בשיטה חוץ גופית כדי לבחון אינטראקציות בתיווך-E-selectin בין תאים סרטניים בערמונית מחזור שמקורם בתאי חולים ואנדותל האנושי

Summary

הדוח שלנו מתאר שיטה ייחודית כדי לחזות ולנתח אינטראקציות CTC / EC בסרטן הערמונית בתנאי זרימה פיסיולוגיים.

Abstract

גרורות היא תהליך שבו תאים סרטניים לשפוך ממערכת הלימפה וכלי דם גידול הראשוני intravasate דם, ובכך לקבל גישה לextravasate ויוצר נישה משני. Extravasation של תאים סרטניים ממערכת כלי דם דם ניתן ללמוד באמצעות תאי אנדותל (ECs) ותאים סרטניים המתקבלים משורות תאים שונות. מחקרים ראשוניים שנערכו באמצעות תנאי סטטי, אבל זה כבר מתועד היטב כי ECs מתנהג באופן שונה בתנאי זרימה פיסיולוגיים. לכן, מכלולי תא זרימה שונים משמשים כיום לחקר אינטראקציות של תאי סרטן עם ECS. מכלולי תא הזרימה הנוכחיים מציעים תוצאות לשחזור או באמצעות קווי תאים שונים או נוזל בתנאי לחץ גזירה שונה. עם זאת, כדי להתבונן וללמוד אינטראקציות עם תאים נדירים כגון מחזורי תאים סרטניים (CTCs), שינויים מסוימים נדרשים להתבצע להרכבת תא זרימה הקונבנציונלית. CTCsהם אוכלוסיית תאים נדירה בין מיליון של תאי דם. כתוצאה מכך, קשה להשיג אוכלוסייה טהורה של CTCs. זיהום של CTCs עם סוגים שונים של תאים בדרך כלל נמצאים במחזור הדם הוא בלתי נמנע באמצעות העשרה בהווה או בטכניקות דלדול. בדו"ח הנוכחי, אנו מתארים שיטה ייחודית לתאים סרטניים fluorescently תווית במחזור ערמונית וללמוד האינטראקציות שלהם עם ECs במערכת תא זרימה עצמית התאספו. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת נוספת לצפות אינטראקציות בין CTCs ערמונית וכל חלבון של עניין.

Introduction

גרורות היא תהליך רב שלבים מורכבים שנשאר הבינו היטב. ציר יגנד E-selectin/selectin הוכח לשחק תפקיד חשוב בגרורות סרטניים על ידי קידום אינטראקציות דבק עיקריים בין האנדותל של כלי הדם והתאים סרטניים ^1,2. אנדותל (E)-selectin הוא חלבון הטרנסממברני לידי ביטוי על ידי תאי האנדותל הופעלו, ואילו ליגנד שונה E-selectin (ים) באים לידי ביטוי על ידי תאי גידול ^3. במבחנה גישות רבות כבר מועסקות בהצלחה למודל אינטראקציות E-selectin/selectin יגנד בין תאים סרטניים ותאי אנדותל (ECs) ^1. כדי לחקור אינטראקציות אלה, מערכות תא זרימה שונות להיות מועסקות כדי לדמות מערכת כלי דם בדם. בין מכלולי תא זרימה, חדר זרימת לוחות מקבילים (PPFC) בשיתוף עם ECs משמש באופן שגרתי כמבחנת מודל בהדמיה בתנאי לחץ הגזירה vivo. בזהשיטה, ECS גדלים על צלחת 35 מ"מ ולאחר השיג monolayer, ECS מחוברים PPFC וניסויים מבוססי מאמץ גזירה מבוצעים.

עם זאת, PPFC ומערכות שוטפות אחרות להציג מגבלות רבות לחקר אינטראקציות דבק בין תאים סרטניים במחזור (CTCs) נגזרים מחולים וECS, בעיקר, כי CTCs הוא אוכלוסייה נדירה של תאים, לשפוך מן הגידול הראשוני, במחזור בין מיליוני תאי דם (1 CTC לכל 10 ⁹ תאי דם) ^4. לפיכך, בניגוד לאספקה ​​בלתי מוגבלת של שורות תאים בתרבית, ספירת CTC נמוכה להוביל לאינטראקציות CTC / EC כמה ונדירות מאוד, הדורשת רוחב ערוץ זרימה נכון כדי להקליט את האינטראקציות לניתוח השמעה. בנוסף, מאז CTCs נגזר המטופל הוא אוכלוסייה טמאה, ולכן סמן זיהוי נדרש כדי לעקוב אחר CTCs בספציפי. כדי לפתור בעיה זו, פיתחנו שיטה חדשה לזיהוי סרטן הערמונית (PCA) CTCs על ידי ניצול של העובדה שכמעט כל CTCs אלה מבטאים אנטיגן הספציפי לערמונית קרום (PSMA) על פני התא שלהם ^5,6. בדו"ח זה, השתמשנו בשורת תאי סרטן הערמונית, מד"א PCa2b (מד"א), כדי להדגים את התועלת הפוטנציאלית של המערכת החדשה שלנו כדי לחקור אינטראקציות CTC ערמונית עם ECS, סופו של דבר להבין את המנגנון של גרורות.

המתודולוגיה שלנו יכולה להיות מיושמת על ניסויי גזירה מבוססות שונים לדמות במערכת כלי דם vivo ^7-9. חוץ מבחינת אינטראקציות PCA CTC / EC, מערכת תא הזרימה הנוכחית יכולה להתאים בקלות לניתוח תאי הדם היקפיים mononuclear או אינטראקציות של התאים סרטניים עם ECS. הקלות של פירוק והרכבה של תא הזרימה, microslide III ^(0.1) (להלן כmicroslide), מאפשרת culturing ECs תחת זלוף ומגרה ECs עם ציטוקינים שונים כדי לגרום ליחסי ציבורotein ביטוי. חוץ מזה, ECs התרבותי, יכולים להיות מצופים חלבונים רקומביננטיים כגון E-ו-P-selectin על microslide ואינטראקציות עם תאים סרטניים יכול להיות שנצפה בתנאי זרימה למינרית ^10.

Protocol

1. Culturing HUVECs על Microslides לאינטראקציות התבוננות CTC-אנדותל

1. מתחת למכסה המנוע בתרבית רקמה, לשטוף ראשון microslide, רוחב ערוץ של 1 מ"מ עם PBS. בעדינות מעיל microslide עם 200 μl של 50 מיקרוגרם / מיליליטר פיברונקטין (מומס בPBS) באמצעות מזרק Luer נעילת 1 מ"ל.
2. כסה microslide עם המכסה ולשמור אותו בתוך מכסה המנוע בתרבית רקמה למשך 30 דקות. מחלק איטי של הנוזל בmicroslide מונע היווצרות בועה בערוץ.
3. Perfuse 200 μl של (37 מעלות צלזיוס) HUVEC מדיום גידול החם (מדיה M199, 1M HEPES, 20% FBS, 5 מ"ג / מיליליטר הפרין, גורם גדילת תא האנדותל 100 מיקרוגרם / מיליליטר, ו-L-גלוטמין) מעל microslide ודגירה 20 דקות ב RT. במהלך זלוף, להכין את ההשעיה תא HUVEC.
4. יש לשטוף HUVECs עם PBS ולהוסיף 0.05% טריפסין-EDTA במשך 1-2 דקות ב RT. צנטריפוגה HUVECs ב2 מדיום גידול מיליליטר ב 180 XG במשך 5 דקות.
5. למדוד את ריכוז התאים באמצעות neubahemocytometer uer ולהכין 10 ⁷ cells/100 HUVEC μl מדיום גידול. לאחר מכן, להסיר בזהירות את המדיום מהמפרצון של microslide באמצעות פיפטה קצה 200-μl.
6. להביא microslide לגובה עיניים ובאמצעות מזרק Luer נעילת 1 מ"ל, בעדינות ינקב 200 μl ריכוז מוכן של HUVECs לתוך התעלה. זהירות נדרשת בשלב זה כדי למנוע היווצרות בועה. אם הבועות מופיעות, לשמור מרוסס לזמן מעט ארוך יותר עד שבועות להיכנס לערוץ לשקע.
7. שים את הנפח שווה (~ 80 μl) של תקשורת HUVEC בשתי הכניסה והיציאה של microslide. זה מונע את הזרימה של תאים בכל כיוון.
8. כסה את השקופית ולשמור אותו בחממה (C ° 37) ל1.5 שעות.

2. הכנת תזרים עצרת הלשכה ללילה HUVEC התרבות בMicroslide

1. הנח מזרק סטרילי 20-מיליליטר, מחברים Luer נשיים וגברי, צינורות, ומשאבת מזרק בחממה במשך 15 מיילn.
2. עבור נפח מת מינימאלי, השתמש בצינורות עם קוטר פנימי של 0.04 סנטימטרים. קוטר צינורות קטן יותר מונע היווצרות בועה.
3. מלא את מזרק 20 מ"ל עם חמה (37 מעלות צלזיוס) HUVEC תקשורת (12 מיליליטר). צרף את צינורות עם המחברים על המזרק. הסר את הבועות. חבר אסיפה זו לmicroslide.
4. לחלוטין למלא את המפרצון של microslide עם תקשורת HUVEC. להביא את מזרק 20-מיליליטר המלא מצורף למחבר ליד microslide. בעדינות לצרף את המחבר לmicroslide.
5. להביא את ההגדרה לתוך החממה ולחבר אותו למשאבת המזרק, שקיעה ב שיעור הגזירה μl / min 10. השאר את התאים O / N בחממה ב 37 ° C.
6. למחרת, לפרק את ההגדרה על ידי הסרת את המחבר המצורף למפרצון של microslide.
7. לupregulate ביטוי E-selectin על ECS, להכין מדיום גידול טרי המכיל IL-1β ב10 ng / ml ב4 מיליליטר תקשורת. לשאוב את התקשורת במזרק 10 מ"ל. הסר tהוא אמצעי התקשורת מהמפרצון של microslide ולחבר את המזרק לשקופית.
8. הגדר את משאבת המזרק בשיעור הגזירה μl / min 10 עבור 4 שעות בחממה.

תאי סרטן הערמונית 3. הכנת אנטי PSMA (J591-488) תווית

1. במהלך הדגירה IL-1β של HUVECs, להכין תאי PCA J591-alexa488 אנטי PSMA שכותרתו. הוספת 0.05% טריפסין-EDTA לתאי מד"א דקות 1. אל תחשוף את תאי טריפסין לזמנים ארוכים יותר כפי שהוא יכול להשפיע על glycopeptides ההווה על פני התא. גם מגיב תא דיסוציאציה בחינם אנזים יכול לשמש במקום טריפסין. צנטריפוגה ב XG 200 למשך 5 דקות.
2. Resuspend תא גלולה מד"א במאגר H מיליליטר / H 1 (% solution/0.1 מלח מאוזן הנקס HSA/10 HEPES מ"מ / 1 מ"מ CaCl _2). הוסף נוגדן J591-alexa488 אנטי PSMA ב20 מיקרוגרם / מיליליטר ל30 דקות ב RT במקום חשוך. Resuspend התאים במהלך הדגירה.
3. לאחר 30 דקות, צנטריפוגה פתרון התא בXG 800 למשך 5 דקות. ASPIשיעור וresuspend את הכדור במאגר H / H 1 מיליליטר. ספירת תאי מד"א שהכותרת ולהביא את הריכוז הסופי ל1x10 ⁶ תאים / מיליליטר. ממלאי מזרק של 5 מיליליטר עם J591-488 תאי מד"א שכותרתו ולהסיר את הבועות.

4. הכנת אנטי PSMA (J591-488) מועשר CTCs תווית מחולי PCA

1. לאסוף 7.5 דם מיליליטר מחולים בסרטן ערמונית בצינור כחול כובע (המכיל נתרן ציטרט). בעדינות לדלל 01:01 דם ב0.1% BSA / 1 mM EDTA / PBS.
2. הוספת 5.3 מיליליטר Ficoll-Paque תוספת בצינור חרוטי 50 מ"ל. שכבת דילול דם על גבי Ficoll-Paque. צנטריפוגה ב XG 400 ל30 דקות.
3. טרום מעיל כל הצינורות או הטיפים הבאים במגע עם CTCs עם 2% FBS/RPMI-1640 / 1 מ"מ CaCl _2/4 מ"מ MgCl ₂ (חיץ R / S) כדי למנוע מחייב הלא ספציפית של CTCs למשטחים. לשמור על טמפרטורת 4 מעלות צלזיוס של תקשורת ומאגרים הבאים במגע עם CTCs.
4. איסוף תאי הדם ההיקפי mononuclear שבריר (PBMCs)המכיל CTCs מהממשק בצינור אחר 50 מ"ל חרוטי המכילים חיץ R / S 30 מיליליטר. צנטריפוגה ב XG 400 במשך 8 דקות.
5. Resuspend את הכדור ולשטוף שוב במאגר R / S ב XG 400 במשך 8 דקות. לאחר צנטריפוגה, resuspend את הכדור במאגר H / H. הוסף נוגדן אנטי PSMA J591-488 ב20 מיקרוגרם / מיליליטר ל30 דקות ב RT במקום חשוך.
6. לאחר 30 דקות, צנטריפוגות PBMCs מכילה J591-488 CTCs כותרת בXG 800 למשך 5 דקות. Resuspend במאגר H / H. ממלאי מזרק 1 מ"ל (טרום מצופה עם חיץ R / S) עם המדגם.

5. הכנת מיקרוסקופ, מזרק משאבה וזרימת עצרת קאמרית

1. הפעל את מיקרוסקופ ההפוכה ולהגדיר את תאורת קולר ב10X אובייקטיבי. להביא את משאבת המזרק באותה הרמה כמו בשלב המדגם של מיקרוסקופ ולהגדיר אותו בלחץ dyn ^1/2 סנטימטר גזירה (~ 10 μl / min).
2. פתח את תוכנת Zeiss AxioVision. בחר את המטרה על מסך המחשב. צור חדשתיקייה תחת אפשרות הכלים בתוכנה.
3. פתח את אפשרות ניסויים החכמים בAxioVision ולהתאים את ההגדרות כדי להקליט קטעי וידאו שניות קצרים 30 ל30 דקות.
4. עבור וידאו ניאון חי, להגדיר את האפשרויות-12 תמונה msec החשיפה, 2 x 2 סל, 5 רווח. פרמטרים אלה מסייעים בהשגת קטעי וידאו קרוב למסגרת שיעור וידאו (~ 23 מסגרות לשנייה) עם המצלמה Zeiss MRM.
5. כדי להמחיש את הרוחב מלא של ערוץ הזרימה ב10 אובייקטיבי X על מסך המחשב, להשתמש במתאם C-Mount (0.63 ממשק xf/60 מ"מ).
6. מדליק את מנורת הכספית.
7. הנח את המזרק והמחבר המכיל את התאים על גבי משאבת המזרק.
8. להביא IL-1β מגורה HUVECs מן החממה. חבר את המחבר לערוץ כניסה המלא של microslide מכיל HUVECs.
9. חבר את הערוץ לשקע עם המחבר המחובר לצינורות. שים את הצינור לתוך צלחת או 15 צינור חרוטי מיליליטר לאסוף את הזרימה דרך.
10. התחל infusiעל דרך microslide ב10 μl / min. שים לב ליחסי הגומלין בין תאי אנדותל ותאי מד"א שכותרתו או CTCs שכותרתו נגזר מחולים תחת מסנן 488 ננומטר במיקרוסקופ epifluorescence.
11. להתחיל להקליט את הניסוי כקטעי וידאו קצר 30 שניות. במהלך ניתוח השמעה, למדוד את המהירות מתגלגלת. מהירות רולינג נמדדה על ידי חלוקת המרחק שעובר התאים לאורך זמן.

6. Immunostaining של Microslide

1. הסר את המדיה מהכניסה והיציאה של microslide לאחר מרוסס תאי מד"א על ​​IL-מגורה 1β HUVECs 10 דקות.
2. באמצעות קצה 200-μl, לשים חם (37 מעלות צלזיוס) PBS המכיל סידן ומגנזיום לתוך המפרצון של microslide למשך 5 דקות. הטה את microslide באמצעות המכסה שלה כאבזר על הספסל. שמור microslide בעמדה מוטה לכל incubations במהלך immunostaining.
3. תקן HUVECs ידי מרוסס פורמלדהיד 2% חמים לתוך המפרצון
4. דגירה של 20 דקות ב RT. יש לשטוף פעמיים עם PBS במשך 5 דקות כל אחד.
5. הוספת Triton-X 100 (0.1%) BSA 5% ב-PBS עבור 10 דקות ב RT.
6. יש לשטוף פעמיים עם PBS במשך 5 דקות כל אחד. לחסום עם BSA 5% ב-PBS למשך 30 דקות.
7. דגירה עם עז נוגדן ראשוני נגד VE-cadherin (1:100) ב2.5% O BSA / N ב 4 ° C.
8. למחרת, לשטוף פעמיים עם PBS במשך 5 דקות כל אחד. הוסף נוגדן אנטי עז 647 חמור משנית ל45 דקות. לשטוף פעמיים עם PBS במשך 5 דקות כל אחד.
9. לדגור על RT עם נוגדנים מצומדות אנושיים J591-alexa488 במשך שעה 1.
10. לשטוף פעמיים עם PBS במשך 5 דקות כל אחד. להוסיף DAPI למשך 5 דקות. לשטוף עם מים מזוקקים למשך 5 דקות.
11. הוסף PBS (או Mowiol עבור אחסון לטווח ארוך). דמיין microslide תחת מיקרוסקופ confocal.

תוצאות

איור 1 מציג את תרבות O / N של monolayer של ECs על microslide. Scalings באיור 1A מראה כי של microslide 100% גלויים באמצעות אובייקטיבי 5X תוך 70% גלויים באמצעות מטרת 10X (איור 1). עבור אינטראקציות E-selectin בתיווך, תאים מתגלגלים בקצוות אינם נחשבים שהופך יותר מ -70% מmicroslide זמינים ל?...

Discussion

בשל המספר הנמוך של CTCs בין תאי דם, קשה לבודד CTCs כאוכלוסייה טהורה של תאים. כדי לחקור אינטראקציות CTC / EC, האוכלוסייה נדירה וטמאה של CTCs מציבה שני אתגרים מרכזיים: א) זיהוי של CTCs בין תאי דם; ב) תצפית של אינטראקציות CTC / EC.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microslide	Ibidi	80331
Fibronectin	Millipore	FC010
Plastic tubing	Cole Parmer	EW-96115-08
Male Luer adapter	GlycoTech	31-001
Female Luer adapter	GlycoTech	31-001
Syringe pump	Chemyx Inc	Fusion 100
Luer-lock syringe	BD Biosciences	309628
M199 medium	Sigma	M7653
Endothelial Mitogen	Biomedical Technologies	BT-203
HBSS	Sigma	H9269
Anti-PSMA J591-488	Weill Cornell Medical College-Lab of Urologic Oncology
Interleukin-1 beta	Peprotech	200-01B
Trypsin	Millipore	SM-2002-C
Heparin	Sigma	H-3149
HUVECs	Weill Cornell Medical College-Department of Surgery		provided by Marco Seandel
VE-Cadherin	Santa Cruz	sc-5648
10x objective	Zeiss Plan Neofluar
Enzyme free cell dissociation reagent	Millipore	S-004-C
RPMI-1640	Lonza	12-702-F
Ficoll-paque plus	GE healthcare	17-1440-02