במבחני צבירת מבחנה באמצעות חלבון Hyperphosphorylated טאו

Summary

חלבוני טאו ללא שינוי וhyperphosphorylated שמשו בשני מבחני צבירה במבחנה כדי לחשוף את קינטיקה הצבירה מהירה hyperphosphorylation תלוי. מבחני אלה יסללו את הדרך למסכים בעתיד לתרכובות שיכולות להשפיע על הנטייה של טאו hyperphosphorylated כדי ליצור סיבים העומדים בבסיס ההתקדמות של מחלת אלצהיימר.

Abstract

Alzheimer's disease is one of a large group of neurodegenerative disorders known as tauopathies that are manifested by the neuronal deposits of hyperphosphorylated tau protein in the form of neurofibrillary tangles (NFTs). The density of NFT correlates well with cognitive impairment and other neurodegenerative symptoms, thus prompting the endeavor of developing tau aggregation-based therapeutics. Thus far, however, tau aggregation assays use recombinant or synthetic tau that is devoid of the pathology-related phosphorylation marks. Here we describe two assays using recombinant, hyperphosphorylated tau as the subject. These assays can be scaled up for high-throughput screens for compounds that can modulate the kinetics or stability of hyperphosphorylated tau aggregates. Novel therapeutics for Alzheimer's disease and other tauopathies can potentially be discovered using hyperphosphorylated tau isoforms.

Introduction

מחלת אלצהיימר (AD) היא אחד מאוסף גדול של הפרעות ניווניות הידועות כtauopathies. Tauopathy פתולוגיה שבבסיס המובהק הוא סבכי neurofibrillary, NFTS, בתאי עצב, האסטרוציטים ומיקרוגליה ^1-4. צפיפות NFT האזור בקורלציה עם ליקוי קוגנטיבי ^3.5 ונוירון הפסד ^6. NFT האזור מכיל חלבון בעיקר hyperphosphorylated טאו (המכונה "p-טאו" מעתה ואילך) שיוצר חוטים ישרים או לזווג סליל (PHF) ^7,8. טאו הוא חלבון הקשורים microtubule חשב כדי להקל על תחבורת axonal שהיא חיוני לאיתות וסחר ^9,10 עצביות. כל מולקולת טאו מכילה 2 עד 3 פוספטים במוח נורמלי, אבל עליות תוכן phosphoryl על ידי כמה קפלים בחולי tauopathy ^11. קינאז מרובים עשוי לתרום לhyperphosphorylation טאו כולל GSK3β (3β kinase synthase גליקוגן) וCDK5 (cyclin-dekinase התליון 5) ^12,13, אבל ההדק הישיר לזירחון פתולוגי נשאר ¹⁴ חמקמקים. זירחון החריג בתוך או ליד המוטיבים מחייב microtubule dissociates טאו מmicrotubule ^15, וגורם לטאו אי-לוקליזציה לתא somatodendritic, שבו p-טאו oligomerizes לחוטי סליל ישרים או לזווג שיכול בסופו פלמר לתכלילים NFT אזור. הקשר ההדוק בין hyperphosphorylation טאו, היווצרות NFT אזור, וניוון של מערכת עצבים הוביל להשערה הרווחת כי סבכי p-טאו לעורר תגובה ציטוטוקסיות אפופטוטיים ואחרת, ובכך הוא הגורם הבסיסי לניוון של מערכת עצבי tauopathy ^16,17. מסכי סמים ובדיקות קליניות מוקדמות המבוססים על הנחה זו כבר הושקו ^18. עם זאת, השערה זו עומדת בפני אתגרים ^19,20. לדוגמא, Santacruz et al. הראה כי תפקודים קוגניטיביים של עכברים הטרנסגניים ניתן לשפר על ידי דיכוי הביטוי של מוטציהטאו האנושי, למרות שNFTS המשיך ליצור ממולקולות טאו קיימות ^21. במודל דרוזופילה, NFT אזור הוצגו לעקל טאו cytosolic הרעיל כדי להגן על תאי עצב שבבסיס ^22,23. ברור, את התפקיד בפתוגנזה של NFT אזור, אם בכלל, ישפיע באופן משמעותי את הכיוון של פיתוח תרופות tauopathy.

בריכוזים גבוהים, חלבון tau המוח רקומביננטי או נורמלי באופן ספונטני אבל לאט לאט polymerizes למבנה כמו PHF-במבחנה, כפי שצוין על ידי הקשירה של כמה צבעי β גיליון העדיפו ניאון, במיקרוסקופ אלקטרונים, וספקטרוסקופיה פיזור אור ^24-27. הפרין הוספה או חומצה הארכידונית, חומצת שומן בשפע במוח אנושי, באופן דרסטי מאיצה היווצרות PHF בisoform- טאו ונימוסי ריכוז תלוי inducer ^28-32. מעניין לציין, שטאו hyperphosphorylated מטוהר ממוח לספירה או שהוכן על ידי ממצה בתגובות זירחון מבחנהggregates מהיר ויעיל יותר ^26,33-35. תוצאות אלו הן בהסכם מצוין עם התפקידים פתולוגית של p-טאו. מערכת במבחנה המבוססת על הצבירה של p-טאו ניתן אפוא לשמש ככלי רב עוצמה להקרנת סמים לספירה.

לאור קשר ההדוק בין צבירת טאו והניוון של מערכת העצבים ההדרגתית של הספירה, כמו גם הכישלון האחרון בפיתוח תרופות מיקוד פלאק Aβ, עוד סמן היסטולוגית מפתח של הספירה ^36-38, העניין בגילוי תרופות השולטות צבירת טאו עולה. ואכן, כמה קבוצות כבר החלו מסכי סמים בתפוקה שונה, תוך שימוש בתגובות צבירת טאו מבחנה, כמו assay העיקרי. מספר הכימיקלים נמצא להציג פעילויות מעכבות או היפוך על הצטברות טאו במבחנה ^39-42. עם זאת, כל מסכים רגולטור צבירת טאו טאו הנוכחי להשתמש ללא שינוי שמחטיא את מטרת פתולוגי המפתח של זרחןylation, העלאת דאגה לייחודו ויעילותו של שימוש בתרכובות אלו בטיפול לספירה.

אחד המכשולים העיקריים של פיתוח מבחני קיבוץ לאפיון ביוכימי והקרנת הסמים AD הוא הייצור של כמויות מספיקות של חלבון טאו hyperphosphorylated הרלוונטי pathophysiologically. שימוש במערכת קטליזה-Assisted הרוכסנים שבי איזופורם 1N4R של טאו וkinase GSK-3β הם שיתוף לידי ביטוי בE. coli כחלבוני היתוך רוכסן לאוצין, יש לנו להתגבר על האתגר הזה (. סוי et al, הוגש; ראה איור 1 עבור המוצרים הסופיים של טאו וp-טאו; ראה גם ⁴³ לאפיון ספקטרומטריית מסה ראשוני של p-טאו). מהרכב של תשעה נוגדנים ספציפיים לאתרי זירחון שונים של טאו, אותות חיוביים נראו בשמונה עמדות (מידע לא מוצג). בהמשך, אנו מתארים פרוטוקולים וinstrumentations שיכול להבדיל ד הקינטית הצבירהifferences בין טאו ללא שינוי ומיני p-טאו. מבחני אלה שונה מפרוטוקולים שפורסמו שנמדדו העלייה של הקרינה של thioflavin T (THT) או thioflavin S (THS) על עמילואיד (מצרפי טאו) מחייב ^26. ב" המסוף "הראשון, גישה לא-צבע, תגובות צבירה הם התאספו וטופחו בהעדר צבע עמילואיד. בנקודות זמן שונות, aliquot של כל תגובה מוסרת ומעורבב עם נפח שווה של חיץ tht המכיל לעצור צבירה ולאפשר tht להיקשר אגרגטים טאו. הקרינה נמדדת על ידי fluorometer IAP FluoroMax-2. במקרה השני "עם צבעים" assay מעקב הרציף, THT או THS כלול בתגובות הצבירה. הקרינה ניתן למדוד באופן רציף לאורך כל הניסוי באופן ידני או באמצעות קורא רב-צלחת. בנוסף, אנו מתארים assay המשתמש בריכוז ליד-פיסיולוגי של טאו וp-טאו לקיבוץ במו המדידה המתמשךדה. ההשפעה של זירחון נשארה לזיהוי בקלות. להלן, נתאר נהלי פעולת צעד-אחר-צעד, ולהראות תוצאות נציג של מבחני אלה. דיון בכמה מהיתרונות והחסרונות של כל גישה, כמו גם יישומי הקרנת סמים פוטנציאליים יבוא בעקבותיו.

בריכוז גבוה, טאו אגרגטים למבנים דמויים-עמילואיד באופן ספונטני. עם זאת, במעבדה, fibrillization טאו מואץ בדרך כלל על ידי מעוררים כגון הפרין (משקל מולקולרי ממוצע, 6,000 g / mol) וחומצה הארכידונית. דוגמאות שמוצגים במסמך זה כוללים 30 מיקרומטר הפרין. ההיווצרות של אגרגטים עמילואיד טאו מנוטרת על ידי הקרינה הנובעת מעמילואיד הכריכה בthioflavin T (THT) או thioflavin S (THS). על כריכה למצרפי טאו, THT מציג משמרת אדומה בקרינה (עירור: 450 nm; פליטת שיא: 485 ננומטר). THS, לעומת זאת, יש פליטה חלשה ב 510 ננומטר (עירור ב 450 ננומטר) לפני עמילואיד מחייב, אבל fluorescenc זהעליות דואר באופן משמעותי בנוכחות של חלבון עמילואיד כגון טאו מצטבר ^44. שני הצבעים לעבוד גם באיתור צבירת טאו וp-טאו. בגלל שיא הפליטה החזק ורחב יחסית של tht (ראה איור 2), יש הפחתת% רק 30 ביחידת הקרינה ב 510 ננומטר. לנוחיותכם, אנו משתמשים באותו שילוב של אורכי גל עירור / פליטה (כלומר, 450 nm / 510 ננומטר) כדי לפקח על צבירת טאו בעת שימוש או צבע.

צבירת טאו ניתן לעשות זאת בנוכחות או עדר של הצבע, בהתאם למטרה של assay ואת הזמינות של חלבון טאו. שני המצבים של תגובות מוצגים להלן. בנוסף, אנו מדגימים את פעולתם של שני מכשירים שונים - fluorometer יחיד מדגם (ISA-SPEX FluoroMax-2) וקורא רב-צלחת (SpectraMax M2). קוראים צריכים להיות מסוגלים להתאים את הפרוטוקולים הללו כדי להתאים לצרכימים הספציפיים שלהם וזמינות מכשיר.

Protocol

1. הכנת ריאגנטים

1. הכן חיץ צבירה (20 מ"מ טריס, pH 7.4, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA). אחסן בRT, יציב במשך חודשים. להשלים dithiothreitol 1 מ"מ (DTT) לפני השימוש.
   הערה: חיץ מבוסס HEPES (10 מ"מ HEPES, pH 7.5, 0.1 מ"מ EDTA, 5 מ"מ DTT) גם מייצר תוצאות דומות בצבירת טאו.
2. הכן thioflavin T או thioflavin פתרון S המניה (3 מ"מ, מומס חיץ צבירה), ולסנן לפי 0.22 מיקרומטר יחידת סינון סטרילי. חנות ב -20 ° C בצינור מכוסה על ידי רדיד אלומיניום, יציב במשך חודשים.
3. הכן פתרון מניות הפרין (300 מיקרומטר, מומס חיץ צבירה). חנות ב -20 ° C, יציבה במשך חודשים.
4. הכן dithiothreitol מניות (DTT) (1 M, מומסים במים). Aliquot לתוך צינורות 1.5 מיליליטר. חנות ב -20 מעלות צלזיוס. לפני מבחני צבירה, להפשיר את הפתרון 1 M ב RT. מהמניות 1,000x זה, להכין aliquot של 100 מ"מ עובדים המניה עם מים ללא יונים. השאר על קרחעד מוכן.
5. הסר טאו ממקפיא -80 מעלות צלזיוס. להפשיר על קרח. התאם טאו לריכוז שנקבע מראש עם חיץ הצבירה. ספין בmicrocentrifuge ב20,800 XG במשך 10 דקות ב 4 ° C כדי להסיר אגרגטים גדולים מראש יצרו. צעד מראש ספינינג זה מגדיל עקביות במדידת הקרינה שלאחר מכן של כל מנה של הכנת החלבון. מעביר את supernatant לצינור אחר; להשאיר על קרח עד מוכן להרכיב את תגובת הצבירה.

2. אין-צבע, Assay Terminal

הערה: תגובת הצבירה של assay זה נעשה בהעדר הצבע פלואורסצנטי. לאחר ערבוב כל הרכיבים, התגובה מותר להמשיך לנקודות זמן שנקבע מראש. אז Aliquots לקוחים מתוך תגובת הצבירה ומעורבבת עם tht או THS לעמילואיד מחייב לפני קריאת הקרינה. הנפח הראשוני של תגובת הצבירה תלויה במספר נקודות זמן הדרוש. גישה זו עשויה requזעם כמות גדולה של חלבון טאו, אבל הוא מהיר, פשוט, וניתן לעשות זאת בfluorometer או קורא צלחת רב היטב (ראה דיון). להלן פעולת צעד-אחר-צעד, באמצעות spectrofluorometer הקומפקטי ISA SPEX FluoroMax-2 לכימות הקרינה.

1. הגדר את תערובת הקיבוץ בצינורות 1.5 מיליליטר Eppendorf כמו בטבלה 1. כל עמודה מייצגת את המרכיבים דרושים לתגובת 100 μl, וזה מספיק למדידת נקודת זמן אחת. להתאים את הכמות לתערובת הצבירה כולו מבוססת על נקודות הזמן דרושות לניסוי המסוים. להוסיף 10% נוספים מכל רכיב לתת מקום לpipetting שגיאה. ניתן להחליף הפרין התגובה מכילה הטיפוסי מוצג כאן על ידי חומצה הארכידונית או חיץ צבירה. להוסיף DTT עד 1 מ"מ לתערובת התגובה. אם כל התגובה נמשכת יותר מיום אחד, להשלים יומיומי DTT טרי (1 מ"מ) כדי להבטיח סביבת הפחתה.
2. להפוך את הצינור כמה פעמים כדי לערבב. Plaהספירה כל תגובה באמבט חממה או מים 37 מעלות צלזיוס. תסיסה אינה נחוצה לצבירת טאו.
3. לפני מדידת הקרינה, להדליק את spectrofluorometer (המנורה ראשונה, ולאחר מכן מחשב).
   הערה: מנורת קשת קסנון, שניתן להשתמש מייד. עם זאת, התוצאות הטובות ביותר עבור לאפשר להתקן להתחמם במשך כ -10 דקות לפני קריאת הקרינה.
4. הפעל את התוכנה במחשב.
   1. בחר במצב בזמן אמת תצוגה במכשיר Control Center, גל עירור מוגדר 450 ננומטר (חריץ 2 ננומטר) ואורך גל פליטה 510 ננומטר (חריץ 5 ננומטר). מצב חלון תצוגה לסגור בזמן אמת כדי לחזור למרכז בקרת Instrument.
   2. בחר מפתח אורך גל ניתוח, הוספת עיתונות >> קבוע במסגרת העליונה להוסיף סטי אורכי גל. פרמטרים שנקבעו רכישת שגיאת תקן 1 וניסויים מרביים עד 3, ולאחר מכן לחץ על הוסף. לחץ על Go! כדי לפתוח את תצוגת נתוניםחלון.
   3. בחלון תצוגת נתונים, לחץ על התחל ACQ כדי לפתוח את תיבת הדו-שיח מדגם החדשה. בחר "לא ידוע" לסוג מדגם.
5. לכל תערובת צבירה 100 μl, להוסיף 98 μl חיץ צבירה ו -2 μl 3 מ"מ thioflavin מספר פעמים ט Pipet לערבב.
6. העבר את התערובת כולה לקובט (FCA3, ממד חיצוני, wxlxh = 12.5 מ"מ x 12.5 מ"מ x 45 מ"מ). מניחים את קובט בבעל המדגם במדגם-התא ולסגור את המכסה. לחץ על הפעל כדי לאסוף את נתוני הקרינה. רשום את הנתונים.
7. הסר את קובט ולמזוג את הפתרון. יש לשטוף את קובט על ידי מים מזוקקים 3 פעמים. יבש על ידי נשיפת אוויר ובמחוץ לקובט.

3. עם צבעים, מתמשך המצב Assay על קורא צלחת SpectraMax M2

הערה: assay זו שונה מהקודמת שבצבע הניאון tht או THS כלול בaggregaתגובת tion. זה מאפשר מדידה רציפה של אותה הקבוצה של תגובות. בשל השימוש החוזר ונשנה של התגובה, שיטה זו טובה יותר לעשות עם קורא צלחת רב גם אוטומטי (כפי שמוצגת להלן הניתוח של SpectraMax M2). Fluorometer רגיל גם עובד, אבל תדירות מדידה של תגובות צבירה מהירות היא מוגבלת למדי, בשל האופי הידני של הפעולה.

1. להגדיר את תמהיל הצבירה בצלחת 96-היטב (96-גם צלחת מוצקה שחורה, גם בנפח 360 μl, תחתית שטוחה) כמו בטבלה 2. כל עמודה מייצגת את המרכיבים דרושים לתגובת 200 μl, וזה מספיק לאחד מדידת נקודת הזמן. מערבבים היטב על ידי pipetting מספר פעמים. להשלים טרי 1 המ"מ DTT בכל יום במהלך כל ניסויים.
2. דגירה את צלחת 96-גם על 37 מעלות צלזיוס.
3. בכל נקודת זמן לפני מדידת הקרינה, להפעיל את קורא microplate מצב מרובה ומחשב. לאפשר מספיק זמן לmachine לייצב, כ -10 דקות.
4. הפעל את התוכנה במחשב. להגדיר טמפרטורה ל 37 מעלות צלזיוס ולבחור עוצמת הקרינה מצב (FI-Top קרא), גל עירור להגדיר באורך גל ופליטה 450 ב 510 ננומטר.
5. הכנס את צלחת 96-היטב למגירה ולחץ על מקש READ להתחיל מדידה.
6. לאחר הקריאה, להסיר את הצלחת ולהחזיר אותו בחזרה לחממה 37 ° C. להעתיק את הנתונים ולהדביק לתוך גיליון אלקטרוני Excel לניתוח נתונים ומזימות.

4. עם צבעים, המתמשך המצב Assay על Spectrofluorometer קומפקטי

1. הגדר את תערובת הקיבוץ בצינורות 1.5 מיליליטר Eppendorf כבטבלה 3. כל עמודה מייצגת את המרכיבים דרושים לתגובת 200 μl, וזה מספיק למדידת נקודת זמן אחת.
2. להפוך את הצינור כמה פעמים כדי לערבב.
3. הפעל את spectrofluorometer ולהגדיר את התוכנה כבצעדים 2.3 ו -2.4.
4. להעביר את כל התערובת tקובט OA. מניחים את קובט בבעל המדגם במדגם-התא ולסגור את המכסה. לחץ על הפעל כדי לאסוף את נתוני הקרינה. רשום את הנתונים.
5. המשך קריאה במרווחי זמן המתאים על-ידי לחיצה על הפעלה והקלטת נתונים. אם הצבירה היא להיות במעקב בתדירות גבוהה (לדוגמא, בכל שנייה 30 או 60), השאר את התגובה בקובט ובמכונה עד או המדידה סיימה, או כאשר יש מספיק זמן כדי להחליף תגובות או cuvettes.
6. הסר את קובט ולמזוג את הפתרון. יש לשטוף את קובט על ידי מים מזוקקים 3 פעמים. יבש על ידי נשיפת אוויר ובמחוץ לקובט.

תוצאות

באמצעות טאו רקומביננטי וp-טאו (איור 1), שהקמנו שני פרוטוקולים שונים כדי להשוות קינטיקה של צבירה של טאו וp-טאו, מנצל את פליטת הקרינה החזקה של tht וTHS על מחייב לamyloidal אגרגטים חלבון, טאו כולל וp-טאו (איור 2). עם או בלי צבע הניאון בתגובת הצבירה, אנו נצפו שיפור של ...

Discussion

פרוטוקול זה מדגים תנאי assay שונים ומכשירים המזהים קינטיקה צבירת טאו המהיר זירחון תלוי. בassay המסוף, צבע הקרינה tht מתווסף לחלק מהתגובה הוסרה מתערובת האמן בכל נקודת זמן. עמילואיד-induced כריכת הקרינה נמדדה ²⁶ אז. במקרה השני, עם צבעי מצב, צבירת טאו מתבצעת בנוכחות tht או THS, טי...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Trizma base	Sigma	T1503
NaCl	Macron Fine Chemicals	MAL-7581-06
Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA)	Invitrogen	15576-028
Thioflavin T	Sigma	T3516	Stored in dark
Thioflavin S	Sigma	T1892	Stored in dark
heparin	Sigma	H3393
DL-Dithiothreitol (DTT)	Sigma	D9779	Stored at 4 °C
96-well plate	Corning	3917
ISA SPEX FluoroMax-2	Horiba
SpectraMax M2 Multi-Mode Microlate Reader	Molecular Devices
Mouse Anti-Tau Monoclonal Antibody	R&D Systems	MAB3494	Stored at –80 °C