בידוד מבוסס זיקה של תייג גרעינים מ<em&gt; דרוזופילה</em&gt; רקמות לניתוח ביטוי גנים

Summary

רקמות דרוזופילה בדרך כלל מכילות תערובת הטרוגנית של סוגי תאים. כדי לבחון ביטוי גנים בסוגי תאים מסוימים מרקמה מסוימת, גרעינים יכולים להיות מתויגים גנטי ולאחר מכן מבודד באמצעות גישה המבוססת על זיקה. גרעינים בודדים יכולים לשמש עבור יישומים במורד כגון ניתוח ביטוי גנים וimmunoprecipitation הכרומטין.

Abstract

רקמות עוברי וזחל melanogaster דרוזופילה בדרך כלל מכילות תערובת הטרוגנית מאוד של סוגי תאים, אשר יכול לסבך את הניתוח של ביטוי גנים ברקמות אלה. לכן, כדי לנתח את פרופילי ביטוי גני תא ספציפי מרקמות דרוזופילה, ייתכן שיהיה צורך לבודד את סוגי תאים ספציפיים עם טוהר גבוה ובתשואות מספיק עבור יישומים במורד כגון פרופיל תעתיק וimmunoprecipitation הכרומטין. עם זאת, המורפולוגיה בלתי סדירה הסלולרית ברקמות כגון מערכת העצבים המרכזית, בשילוב עם האוכלוסייה נדירה של סוגי תאים ספציפיים ברקמות אלה, יכול להוות אתגר לשיטות מסורתיות של בידוד תא כגון microdissection לייזר ותא הקרינה המופעל מיון (FACS) . כאן, גישה חלופית לאפיון פרופילי ביטוי גני תא ספציפי באמצעות בידוד המבוסס על זיקה של גרעינים מתויגים, ולא תאים שלמים, הוא תאר. גרעינים בג הספציפיסוג ell עניין מסומנים גנטי עם תג EGFP גרעיני מקומי מעטפה באמצעות מערכת הביטוי בינארי Gal4/UAS. יכולים להיות מבודדים גרעינים מתויג EGFP אלה באמצעות נוגדנים נגד ה-GFP שהם מצמידים את חרוזים מגנטיים. הגישה המתוארת בפרוטוקול זה מאפשר בידוד של גרעינים עולה בקנה אחד מסוגי תאים מסוימים במערכת העצבים המרכזית דרוזופילה הזחל בטוהר גבוה וברמות מספיקות לניתוח ביטוי, גם כאשר אלו סוגי תאים מהווים פחות מ -2% מכלל האוכלוסייה בתא רקמות. גישה זו יכולה לשמש כדי לבודד גרעינים ממגוון רחב של דרוזופילה עוברית וסוגי תאי זחל באמצעות Gal4 נהגים ספציפיים, ועשויה להיות שימושי עבור בידוד גרעינים מסוגי תאים שאינם מתאימים לFACS או microdissection לייזר.

Introduction

רקמות דרוזופילה כגון מערכת העצבים המרכזית מכילות תערובת מורכבת של סוגי תאים. לכן, כדי לנתח את פרופילי ביטוי גני תא ספציפי מרקמות דרוזופילה, יש צורך קודם כל לבודד אוכלוסייה הומוגנית של תאים ספציפיים בכמויות מספיקות כדי לאפשר ליישומים במורד הזרם. שיטות לבודד תאים מרקמות שלמות כוללות microdissection לייזר, ותא הקרינה המופעל מיון (FACS) של כל תאים. בעוד FACS נעשה שימוש כדי לבודד את התאים וגרעינים מעוברי דרוזופילה ומelegans Caenorhabditis לביטוי גנים והכרומטין פרופיל ^1-3, FACS וmicrodissection הלייזר יכולים להיות קשים לביצוע בהצלחה ברקמות המכילות סוגים מעורבבים מאוד תא או תאים מכילים שעם מורפולוגיה לא סדירה, כגון תאי עצב. כדי להתגבר על הקושי הזה, יכול להיות מבודדים מסוגי תאים ספציפיים גרעינים ולא תאים ומשמשים לדור הבאביטוי פרופיל דואר. חשוב לציין, ניתוח ביטוי mRNA microarray המבוסס באמצעות דגימות RNA גרעיניות מראה תוצאות בדרך כלל דומות לזו שבוצעה באמצעות RNA הכולל ^{4, 5.} יתר על כן, ניתוח ביטוי גנים באמצעות RNA הגרעיני שמש בהצלחה ללמוד ביטוי גנים באורגניזמים רבים, כולל ג elegans, thaliana ארבידופסיס, דרוזופילה, ובני אדם ^{4, 5 2, 3.}

לאחרונה כמה גישות תוארו לבידוד של אוכלוסיות ספציפיות של גרעינים שכותרתו מרקמות דרוזופילה המתאימים לניתוח ביטוי גנים ו / או immunoprecipitation הכרומטין. הבידוד אצווה של הכרומטין רקמות ספציפיות לשיטת immunoprecipitation (סיביות שבב) מנצל FACS לבודד את גרעינים קבועים על הבסיס של ביטוי תאים מסוג מסוים של ה-GFP-לוקליזציה הגרעינית ^2. גישה זו כבר successfully משמש כדי לנתח את התפלגות שינויי היסטון וגורמי שעתוק באמצעות immunoprecipitation הכרומטין של גרעינים מבודדים מהמזודרם בעוברי דרוזופילה ^2. עם זאת, גישות מבוססות FACS עשויות להיות פחות מתאימות לבידוד גרעינים שכותרתו, המהווים רק חלק קטן מאוכלוסייה מעורבת בשל זמן מין המוגבר הדרוש כדי להשיג מספרים מתאימים ליישומים במורד הזרם. כדי להתגבר על מגבלות אלה, כמה קבוצות יש שימוש בטכניקות בידוד מבוסס זיקה לטהר גרעינים שמסומנים עם epitope ספציפי בסוג תא מסוים. לאחרונה הבידוד של גרעינים מתויגים בסוגי תאים מסוימים בשיטה (שלמה) שפותחו לשימוש בthaliana ארבידופסיס ^{6, 7} הותאם לשימוש בדרוזופילה ^8. בשיטה זו, חלבון היתוך מעטפת גרעין שהוא מצע לin vivo biotinylation הוא coexpresSED עם האנזים ביוטין החיידקים Escherichia בירה בסוגי תאים ספציפיים. גרעינים שכותרתו ביוטין יכולים להיות מטוהרים לאחר מכן מאוכלוסיות מעורבות באמצעות בידוד זיקה מבוסס streptavidin. שימוש בגישה זו, גרעינים תויגו בהצלחה ומבודדת מהמזודרם בעוברי דרוזופילה בי חלבון היתוך מעטפת הגרעין באו לידי ביטוי בשליטה של משפר המזודרם ספציפי ^8. המחברים גם נוצרו חלבוני איחוי מעטפת גרעין שיכול לבוא לידי ביטוי בכל סוג תא שבשליטתו של רצף הרגולציה Gal4, ⁹ כטב"מ. גישה זו היא מסוגלת במהירות בידוד תת קבוצות של גרעינים שכותרתו מאוכלוסיות מעורבות, אבל דורשת שלושה מבנים מהונדסים נפרדים ולכן עשוי להיות מתאים ליישומים גנטיים מסוימים. לאחרונה, גישה שתוארה שביום ראשון (S AD1 והאו"ם C-84) המכיל חלבונים תחום זה בתרגום להממברנה הפנימית של מעטפת הגרעין תויגו עםחלבוני ניאון והביע תחת שליטה של מערכת Gal4/UAS ^10. גרעינים היו מבודדים בנוכחות של חומר ניקוי nonionic להסיר את הקרום החיצוני של מעטפת הגרעין, וזיקה מטוהרת באמצעות חרוזים מגנטיים מצמידים נוגדנים אנטי-GFP. גישה זו משמשת בהצלחה לבודד אוכלוסיות קטנות של גרעינים שכותרתו מתת עצביים ספציפיים במוח הבוגר בדרוזופילה ^10.

כאן, פרוטוקול לבידוד של גרעינים שכותרתו מאוכלוסייה מעורבת של תאים מרקמות זחל דרוזופילה מתואר. שיטה זו פותחה באופן עצמאי, אך דומה לגישה שתוארה על ידי הנרי ואח'. ¹⁰ ראשית, גרעינים תויגו עם תג הניאון שבא לידי ביטוי רק בסוגי תאים מסוימים בדרוזופילה melanogaster כדי להקל על הבידוד הבא של גרעינים מתויגים מאוכלוסיות מעורבות באמצעות גישה המבוססת על זיקה. כדי לתייג את הגרעינים,תחום KASH (larsicht K / omology שעות yne NC-1 / S) נוצל. תחום KASH הוא תחום הטרנסממברני שמתאים להממברנה החיצונית של מעטפת הגרעין, בחלקו דרך אינטראקציות עם חלבונים המכיל תחום SUN בתוך המרחב perinuclear ^11. תחום KASH טרמינל C-של חלבונים כגון דרוזופילה MSP-300 וKlarsicht מעגן את החלבונים האלה קרום הגרעין החיצוני, בעוד תחומים N-מסוף שלהם אינטראקציה עם חלבוני שלד תא, כגון אקטין או microtubules ^ב12-14 ציטופלסמה. בונה נוצרה בי תחום KASH של דרוזופילה MSP-300 היה התמזגו לC-הסופית של EGFP, תחת שליטה של רצף Gal4 רגולציה, כטב"מ בוקטור pUAST-attB ^{15, 16.} באמצעות אינטגרציה באתר ספציפי phiC31, זבובים מהונדסים נוצרו בי כטב"מ-EGFP :: transgene MSP-300 ^KASH הוכנס בלוקוסי attP2 על כרומוזום3L ^17. כטב"מ-EGFP :: MSP-300 ^KASH זבובים ניתן חצו עם זבובים המבטאים את נהג Gal4 בסוג תא מסוים, וכתוצאה מכך הביטוי הממוקד של EGFP בקרום הגרעין החיצוני בסוג התא של עניין. אז יכולים להיות מטוהרים גרעינים שכותרתו מאוכלוסיות תאים מעורבים באמצעות נוגדנים נגד ה-GFP מצמידים את החרוזים מגנטיים. בגישה זו, השימוש בחומרי ניקוי nonionic לא נדרש כי תג EGFP הוא מקומי לצד cytoplasmic של קרום הגרעין החיצוני, ולכן נגיש לנוגדנים.

הפרוטוקול המתואר להלן יכול לשמש כדי לבודד / להעשיר את הגרעינים שכותרתו EGFP מסוגי תאים ספציפיים ברקמות זחל דרוזופילה, לכמת את טוהר ואת התשואה של גרעינים מבודדים, וכדי לחלץ RNA הגרעיני מתאים לתגובת שרשרת כמותיים הפוך שעתוק פולימרז (qRT -PCR) ניתוח ביטוי גנים. הבידוד וזיקה לטיהור של גרעינים (לא כולל Tissuנתיחת דואר) יכולה להתבצע בפחות משעה. תוצאות מוצגות מראים כי גרעיני גליה ניתן לבודד בהצלחה מהאונה אופטי זחל ודיסק דמותי בעיניים, ומשמשים לניתוח ביטוי גנים שלאחר מכן. זה צפוי כי גישה זו תהיה שימושית עבור הבידוד / ההעשרה של גרעינים שכותרתו מרקמות עוברי וזחל שבו תאי היעד מהווים פחות מ -5% מכלל האוכלוסייה. כל מניות דרוזופילה ופלסמידים שנוצרו במחקר זה הם זמינים מהמחברים על פי דרישה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. דור ואפיון של EGFP :: KASH דרוזופילה

1. נהג הצלב Gal4 טס לכטב"מ-EGFP :: MSP-300 ^KASH זבובים. לחלופין, זבובי רקומביננטי שנושאים גם את נהג Gal4 וtransgene כטב"מ-EGFP :: MSP-300 ^KASH יכולים להיות שנוצרו תוך שימוש בטכניקות גנטיות סטנדרטיות. גישה שנייה זה יתרון אם מספרים גדולים של צאצאים נדרשים.
2. לאפיין ביטוי של סמן EGFP :: KASH תוך שימוש בטכניקות במיקרוסקופ רגיל. הערה: ביטוי EGFP ניתן לצפות על ידי טכניקות מיקרוסקופ רגילות ברקמות דרוזופילה גזורים, קבועים, או בכל זחלים, ואינו דורש שימוש בנוגדן.
   1. לקבוע את דפוס הביטוי של EGFP :: סמן KASH בהאורגניזם כולו תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי לנתח (ראה PDF חומרים). הערה: נהגי Gal4 רבים, כולל נהג repo-GAL4 מוצג באיור 1, n התערוכהדפוסי onspecific ביטוי ברקמות זחל אחרים כגון בלוטת הרוק (ראו תוצאות).
   2. נתח את דפוס ביטוי EGFP :: KASH ברקמה גזור של עניין באמצעות מיקרוסקופיה confocal.
      1. לתקן את הרקמות של עניין באמצעות פורמלדהיד בריכוז סופי של 4%, וה-DNA כתם באמצעות DAPI בריכוז סופי של 0.1 מיקרוגרם / מיליליטר כדי להמחיש את הלוקליזציה של EGFP :: KASH תג ביחס ל-DNA.
      2. לרכוש תמונות או באמצעות אובייקטיבי 40X / 1.30 שמן טבילה או אובייקטיבי 20X / 0.75 טבילת שמן, תלוי בגודל של הרקמה של עניין. תנאי עירור / הפליטה הבאה יכולים לשמש לרכישת תמונה: 408 nm/425-475 ננומטר (DAPI); 488 ננומטר / 525-550 ננומטר (GFP).

2. לבודד את הגרעינים מרקמות הזחל דרוזופילה

1. הכן את הציוד לנתיחת רקמות הזחל ובידוד גרעינים שלאחר מכן. שים לב כיעובר Dechorionated השלם יכול לשמש גם כחומר מוצא אם תרצה בכך. מומלץ להשתמש ברקמות זחל גזורים באופן חלקי ולא כל זחלים אם סוג התא של עניין נמצא ברקמות ספציפיות, כגון דיסק דמותי. הפעולה זו מפחיתה ספציפי מחייב, וגם מבטלת בעיות שיכולים להיגרם על ידי ביטוי של כמה נהגי Gal4 בתאי nontarget.
   1. הכן שני זוגות מלקחיים חדים (ראה חומרים PDF), צלחת זכוכית אחד siliconized 9 היטב (ראה חומרים PDF), וPBT (1x PBS, pH 7.4; 20-Tween 0.1%).
   2. Prebind נוגדן ה-GFP לחרוזים המגנטיים. יש להתחיל את הצעד הזה לפני תחילת הניתוח. הוסף 10 μl של חרוזים המגנטיים (Invitrogen, ראה חומרים PDF) ו -2 מיקרוגרם של נוגדן ה-GFP (רוש, ראה חומרים PDF) ל400 μl של חיץ לשטוף (1x PBS, pH 7.4; 2.5 מ"מ MgCl ₂₎ בצינור 1.5 מיליליטר . כמות חרוזים ונוגדנים המשמשים יכולה להיות מותאמת במידת צורך על בסיס הסכום של היעד בסאםple והזיקה המחייבת של הנוגדן לחרוזים.
   3. דגירה חרוזים ונוגדנים עם סיבוב לפחות 30 דקות בטמפרטורת חדר.
   4. מניחים את צינור 1.5 מיליליטר המכיל חרוזים ונוגדנים במעמד המגנטי (ראה חומרים PDF) ולאפשר חרוזים להיקשר המגנטי למשך כ 1-2 דקות. הסר את supernatant המכיל את הנוגדנים מאוגדים ולשטוף חיץ באמצעות פיפטה 1 מיליליטר. חרוזים יישארו מחויבים לקיר של צינור 1.5 מיליליטר בצד הסמוך למגנט.
   5. יש לשטוף את החרוזים פעמיים עם 1 מיליליטר של הצפה לשטוף בכל פעם כאמורה בסעיף 2.1.4. הסר את צינור 1.5 מיליליטר מהמדף המגנטי ולהפוך לרגע כדי לערבב את חרוזים ולשטוף חיץ במהלך כל שלב לשטוף.
   6. אחסן את חרוזים הנכנס נוגדנים בחיץ לשטוף עד מוכן להמשיך עם צעד 2.7. לא צריכים להיות מותר חרוזים להתייבש בכל שלב של הפרוטוקול.
2. לנתח רקמות זחל בPBT ולהעביר את רקמות גזורים לגם של המנה 9 היטב אחד. בדרך כלל, דיסקציה של האונה אופטית ודיסק דמותי עין מ100 זחלי instar שלישיים מספקת מספיק חומר לניתוח ביטוי גנים במורד הזרם הבא בידוד גרעינים.
3. יש לשטוף את הרקמות המבודדות במיצוי מאגר גרעיני (10 HEPES מ"מ-KOH, pH 7.5; 2.5 מ"מ MgCl _2; 10 מ"מ KCl) בצינור 1.5 מיליליטר. העבר את רקמות זחל בודדות למיליליטר Dounce Homogenizer 1 (ראה חומרים PDF) על קרח המכיל 1 מיליליטר של מיצוי מאגר גרעיני טרי. לדגור על קרח למשך 5 דקות. אין צורך להוסיף מעכבי פרוטאז אם RNA הוא להיעקר הבא בידוד גרעינים.
4. לשבש את הרקמה על ידי 20 משיכות עם העלי הרופף ולאחר מכן דגירה מדגם על קרח דק 10 לאפשר לתאים להתנפח. חלץ את הגרעינים מהתאים באמצעות 15 משיכות עם העלי ההדוק. מספר משיכות עם העלי הרופף והדוק צריך להיות מותאם לרקמות שונות וסוגי תאים; המגון עודף יכול לגרוםטעון גרעינים, בעוד המגון מספיק לא לחלץ את כל הגרעינים מהרקמות.
5. סנן את homogenate, אשר מכיל את הגרעינים ופסולת הסלולר, דרך מסננת נקבובית בגודל 40 מיקרומטר (ראה חומרים PDF) שכבר prerinsed עם חיץ המגון גרעיני. לאסוף את homogenate המסונן בצינור טרי.
6. לאסוף דגימות טרום בידוד לניתוח שלאחר מכן כדי לקבוע תשואת גרעינים, שלמות גרעינים, וכדי לקבוע את רמות תעתיק של גנים המטרה לפני גרעיני בידוד.
   1. העברה 50 μl של homogenate המסונן לצינור 1.5 מיליליטר טרי באמצעות פיפטה. זה הוא המדגם טרום הבידוד. הוסף 500 μl של מגיב Trizol (ראה PDF חומרים, זהירות), להפוך לערבב, ולאחסן ב -20 ° C לבידוד לאחר RNA (שלב 3.1).
   2. העברה 20 μl של homogenate המסונן לצינור מיליליטר טרי 1.5.
      1. להוסיף DAPI לריכוז סופי של 0.1 מיקרוגרם / מיליליטר, וincמדגם ubate על קרח דק 10.
      2. העבר את הגרעינים צבעוניים DAPI לcoverslip המצופה פולי-ליזין, ומניח בשקופית מיקרוסקופ. לאטום את coverslip באמצעות לק השקוף.
      3. בדוק את שלמות הגרעינים, ונוכחותם של גרעיני GFP-tagged של עניין באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. הערה: אין צורך לתקן את הגרעינים, או כתם של ה-GFP אם שקופיות אלה מנותחות במהירות סבירה לאחר הכנה (בתוך 24 hr).
   3. העברה 10 μl של homogenate המסונן לצינור מיליליטר טרי 1.5 ולהוסיף 90 μl של חיץ לשטוף (1x PBS, pH 7.4; 2.5 מ"מ MgCl _2). להוסיף DAPI לריכוז סופי של 0.1 מיקרוגרם / מיליליטר, ולדגור על קרח למשך 10 דקות. לקבוע את תשואת הגרעינים במדגם טרום הבידוד באמצעות hemocytometer לספור את גרעיני DAPI החיובי באמצעות epifluorescence תחת מטרת מיזוג 10X.
7. מניחים את צינור 1.5 מיליליטר המכיל חרוזים בכריכת הנוגדנים (שהוכנו בסעיף 2.1.6) במעמד מגנטי,ולאפשר את חרוזים המגנטיים להיקשר לאבן שואבת עבור לפחות 2 דקות כפי שתוארו בסעיף 2.1.4. הסר את החיץ לשטוף מהחרוזים הנכנס נוגדנים באמצעות פיפטה 1 מיליליטר, ולהוסיף את homogenate המסונן משלב 2.5 לצינור 1.5 מיליליטר באמצעות פיפטה 1 מיליליטר.
8. בעדינות להפוך את הצינור מספר פעמים על מנת לערבב, ודגירה על 4 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות עם תסיסה קצה על הקצה. למנוע בועות בצינור במידת האפשר שכן אלו יכולים לגרום להתקבצות של הגרעינים.
9. מניחים את צינור 1.5 מיליליטר המכיל חרוזים בכריכת הנוגדנים וhomogenate במעמד מגנטי, ולאפשר את חרוזים המגנטיים להיקשר לאבן שואבת עבור לפחות 2 דקות כפי שתוארו בסעיף 2.1.4. הסר את homogenate המכיל שבריר הגרעינים מאוגד באמצעות פיפטה 1 מיליליטר.
10. לשטוף את המדגם 3x עם 1 מיליליטר של הצפה לשטוף בכל פעם. הסר את צינור 1.5 מיליליטר המכיל חרוזים, גרעינים ולשטוף חיץ מהמדף ולהפוך לערבב כמה פעמים, ואז למקם את הצינור במעמד המגנטי כמתוארבשלב 2.9 ולהסיר את supernatant באמצעות פיפטה 1 מיליליטר.
11. הוסף 150 μl של חיץ לשטוף את החרוזים, אשר אמור להיות מחויב לגרעיני היעד. זה הוא המדגם שלאחר הבידוד. הכן את הדגימות לבדיקה מיקרוסקופית ומיצוי RNA שלאחר מכן.
    1. העברת 20 μl של מדגם הודעה הבידוד לצינור 1.5 מיליליטר טרי וכתם עם DAPI ולנתח כאמור בסעיף 2.6.2. לספור את ה-GFP / + + DAPI וGFP-/DAPI + גרעינים שנתפסו על ידי חרוזים מגנטיים כדי לקבוע את הטוהר של ה-GFP המועשר + גרעינים במדגם שלאחר הבידוד.
    2. הוסף 1 מיליליטר של מגיב Trizol לשאר מדגם הודעה הבידוד, להפוך לערבב, ולאחסן ב -20 ° C לבידוד לאחר RNA (שלב 3.1). הערה: דוגמאות בTrizol יכולות להיות מאוחסנות במשך כמה שבועות אם יש צורך ב -20 ° C. אין זה הכרחי כדי elute הגרעינים מהחרוזים המגנטיים לפני מיצוי RNA באמצעות מגיב Trizol, becausדואר חרוזים לא להפריע לבידוד RNA שלאחר מכן.

3. לקבוע רמות תמליל בגרעינים מבודדות מרקמות הזחל

1. בודד RNA מהדגימות טרום בידוד ולאחר בידוד הכנה בסעיפים 2.6.1 ו2.11.2 באמצעות הפרוטוקול הסטנדרטי תאר להפקת RNA מבוססת Trizol (ראה חומרים PDF) בשינויים הבאים:
   1. בעקבות משקעים של גלולה RNA, להוסיף 19.2 μl מים RNase חינם ו0.8 μl של מגיב RNASecure (ראה חומרים PDF) לגלולה ולדגור על 60 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות כדי להשבית RNases.
2. קבע את ריכוז RNA עם פלורסנט לצבוע-RNA מחייב, דוגמת ערכת assay RNA קיוביט (ראה חומרים PDF) באמצעות fluorometer QubitR 2.0 הבאות הפרוטוקול של היצרן.
3. לסנתז cDNA באמצעות טרנסקריפטאז הפוך הגברה כגון EpiScrIPT הפוך ערכת טרנסקריפטאז ופריימרים oligodT הבאה הוראות היצרן. הערה: בדרך כלל, 50-100 ng של RNA יוצר cDNA מספיק כדי לבצע ביטוי גנים מרובה מנתח. יש להשתמש בכמויות שווה ערך של טרום בידוד ו-RNA הודעה הבידוד לייצר cDNA.
4. הוספת 180 μl מים nuclease ללא מדגם cDNA 20 μl לדלל את הניתוח הזה פי 10 לפני זמן אמת PCR כמוני (qPCR). דילול זה הוא צעד חשוב, כי דגימות cDNA חי יכולות לעכב את qPCR.
5. הכן תערובת אב qPCR עם פולימראז וdNTPs, 4 pmoles כל אחד מקדימה לאחור תחל, מורכב עם מים סטריליים לסופית עוצמת התגובה של 20 μl.
   1. לתכנן פריימרים qPCR למקד גנים אשר צפוי לבוא לידי ביטוי בסוג התא של עניין, ובשלב ההתפתחותי שבו הרקמה שנאסף. פריימרים עיצוב תוחלת אינטרון אם אפשר, כך שגנומיניתן להבחין בין מוצרי cDNA-PCR. הערה: אם פרופיל ביטוי גנים מסוג תא היעד אינו ידוע, פריימרים נגד eGFP, שצריך לבוא לידי ביטוי באופן ספציפי באוכלוסיית הגרעינים מתויגת, ניתן להשתמש בם כדי לייעל את הפרוטוקול לסוג תא מסוים ורקמות (טבלה 1).
6. לקבוע את רמות התמליל היחסית של כל גן של עניין בדגימות טרום בידוד והודעת בידוד בהשוואה לסדרת דילול של cDNA שהוכנה מכל הרקמה. רמות התעתיק של גנים המטרה צריכה להיות מנורמלות לגן התייחסות כגון Rpl32 (או רצוי כמה גנים התייחסות).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

נהג repo-GAL4 (מספר המניות בלומינגטון 7415) בא לידי ביטוי במיוחד בתאי גליה במערכת העצבים דרוזופילה בשלבים שונים של פיתוח ^18. זבובים שנוצרו ביציבות להביע כטב"מ-EGFP :: MSP-300 ^KASH תחת שליטה של נהג repo-GAL4 תוך שימוש בטכניקות גנטיות סטנדרטיות. כדי לאפיין...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לבודד או מאוד להעשיר במיוחד גרעינים מתויגים מאוכלוסיות תאים מעורבות בעוברי דרוזופילה או רקמות זחל. באמצעות פרוטוקול זה, ניתן לבודד מרקמות גזורים גרעינים בכ 1 שעות. טוהר והתשואה של הגרעינים המבודדים חייבים להיקבע באופן ניסיוני לכל סוג ת...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-chaoptin antibody (mouse, monoclonal)	Developmental Studies Hybridoma Bank	mAB24B10
Anti-GFP antibody (mouse, monoclonal)	Roche	11814460001	This specific antibody is recommended for this protocol. However, alternative antibodies could also be used.
2x Bullseye EvaGreen qPCR Mastermix with ROX	MidSci	BEQPCR-R
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride salt)	Biotium	40011
Dounce Homogenizer (1 ml)	VWR	62400-595
Dumont #5 Tweezers, 11 cm	World Precision Instruments	14095
Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation	Invitrogen	10003D	This specific brand of magnetic beads is recommended for this protocol.
EpiScript Reverse Transcriptase	Epicentre	ERT12910K	http://www.epibio.com/docs/default-source/protocols/episcript-reverse-transcriptase.pdf
Falcon cell strainers, 40 μm pore size	VWR	21008-949	Alternative pore sizes could be used, depending on the size of the target cell nuclei.
Magnetic stand (8 x 1.5 ml tubes)	Millipore	LSKMAGS08
Mini tube rotator	Genemate	H-6700
Qubit starter kit	Life Technologies	Q32871	Similar fluorescence-based methods for quantifying RNA yield could be used. http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/mp32852.pdfZ
RNAsecure (Ambion)	Life Technologies	AM7010	The use of this reagent to inactivate RNAses is optional.
RT-PCR machine Thermal Cycler	BioRad	CFX Connect Thermal Cycler
Siliconized 9-well glass plate	Hampton Research	HR3-134
Stereomicroscope Fluorescence Adapter (Royal Blue (440-460 nm) excitation + yellow barrier	Nightsea		This adaptor enables GFP fluorescence to be examined using a typical dissecting microscope (eg Nikon)
StereoZoom Microscope 83604 Set with 10X Wide Field Eyepieces and Universal Boom Stand	Nikon	SMZ 745
Thermal Cycler	BioRad	T100
Trizol reagent	Life Technologies	15596018	CAUTION; Alternative RNA extraction methods can be used. http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/trizol_reagent.pdf
Tween 20	Amresco	0777-1L