סל"ד).
  13. טען את מדגם ספין 2 דקות, 2,000 סל"ד.
  14. רענן הזרימה דרך על הטור ולחזור על שלב ספינינג (2 דקות, 2,000 סל"ד).
  15. לשטוף 3 פעמים 150 עם μl 0.1% TFA, 5 אצטוניטריל% (20 שניות, 2,400 סל"ד).
  16. קח צינור חדש וelute פעמיים עם 150 0.1% TFA μl, אצטוניטריל 50% (2 דקות, 2,000 סל"ד).
  17. ייבש את פפטידים במהירות-VAC.
  18. Resuspend ב -40 μl 98% 2 O, אצטוניטריל 2%, 0.15% חומצה פורמית H.
  19. 20 שניות Sonicate (מחזור דופק 0.5, 100% משרעת; ראה חומרי רשימה) וספין למטה 5 שניות, 12,000 סל"ד (צנטריפוגות benchtop). מערבולת 10 שניות, וספין למטה 5 שניות, 12,000 סל"ד. העבר בבקבוקון HPLC לניתוח LC-MS / MS.
  20. להקפיא ב -20 ° C.
    הערה: ניתן לאחסן הדגימות ב -20 ° C בשלב זה.

8. LC-MS / MS ניתוח

  1. equipp לרוץ ננו-LC (מערכות ננו-LC)ed עם טור RP-HPLC (75 מיקרומטר x 37 סנטימטרים) ארוז עם שרף C18 (Magic C18 AQ 3 מיקרומטר) באמצעות שיפוע ליניארית מ -95% (0.15% חומצה פורמית, אצטוניטריל 2%) ממס ו -5% B ממס ( אצטוניטריל 98%, 0.15% חומצה פורמית) עד 35% B ממס על 60 דקות בקצב זרימה של 0.2 μl / min.
  2. נתח את פפטידים באמצעות LC-MS / MS (ספקטרומטר מסת לחץ כפול LTQ-Orbitrap ולוס, מחובר למקור יון electrospray).
    הערה: מצב רכישת נתונים הוקם כדי להשיג רזולוציה גבוהה אחד MS לסרוק בחלק FT של ספקטרומטר המסה ברזולוציה של 60,000 FWHM אחריו סריקות MS / MS במלכודת היון ליניארי של 20 יונים אינטנסיביים ביותר. כדי להגביר את היעילות של ניסיונות MS / MS, מודוס הקרנת המדינה הטעון התאפשר להוציא שלא הוקצה וביחידים גובה יונים. ניתוק מושרה קנוניה היה מופעל כאשר המבשר עלה 100 ספירת יון. משך ההדרה הדינמי נקבע ל -30 שניות. זמן הצטברות היון נקבע ל -300 אלפיות שניים (MS) ו -50msec (MS / MS).

חיפוש 9. Database

  1. הורד את P. aeruginosa צמח השדה-מסד נתונים באמצעות דף הבית של צמח השדה (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
  2. להמיר את ספקטרום MS הגלם לתוך קבצים גנריים קמע (MGF) באמצעות כלי MassMatrix ההמרה (http://www.massmatrix.net/mm-cgi/downloads.py).
  3. חפש קובץ MGF זה באמצעות גרסת 2.3 קמע נגד פ aeruginosa צמח השדה-מסד נתונים המכילים קדימה וערכי חלבון הפוך דמה.
  4. לבצע בעיכול טריפסין סיליקון ואחרי ליזין וארגינין (אלא אם כן אחריו פרולין) לסבול שתי החמיצו שסעים בפפטידים tryptic באופן מלא.
  5. הגדר את הפרמטרים חיפוש באתר על מנת לאפשר methionines המושחר (15.99491 Da) כשינויים וcarboxyamidomethylation (57.021464 Da) של שאריות ציסטאין כשינוי קבוע משתנים. לקמע חיפושינוing סריקות ברזולוציה גבוהה, להגדיר את הסובלנות ההמונית מבשר על 15 עמודים לדקה ולהגדיר את הסובלנות ההמונית הבר 0.6 Da. לבסוף, קבע את החלבון FDR עד 1%.
  6. ייבא את חיפושי הקמע של פ ניסויי aeruginosa CCMS לפיגום (Proteomesoftware, גרסה 3), להגדיר את הפרמטרים להשגה קרוב FDR חלבון ל -1%, ולחלץ כוללת ספירת הרפאים.
  7. לקבלת תוצאות הנציג שהוצגו במאמר זה, השתמשנו במבחן T לזווג להשוות את הניסוי עם שליטת התחרות, ונחשבו ללהיטים עם ערך p להלן 0.1, ויחס ספירת רפאים מעל 2 (להתנסות ספירת רפאים / רפאים שליטת תחרות רק ספירה).
  8. הנתונים ניתן לייצא בכל תוכנת גיליון אלקטרוני לצורך ניתוח נוסף.

10. כימות ללא תווית

  1. לייבא את הקבצים הגולמיים לתוכנת Progenesis LC-MS (קוי Dynamics, גרסת 4.0).
  2. לבצע יישור LC-MS וזיהוי תכונה בsetti ברירת המחדלמהה.
  3. לייצא את הנתונים בפורמט MGF מProgenesis LC-MS.
  4. חפש את ספקטרום MS / MS באמצעות הקמע נגד פ צמח השדה מסד נתוני aeruginosa מכילים קדימה וערכי חלבון הפוך דמה.
  5. ייבא את תוצאות החיפוש באתר לProgenesis LC-MS ולמפות את הזדהויות פפטידים לתכונות MS1.
  6. להערכת נתונים (חישוב רמות משמעות, יחסים לקפל-שינוי) את תסריט ProteinSQAnalysis של SafeQuant שימש (סף: ערך q להלן 0.1, יחס ספירת רפאים מעל 2).

תוצאות

לזהות effectors ג-di-GMP רומן בפ aeruginosa באופן שיטתי בשימוש CCMS לנתח את השברים המסיסים וקרום של פ PAO1 aeruginosa מתח מתרבות שלב יומן (OD 600 = 0.5). כאן אנו לסכם ולדון בתוצאות נציג של מסע הדיג הזה. ארבעה העתקים ביולוגיים עצמאיים היו בשימוש. עבור כל ניסוי שני ריכוזי CDG-CC שו...

Discussion

טיפול מיוחד יש לנקוט במספר צעדים לפרוטוקול. ריכוז החלבון הוא פרמטר קריטי בריכוז של 10 מ"ג / מיליליטר להיות קשה להגיע כאשר תאים גדלים בתנאי גידול ספציפיים (למשל biofilms או גרסאות מושבה קטנות). לפיכך, resuspension גלולה צריכה להתבצע בהיקף נמוך של מאגר תמוגה. יכולים להיות יר...

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Alberto Reinders for his work in optimizing the CCMS conditions for P. aeruginosa. We also thank Pablo Manfredifor the annotation of the P. aeruginosa proteins. This work was supported by the Swiss National Science Foundation (SNF) Sinergia grant CRSII3_127433.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
caproBoxcaprotec bioanalytics1-5010-001 (220 V)UV lamps coupled to a cooling 96-plate cooling block, for the photoactivation
caproMagcaprotec bioanalyticsincluded in the CCMS Starter KitFor easy handling of magnetic particles without pipetting
c-di-GMP caproKitcaprotec bioanalyticsupon requestThe kit contains the c-di-GMP-capture compound, c-di-GMP (for the competition control), streptavidin coated magnetic beads, capture buffer, and washing buffer
Disposable PD-10 Desalting ColumnsGE Healthcare17-0851-01 
12-tube PCR stripsThermo ScientificAB-1114
UIS250v sonicator with VialTweeterHielscher ultrasound technologyUIS250v and VialTweeter
Miniature French Pressure CellThermo Electron CorporationFA-003

References

  1. Nesper, J., Reinders, A., Glatter, T., Schmidt, A., Jenal, U. A novel capture compound for the identification and analysis of cyclic di-GMP binding proteins. J Proteomics. 75, 4874-4878 (2012).
  2. Hengge, R. Principles of c-di-GMP signalling in bacteria. Nature reviews. Microbiology. 7, 263-273 (2009).
  3. Sondermann, H., Shikuma, N. J., Yildiz, F. H. You've come a long way: c-di-GMP signaling. Curr. Opin. Microbiol. 15, 140-146 (2012).
  4. Schirmer, T., Jenal, U. Structural and mechanistic determinants of c-di-GMP signalling. Nature reviews. Microbiology. 7, 724-735 (2009).
  5. Furukawa, S., Kuchma, S., O'Toole, G. Keeping their options open: acute versus persistent infections. J. Bacteriol. 188, 1211-1217 (2006).
  6. Christen, M., Christen, B., Folcher, M., Schauerte, A., Jenal, U. Identification and characterization of a cyclic di-GMP-specific phosphodiesterase and its allosteric control by GTP. J. Biol. Chem. 280, 30829-30837 (2005).
  7. Ryan, R. P., Fouhy, Y., Lucey, J. F., Dow, J. M. Cyclic di-GMP signaling in bacteria: recent advances and new puzzles. J. Bacteriol. 188, 8327-8334 (2006).
  8. Habazettl, J., Allan, M. G., Jenal, U., Grzesiek, S. Solution structure of the PilZ domain protein PA4608 complex with cyclic di-GMP identifies charge clustering as molecular readout. J. Biol. Chem. 286, 14304-14314 (2011).
  9. Fazli, M., et al. The CRP/FNR family protein Bcam1349 is a c-di-GMP effector that regulates biofilm formation in the respiratory pathogen Burkholderia cenocepacia. Molecular Microbiology. 82, 327-341 (2011).
  10. Hickman, J. W., Harwood, C. S. Identification of FleQ from Pseudomonas aeruginosa as a c-di-GMP-responsive transcription factor. Molecular Microbiology. 69, 376-389 (2008).
  11. Sudarsan, N., et al. Riboswitches in eubacteria sense the second messenger cyclic di-GMP. Science. 321, 411-413 (2008).
  12. Lenz, T., et al. Profiling of methyltransferases and other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS). J Vis Exp. , (2010).
  13. Köster, H., et al. Capture compound mass spectrometry: a technology for the investigation of small molecule protein interactions. Assay Drug Dev Technol. 5, 381-390 (2007).
  14. Düvel, J., et al. A chemical proteomics approach to identify c-di-GMP binding proteins in Pseudomonas aeruginosa. Journal of Microbiological Methods. 88, 229-236 (2012).
  15. Christen, B., et al. Allosteric control of cyclic di-GMP signaling. J. Biol. Chem. 281, 32015-32024 (2006).
  16. Balasubramanian, D., Mathee, K. Comparative transcriptome analyses of Pseudomonas aeruginosa. Human genomics. 3, 349-361 (2009).
  17. Smyth, G. K. Linear models and empirical bayes methods for assessing differential expression in microarray experiments. Stat Appl Genet Mol Biol. 3 (3), (2004).
  18. Baraquet, C., Harwood, C. S. Cyclic diguanosine monophosphate represses bacterial flagella synthesis by interacting with the Walker A motif of the enhancer-binding protein FleQ. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 18478-18483 (2013).
  19. Nesper, J., Reinders, A., Glatter, T., Schmidt, A., Jenal, U. A novel capture compound for the identification and analysis of cyclic di-GMP binding proteins. J Proteomics. 75, 4874-4878 (2012).
  20. Roelofs, K. G., Wang, J., Sintim, H. O., Lee, V. T. Differential radial capillary action of ligand assay for high-throughput detection of protein-metabolite interactions. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 15528-15533 (2011).
  21. DeSantis, K., Reed, A., Rahhal, R., Reinking, J. Use of differential scanning fluorimetry as a high-throughput assay to identify nuclear receptor ligands. Nuclear receptor signaling. 10, e002 (2012).
  22. Seidel, S. A., et al. Microscale thermophoresis quantifies biomolecular interactions under previously challenging conditions. Methods. 59, 301-315 (2013).
  23. Merighi, M., Lee, V. T., Hyodo, M., Hayakawa, Y., Lory, S. The second messenger bis-(3‘-5’)-cyclic-GMP and its PilZ domain-containing receptor Alg44 are required for alginate biosynthesis in Pseudomonas aeruginosa. Molecular Microbiology. 65, 876-895 (2007).
  24. Qi, Y., et al. Binding of cyclic diguanylate in the non-catalytic EAL domain of FimX induces a long-range conformational change. J. Biol. Chem. 286, 2910-2917 (2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

97crosslinker photoactivabledi GMPEALGGDEFPseudomonas aeruginosa

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved