השומנים bilayer שלפוחיות דור שימוש Microfluidic jetting

Summary

jetting microfluidic נגד bilayer שומנים ממשק אגל מספק דרך אמינה כדי ליצור שלפוחית ​​עם שליטה על חוסר סימטריה בממברנה, שילוב של חלבונים הטרנסממברני, ואנקפסולציה של חומר. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת כדי ללמוד מגוון רחב של מערכות ביולוגיות שבי ביומולקולות הממודרת הן רצויה.

Abstract

ביולוגיה סינתטית מלמטה למעלה מציגה גישה חדשנית לבירור ולבנייה מחדש של מערכות ביוכימיות ו, באופן פוטנציאלי, אורגניזמים מינימאליים. תחום מתפתח זה עוסק מהנדסים, כימאים, ביולוגים, פיסיקאים ולעצב ולהרכיב רכיבים ביולוגיים בסיסיים למערכות מורכבות, פועלות מלמטה למעלה. מערכות מלמטה למעלה כזה יכול להוביל להתפתחות של תאים מלאכותיים לבירורים ביולוגיים בסיסיים וטיפולים חדשניים ^1,2. שלפוחית ​​ענקית unilamellar (GUVs) יכולה לשמש כפלטפורמת מודל לביולוגיה סינתטית בשל המבנה שלהם כמו קרום תא וגודל. jetting microfluidic, או microjetting, הוא טכניקה המאפשרת לדור של GUVs עם גודל מבוקר, הרכב קרום, שילוב חלבון הטרנסממברני, ואנקפסולציה ^3. העיקרון הבסיסי של שיטה זו הוא השימוש בפולסים מרובים, בתדירות גבוהה נוזל שנוצרו על ידי מכשיר הזרקת דיו ומונע piezo כדי לעוות l מושעהbilayer ipid לבוס. התהליך דומה לפיצוץ בועות סבון מסרט סבון. על ידי שינוי בהרכב הפתרון נשפו, ההרכב של הפתרון המקיף, ו / או הרכיבים הנכלל בbilayer, חוקרים יכולים ליישם טכניקה זו כדי ליצור שלפוחית ​​מותאמת אישית. מאמר זה מתאר את ההליך כדי ליצור שלפוחית ​​פשוטה מbilayer ממשק אגל ידי microjetting.

Introduction

זה הפך להיות יותר ויותר ברור שביולוגיה של תא היא בעיה רב היקף שיש בו שילוב של ההבנה שלנו ממולקולות לתאים. כתוצאה מכך, לדעת בדיוק כיצד מולקולות לעבוד בנפרד אינו מספיק כדי להבין התנהגויות הסלולר מורכבות. זה נובע בחלקו על קיומה של התנהגות מתהווה של מערכות מרובות רכיבים, כפי שהודגם על ידי הכינון מחדש של אינטראקציה ברשת אקטין עם שלפוחית ​​bilayer השומנים ^4, הרכבה ציר mitotic בXenopus לחלץ ^5, ואת הדינמיקה המרחבית של מנגנונים חלוקת תא חיידק ^6. דרך אחת כדי להשלים את הגישה של הרדוקציוניסטית לנתח את התהליכים המולקולריים של מערכות חיות היא לקחת את הגישה ההפוכה של בנייה מחדש של התנהגויות הסלולר באמצעות מספר מינימלי של מרכיבים ביולוגיים. חלק קריטי של גישה זו כרוך אנקפסולציה אמינה של ביומולקולות בנפח מוגבל, תכונה מרכזית של תא.

e_content "> מספר אסטרטגיות קיימות לencapsulating ביומולקולות ללימוד מערכות biomimetic. הרלוונטי ביותר מבחינה הביולוגית המערכת היא קרומי bilayer שומנים, המחקים את האילוצים ביוכימי ופיזיים שהוטלו על ידי קרום הפלזמה של התא. היווצרות שלפוחיות ענקית unilamellar (GUVs) על ידי electroformation ^7, אחת הטכניקות הנפוצה ביותר לייצור בוס ^14, בדרך כלל יש תשואת אנקפסולציה עניים בשל חוסר התאימות שלה עם חיץ מלח גבוה ^8. Electroformation גם דורש כמויות מדגם גדולות (> 100 μl), שעלולה להיות בעיה לעבודה עם חלבונים מטוהרים , ולא יעיל משלב מולקולות גדולות בשל קושי של דיפוזיה בין שכבות שומנים צפופות. מספר גישות microfluidic ליצירת שלפוחית ​​שומנים פותחו. שיטות התחליב כפולות, שעוברים רכיבים באמצעות שני ממשקים בין שכבות מים שמן ומים (W / O / W), מסתמך על האידוי של volatile ממס לנהוג היווצרות bilayer שומנים ^9. אחרים השתמשו בקו ההרכבה microfluidic שמייצר זרם רציף של שלפוחית ​​השומנים bilayer ¹⁰ או בשני שלבים עצמאיים ^11. פיתחנו טכניקה חלופית המבוססת על מהירות החלת פולסים נוזל נגד bilayer ממשק אגל ¹² לייצר GUVs של גודל מבוקר, קומפוזיציה, ואנקפסולציה. הגישה שלנו, המכונה jetting microfluidic, מציעה את היתרונות בשילוב בין כמה טכניקות דור שלפוחית ​​קיימות, מתן גישה ליצירת מערכות biomolecular פונקציונליות לחקירת מגוון רחב של בעיות ביולוגיות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. ייצור אינפיניטי הקאמרי

1. לעצב את חדר האינסוף (על שם צורתו) באמצעות מחשב עיצוב בסיוע (CAD) תוכנה, ולשמור את הקובץ כך שהוא תואם עם חותך לייזר. כדי ליצור את הצורה הזו, שני מעגלים נפרדים של קוטר 0.183 במרחק של 0.15 פנימה מרכז למרכז חותכים את התא מ1/8- 3/16 באקריליק ברור עם חותך הלייזר. צורת האינסוף מאפשרת היווצרות טיפת ממשק bilayer ויציבות.
2. מקדחה 1/16 בחור בקצה של חדר אקריליק גם בצורת אינסוף. חזור על פעולה בצד השני. לחתוך מלבן קטן מגיליון 0.2 מ"מ אקריליק עם מספריים או חותך לייזר לשמש כתחתית לבארות.
3. למרוח שכבה דקה אך מלאה של דבק מהיר ייבוש לצד אחד של אקריליק 0.2 מ"מ ולהדביק אותו לחלק התחתון של החדר. החזק אקריליק 0.2 מ"מ בחוזקה במקום נגד התחתון של החדר ולוותרהדבק בממשק כדי לאפשר את הדבק ליצור חותם, אך להימנע מכסה את אזור התצוגה. הקפד ליישר אקריליק, כך שהקצה שלה הוא מיושר עם הקצה של קיר החדר והוא מכסה את נתק קאמרי אינסוף לחלוטין. זה יאפשר לחדירת מטוס מספיקה ולמנוע דליפה של הבאר.
4. חותך שתי חתיכות קטנות של גומי טבעי כדי לכסות את החורים שנקדחו. החל דבק מהיר ייבוש סביב החור. הנח את הגומי מעל החור והעיתונות בכל התחומים עם זוג מלקחיים כדי לאבטח. חזור על פעולה עבור שני חורים שנקדחו. הקפד שכל חיבורים מודבקים הם חותמות מלאים כדי למנוע כל דליפה.
5. באמצעות G 23, 1 במחט, לתקוע חור בגומי הטבעי בשני הצדדים של החדר כדי להקל על כניסה של קצה דיו פיזואלקטריים.

2. ניסיוני הכנה

פתרון שומנים מניית חנות בכלורופורם ב-20 ° C במקפיא. במחקר זה, או 1,2-diphytanoי.ל.-SN-glycero-3-phosphocholine (DPhPC) או 1,2-dioleoyl-SN-glycero-3-phosphocholine (dOPC) היה בשימוש. 2 מיליליטר של 25 מ"ג פתרון שומנים מיליליטר / מוכן בדרך כלל בפרוטוקול זה ויימשך במשך חודשים כאשר מאוחסן ב -20 ° C.

1. כדי resuspend השומנים בn-decane, להעביר ראשון אותו מבקבוקון המניה לצנצנת זכוכית קטנה, ועדינות יבשה תחת ארגון או חנקן. להחזיק את הצנצנת בזווית תוך ייבוש לחשוף יותר שטח פנים לגז, המאפשר לשומנים בדם לייבוש מהירים יותר.
2. עם הכובע של הצנצנת הדפוקה רק מעט על, לאפשר הפתרון המיובש לשבת תחת ואקום בתא ייבוש ל1-2 שעות. לאחר מכן להוסיף n-decane לresolubilize השומנים ב25 מ"ג / מיליליטר. ורטקס בקצרה פתרון השומנים בדם וsonicate זה בsonicator אמבטיה במשך 15 דקות. אחסן את השומנים מחדש בn-decane ב -20 ° C.
3. הכן פתרון סוכרוז המניות. בצינור microcentrifuge 1.5-מיליליטר, להוסיף 900 ​​μl של 300 סוכרוז מ"מ ו100 μlשל methylcellulose 1% (MC). Methylcellulose מתווסף להגדלת צמיגות של הפתרון, אשר מסייע בjetting. שלב אופציונאלי: הוסף 1 μl אופציונלי של צבע אוכל בצבע כהה או חרוזי ניאון להלוות יותר ניגוד או הקרינה בתחום הדמיה, בהתאמה. פתרון זה הוא פתרון 300 סוכרוז mOsm נועד להתאים osmolarity הסלולרי ולספק ניגוד במהלך microjetting.
4. צייר את הפתרון לתוך מזרק פלסטיק 1 מיליליטר חד פעמי. בעוד מחזיק את המזרק עם הקצה כלפי מעלה, קפיצי המוט שוב ​​ושוב לגרש את כל בועות לכיוון הקצה, ולדחוף את הבוכנה כדי להוציא את האוויר שנלכד. הקפד לפנות את כל האוויר מהמזרק לפני שימשיך, כפי שהוא יפריע להתכווצות פיזואלקטריים נכונה אחראית לjetting.
5. להתקין מסנן 0.22 מיקרומטר בסופו של המזרק. כדי למנוע מאוויר שנלכד במסנן, החזק את המזרק אנכי ולדחוף את הבוכנה עד טיפה נוצר מעל לקצה. הערה:יחידת מסנן מזרק בקוטר מ"מ 33 נמצאה עבודה הטובה ביותר, אבל מסננים חלופיים קטן כמו מסנן מזרק בקוטר 3 מ"מ יכולים לשמש כדי להפחית את הנפח מת.
6. פתח את הברגת מתאם Luer הנשי של הזרקת הדיו, ובאופן מאובטח לחץ אותו במקום מעל הסוף של המסנן. שוב, להוציא את הנוזלים כדי למנוע לכידת אוויר. בורג בחלק העליון של הזרקת הדיו. נוזל צריך לנסוע לקצה לאחר הזרקת הדיו הוא מחובר לגמרי.

3. מכין את הציוד

1. באמצעות v-מהדק, הר ההרכבה המזרק על הבמה מיקרוסקופ. צרף את החוט מהדיו אל הבקר הזרקת הדיו. הערה: שלב מותאם אישית נבנה עבור פרוטוקול זה, ואילו העיצוב במה יכול להיקבע על ידי המשתמש, זה הוא קריטי כדי לקבל שליטת XYZ עצמאית של המזרק ובקרת XY של בעל המדגם.
2. לקבוע את ההגדלה ושילוב עדשה דרושה כדי להשיג את ההדמיה הרצויה. כאן מטרת 10X ועינית 10X משמשים.
3. השתמש במצלמה במהירות גבוהה (≥ 1,000 תמונות בשנייה) כדי להמחיש את jetting ודור שלפוחית. לפני ההדמיה, לבצע כיול מצלמה הכרחי. לנצל מבוסס תמונה אוטומטית הדק בתוך תוכנת המצלמה ליזום לכידת תמונה.
4. הר קאמרי אינסוף לבמה מיקרוסקופ. אבטח את התא על ידי הדבקתו למקומו על הבמה.
5. בזהירות ליישר את קצה הזרקת הדיו עם החור המנוקב בגומי הטבעי (ראה איור 1b). כדי לעשות זאת, להביא את דיו הקרוב לחדר ולהתאים את המיקום לפי העין, ולאחר מכן לבצע התאמות מדויקות יותר דרך עדשת המיקרוסקופ. להמשיך בזהירות, כתנועות גסות עלולות לגרום נזק לקצה הזרקת הדיו.
6. ברגע שהדיו מיושר, לגבות את מכלול המזרק מהחדר על מנת למנוע כל נזק להזרקת דיו במהלך הטעינה של הבארות. הקפד שתנועה של הזרקת הדיו היא חד כיווני, כך שהוא נשאר בקו אחד עם החור בקרום.
7. לחץ בעדינות על plunגר של ההרכבה המזרק עד לקבלת טיפה קטנה בנחיר הזרקת הדיו. זה יספק כמה backpressure ראשוני.
8. קלט הפרמטרים jetting. לגל דו קוטבי טרפז, השתמש בפרמטרים הבאים: תדירות 20 קילוהרץ דופק, 3 זמן μsec עלייה, 35 משך μsec דופק, 3 זמן μsec סתיו, 65 V מתח להחיל (משרעת דופק), ו100 פולסים סילון להדק (מספר דופק) . עם זאת, המתח להחיל (משרעת דופק) ומספר דופק (פולסים סילון להדק) יכולים להיות מגוון כדי לשלוט בגודל שלפוחית.

4. שלפוחית ​​דור

1. הוספת 25-30 פתרון השומנים μl המושעה בn-decane לתא האינסוף, המכסה את פני השטח המלא של שני הבארות.
2. הוסף 25 גלוקוז μl (של אותו osmolarity כפתרון סוכרוז) עד לקצה החיצוני של אחד טוב, pipetting באיטיות ובצורה חלקה. על התצהיר, ירידה של גלוקוז צריכה טופס, כי רמת הסוכר ושומנים בדם פתרון לא מתערבבות. הוסף 25 אחר1; ליטר של גלוקוז ולהפך, מה שיגרום עוד טיפה ויוצר את קרום bilayer שומנים באמצע החדר בתוך 5-10 דקות.
3. הכנס את דיו דרך הגומי הטבעי, ולהדריך אותו בזהירות לכיוון bilayer ממשק טיפה. גישת bilayer לאט, כמו הזרקת הדיו הציג את מקומו של נפח ויכול להיקרע bilayer.
4. כאשר דיו הוא בתוך ~ 200 מיקרומטר, להחיל jetting עם ההגדרות מתוארות בשלב 3.8. המרחק מ bilayer עשוי להשתנות בעיקר בהתאם למספר המתח ודופק, בין פרמטרים נוספים. פרוטוקול זה ממליץ להגדיל לאט הגדרות (מתח ומספר דופק) והתבוננות עיוות bilayer.

5. ניקוי הציוד

1. לנתק את ההרכבה המזרק מבמת מיקרוסקופ, ולהשליך את מזרק פלסטיק 1 מיליליטר ומסנן.
2. כדי לנקות את הזרקת הדיו, לשאוב את הפתרונות הבאים לפי סדר על ידי טבילת הקצה בsolution 7-10x כל: אתנול 70%, 2% פתרון Neutrad במים חמים, 70% אתנול, וDDH ₂ O. אם דיו אינו מתאים באופן מאובטח על פיפטה השאיפה, לחתוך קצה פיפטה כדי ליצור מתאם.
3. ייבש את החדר עם רקמה. מניחים את חדר האינסוף בכוס 250 מיליליטר עם 2% Neutrad V / V במים חמים, וsonicate ל5-10 דק '. לאחר sonication, להתייבש היטב הבארות תחת אוויר דחוס. כל לחות בבארות יכולה לסכן את היציבות של קרום bilayer השומנים בדם, ולכן מומלצת גם כי התאים ממוקמים בתנור ב 60 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

יש לנו התאספנו התקנת jetting microfluidic על מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך קונבנציונלי עם במה מותאמת אישית מורכבת מחלקים במכונה ומיקרומטרים ידניים (איור 1). אפיון של דיו מספק תובנה על תהליך יצירת שלפוחית. משתנה המרחק בין נחיר דיו וbilayer שומנים משפיע על הכוח ליישם כדי לגרו...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

טכניקות רבות פותחו עבור דור שלפוחית, כולל electroformation, תחליב, ודור אגל ^14-16. עם זאת, ניסיוני בטכניקות חדשות נחוצות כדי לאפשר את העיצוב של מערכות ביולוגיות עם דמיון הולך וגדל למערכות חיות. שיטות microfluidic בפרט הציעו רמה מוגברת של שליטת שלטון unilamellarity קרום, monodispersity של גודל...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Piezoelectric Inkjet	MicroFab Technologies	MJ-AL-01-xxx	xxx denotes orifice diameter in microns
Jet Drive III Controller	MicroFab Technologies	CT-M3-02
High-speed camera	Vision Research	MiroEX2
DPhPC lipid in chloroform	Avanti	850356C	Ordered in small aliquots in vials
33 mm PVDF filters, 0.2 µm	Fisher Scientific	SLGV033RS
1 ml Syringes	Fisher Scientific	14823434
n-Decane	Acros Organics	111871000
Glucose	Acros Organics	410950010
Sucrose	Sigma-Aldrich	S7903-1KG
Methylcellulose	Fisher Scientific	NC9084958
1/8 in Acrylic	McMaster Carr	8560K239	CAD designs for the infinity-shaped chamber are available upon request
0.2 mm Acrylic	Astra Products	Clarex clear 001
Acrylic Cement	TAP Plastics	10693
Loctite 495 Superglue	Fisher Scientific	NC9011323
Loctite 3494 UV Strengthening Adhesive	Strobels Supply	30765
Natural rubber	McMaster Carr	85995K14
Custom stage	homemade	N/A	CAD designs are available upon request