הזרקת Transthoracic Intramyocardial אולטרסאונד מונחה בעכברים

Summary

הזרקת intramyocardial מלעורית מונחה אקו מייצגת שיטה יעילה, אמינה, וניתן למקד עבור המשלוח של סוכני העברת גנים או תאים לתוך הלב העכברי. בעקבות הצעדים המפורטים בפרוטוקול זה, המפעיל יכול להיות מוכשר במהירות בטכניקה תכליתית, פולשנית זו.

Abstract

מודלים עכבריים למחלת לב וכלי דם הם חשובים לחקר מנגנוני pathophysiological ולחקור טיפולי התחדשות פוטנציאליים. ניסויים הכוללים הזרקה בשריר הלב מבוצעים כיום על ידי גישה כירורגית ישירה באמצעות פתיחת בית החזה. בעוד נוח כאשר היא מבוצעת בזמן אחר מניפולציה ניסויית כגון קשירת עורקים כלילית, את הצורך בפרוצדורה פולשנית למסירת intramyocardial מגביל עיצובים ניסיוניים פוטנציאל. עם אי פעם שיפור הרזולוציה אולטרסאונד ושיטות הדמיה לא פולשנית מתקדמות, עכשיו זה אפשרי לביצוע, הזרקת intramyocardial מלעורית מונחה אולטרסאונד באופן שיגרתי. טיפול זה יעיל ומהימן מספק סוכנים לאזור מיקוד של שריר לב. יתרונות של שיטה זו כוללים הימנעות מתחלואה ניתוחית, מתקן למקד אזורים של שריר לב באופן סלקטיבי בהנחיית אולטרסאונד, ואת ההזדמנות כדי לספק injectate לmyocardiuמ 'במרווחי זמן מרובים, שנקבע מראש זמן. בעזרת טכניקה התאמנה, סיבוכים מהזרקת intramyocardial הם נדירים, ועכברים לחזור במהירות לפעילות רגילה בהתאוששות מהרדמה. בעקבות הצעדים המפורטים בפרוטוקול זה, המפעיל עם ניסיון אקו בסיסי יכול להיות מוכשר במהירות בטכניקה תכליתית, פולשנית זו.

Introduction

מחלות לב היא סיבת מוות המובילה לגברים ולנשים בארצות הברית, והיוו 600,000 מקרי מוות בשנה ^1. מודלים עכבריים למחלת לב וכלי דם הם חשובים ביותר לחקר מנגנוני pathophysiological ולחקר טיפולים פוטנציאליים. משלוח בשריר הלב של וקטורי ריפוי גנטיים, תאי גזע, RNAs שונה, וחקירת היתרי סוכנים טיפוליים אחרת של הפוטנציאל הטיפולי שלהם למחלות לב ^2-7. נכון לעכשיו, יש אפשרויות מוגבלות למסירה בשריר הלב של סוכנים טיפוליים בעכברי מודל ^6. הזרקת Intramyocardial תחת הדמיה ישירה היא נפוצה, אבל דורשת sternotomy או פתיחת בית החזה, והוא מוגבל לאזור החשוף של הלב. בעוד נוח כאשר היא מבוצעת בזמן אחר מניפולציה ניסויית כגון קשירת LAD, את הצורך בפרוצדורה פולשנית למסירת intramyocardial מגביל עיצובים ניסיוניים פוטנציאל ומציגהשפעות dditional מההליך (למשל, סיסטיק בשל פתיחת בית החזה). משלוח קרום הלב מלעורית של וקטורים ויראליים דווח, אבל באתר וההפצה של סוכן טיפולי אינו הומוגנית וקשה לשליטה ^8. תוצאות הזרקה כלילית מלעורית בהפצה הומוגני יותר של חומר מוזרק, אבל מסירה כלילית יעילה ושחזור מאתגרות במודלים עכבריים.

כאן, אנו מתארים טכניקה סגורה חזה intramyocardial הזרקה המאפשרת מיקוד פולשנית, מפעיל המבוקר של סוכנים טיפוליים בהנחיית אולטרסאונד. הטכניקה קלה ללימוד, חוסכת את הצורך בפתיחה בית החזה או sternotomy והסיבוכים הניסיוניים הדיילת שלהם, ומספקת גמישות רבה יותר בעיתוי ובאתרים של הזרקת intramyocardial. לפיכך, הזרקת intramyocardial בסיוע אקו מייצגת שיטה טכנית פשוטה ויעילה מאוד של מניפולציהשריר לב במודלים ניסיוניים עכבריים.

Protocol

כל השלבים המתוארים בוצעו תחת פרוטוקולים שאושרו על ידי ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים של בית החולים לילדים בבוסטון.

.1 הכנה

1. לבצע הערכה אנטומית ותפקודית של הלב בסיסית על ידי בדיקת אקו לפני תחילת פרוטוקול ההזרקה, כעמדה רגשי קבועים האופטימלית להזרקת intramyocardial לא עשויה להניב תצוגות סטנדרטי אופטימליות להתוויית האנטומיה והערכה של תפקוד.
2. התקנת ההזרקה מוצגת איורים 1A-1C. מניחים מזרק ריק עם מחט נדן, כלפי מעלה פוע אוריינטציה, במהדק המזרק (ראו איור 1 ג) ולאבטח את החללית מתמר אולטרסאונד במהדק סריקת הראש (ראה איור 1). שחרר את משותף נעילת מהדק כדור סריקת הראש (איור 1) ולתפעל את כיוון המתמר כך שיהיה מיושר מקביל לציר של המחט. תקן scan-עמדת ראש על ידי הידוק משותף נעילת מהדק כדור סריקת הראש.
   הערה: לקבלת זריקה בעכברים בוגרים, מחט G 30 עם אורך 1 סנטימטר ב/ 2.5 היא אופטימלית. מזרק 1 מ"ל יכול לשמש לנפחים גדולים יותר, ואילו מזרק gastight יכול לשמש לשליטה מדויקת יותר של כמויות קטנות יותר (5-10 μl).
3. החל ג'ל אולטרסאונד בנדיבות על קצה המתמר עם מרית כדי לכסות את הראש לאורך כולו. לשלוף בזהירות את המחט ולהשתמש במחט הר בקרות כדי לקדם את המחט ישירות תחת המתמר ובתוך ג'ל אולטרסאונד להדמיה. לבצע התאמות קטין באמצעות מחט הר שליטה, כך שהמחט דמיינה בבירור לאורכו על תמונת אולטרסאונד. אם המתמר היה מיושר במקביל כראוי למחט בשלב 1.4, אז המחט צריכה להישאר בתוך מטוס ההדמיה כפי שהוא מתקדם ונסוג עם ידית שליטת הזרקה (איור 1 ג).
4. בשלבים הבאים, לא להפריע את הצורךיישור אופקי le / מתמר על ידי הזזת או בציר האופקי. במקום זאת, להתמקד באזורים ספציפיים של הלב להזרקה על ידי שינוי המצב האנכי (ציר y) של מחט הר ועל ידי הזזת פלטפורמת בעלי החיים.
5. הזז את המתמר superiorly מהפלטפורמה של בעלי החיים באמצעות השליטה בגובה סריקה (איור 1), כדי לאפשר המיקום הבא של העכבר הרדים על גבי הפלטפורמה של בעלי החיים. זה לא ישבש את יישור ציר x של המתמר לציר של המחט הארוכה.
6. הסר את המזרק ששימש ליישור ממהדק המזרק וזורקים בזהירות. טען את המחט החדשה ומזרק עם injectate לגמר יעד הנפח, ומאפשר לשטח מת בקצה המזרק. להיות זהיר כדי להסיר בועות אוויר. הנח את המזרק לתוך מהדק המזרק ללא התאמת יישור ציר x שלה. באופן מלא לחזור בי המזרק באמצעות שליטת ההזרקה.
   הערה: למטרות הכשרה ראשוניות, השימוש בכחול של אווןצבע (1%), כתם Trypan הכחול (0.4%) או השעיה של microspheres ניאון כמו injectate יכול לסייע למפעיל במאשר מיומנות והצלחה של הזרקה ממוקדת.

.2 הזרקה

1. הפעל משולב חם יותר של פלטפורמת החימום ולהגדיר אותו ל37 C °. מניחים את פלטפורמת בעלי החיים 180 ° מכיוון ההדמיה הרגיל, עם מהדק צינור הרדמה והראש של החיה הקרובה ביותר למפעיל. הדבר זה מאפשר ללב (בצד השמאל של החזה) להיות ipsilateral למהדק המזרק והמחט. הערה: התאמות סיבוב נוספות בכיוון השעון קטין לפלטפורמת בעלי החיים עשויות להיות נחוצות כדי לכוון את הלב בצורה נכונה למטוס ליד עצם ציר קצר ההדמיה שישמש להזרקה (איור 2 א).
2. הכן עכברים לבדיקת אקו כפי שדווח בעבר ^9. להרדים את העכבר בתא אינדוקציה עם 2% isoflurane. הסרת שיער חזה עם שיער קרם להסרתd להחיל הסיכה ג'ל לשתי העיניים כדי למנוע התייבשות של לובן העין.
3. הרם את המתמר באמצעות השליטה בגובה ראש הסריקה (איור 1). הנח את פרקדן העכבר הרדים על גבי פלטפורמת החיה המחוממת עם החוטם בתוך חרטום אספקת 1-3 isoflurane% (2A-2B איורים). הכנס בעדינות בדיקה רקטלית והדבק את ארבע כפות הרגליים לאלקטרודות א.ק.ג., יישום ג'ל אלקטרודה למגע חשמלי.
   הערה: רמה מתאימה של הרדמה יש להבטיח ליחס האנושי של בעלי החיים. לא צריך להיות שום שינוי בקצב לב ולא תגובה למיקום של המחט דרך קיר החזה. יש להשתמש בבקרות ההומיאוסטטית המשולבת של פלטפורמת בעלי החיים טמפרטורה כדי לשמור על טמפרטורה נורמלית (37 ± 0.5 ° C), כהיפותרמיה תגרום ברדיקרדיה יחסית, הרחבה של חדר, ואי נוחות אפשרית.
4. ברגע שהעכבר הוא מאובטח על הפלטפורמה של בעלי החיים, להפחית את המתמר על depilaחזה טד באמצעות השליטה בגובה ראש הסריקה (איור 1). התקנת אולטרסאונד האופטימלית להזרקה היא ללב להיות דמיין בכיוון הציר הקצר ליד העצם, כמו לכל טכניקת אקו סטנדרטית. סובב את פלטפורמת בעלי החיים 20-30 ° בכיוון השעון כדי לקבל את חלון אקוסטי האופטימלי להזרקה במטוס ההדמיה ציר הקצר (איורים 2A-2B). הערה: לחלופין, הזרקה יכולה להתבצע מנטיית ציר ארוכה ליד עצם על ידי סיבוב נגד כיוון השעון של פלטפורמת בעלי החיים (איור 2 ג).
5. השתמש בפקדי התאמת פלטפורמה של בעלי החיים כדי להתאים את שדה הראייה ולמקד כל אתר הזרקה רצויה בשריר הלב של החדר השמאלי. לכוון את המצלמה חזרה-ושוב מהקודקוד לבסיס של לב כדי למקד את מיקום ההזרקה הרצויה בשריר הלב של החדר השמאלי (A3-C3 איורים). הערה: התצוגה ליד עצם midpapillary קצר הציר (איור 3 א) מציעה reproduciblציוני דרך דואר המאפשרים הדמיה מעקב של אתר ההזרקה. הערה: לחלופין, תצוגת הציר הארוכה ליד העצם יכולה לשמש יעד אתר הזרקה מוגדר מראש (איור 3D).
6. החל עם המזרק במהדק המזרק חזר באופן מלא, להתקדם לאט לאט את המזרק לכיוון החזה של בעל החיים על ידי הפיכת כיוון השעון שליטת הזרקה (איור 4 א). כדי לאפשר הדמיה אולטרסאונד ברורה של שני הלב וקצה המחט כפי שהוא מתקרב החזה, להשתמש בשפע של ג'ל אולטרסאונד על הצד השמאלי של החזה ולייעל את חלון אקוסטי על ידי הגדרת שדה ראיה רחב על פקדי אקו. הגדר את הנקודה / אזור מוקדי באתר היעד להזרקה. התאמות קלות למחט הר פקדים יכולים למטב את התמונה של המחט לאורכו.
   הערה: יש לו מכונות אולטרסאונד חלק תוכנת מדריך מחט פונקציה להאריך דיגיטלי קו לאורך הציר של המחט הארוכה דרך לשריר לב היעד(איור 4). כגון כלי תוכנה יכולים להיות מועילים אבל לא הכרחי.
7. עם בעלי החיים מסוממים כראוי (1-3% isoflurane מעורבבים עם 0.5-0.8 ליטר / דקה 100 חמצן%), לקדם את המחט דרך קיר החזה של העכבר ולתוך שריר הלב, התבוננות בזהירות את המיקום של קצה המחט המשופע בכל פעמים. לעצור קידום כאשר קצה המחט הוא בתוך שריר לב היעד (איור 4C). הקצה משופעים כולה צריך להיות מאובטח בתוך שריר הלב, כדי למנוע דליפת injectate אל תוך חלל קרום הלב.
8. כאשר הקצה הוא במיקום הרצוי, לספק injectate על ידי לחיצה על בוכנת המזרק. לספק injectate לאט, מעל 5-30 שניות (בהתאם לכמות שנמסר). עד 50 μl של injectate יכול להיות מועבר מבלי להתפשר על תפקוד חדר. הופעת echobright חולפת לאזור שריר הלב שהוחדר יכולה להיות ביטוי לאחר זריקה מוצלחת. תקופה קצרה (שניות) של bradycard היחסיIA יצוין מדי פעם עם זריקה לתוך שריר הלב ובמהירות פותר.
9. ברגע שinjectate כבר מנוהל, מייד למשוך את המחט על ידי סיבוב נגד כיוון השעון של כפתור בקרת הזרקה. העכבר צריך להיות כל הזמן תחת הרדמה במשך כמה דקות של התבוננות אקו כדי לאשר תפקוד חדר השתמר ואין סיבוכי postprocedural. אם צוין, אזורים מרובים של שריר לב יכולים להיות מוזרקים באופן סדרתי על ידי מיקום מחדש של הזווית של מחט גישה של על ידי התאמה של הפלטפורמה לבעלי החיים. לאחר הזרקת intramyocardial, העכבר ממוקם בכלוב בכוחות עצמו ואיפשר להתאושש מהרדמה תחת השגחה.
10. אל תשאיר חיה ללא השגחה עד שהוא חזר להכרה מספיק כדי לשמור על כיבה sternal. אל תחזרו בעלי חיים שעברו הזרקת intramyocardial לחברתם של בעלי חיים אחרים, עד שהתאושש באופן מלא. הכלוב צריך להיות ממוקם על משטח thermoregulated עם מחדשמתן ady של דיאטת מים ועכבר. אי נוחות Postprocedural לא צפויה וכישלון לחדש כראוי התנהגות נורמלית זמן קצר לאחר ההתערבות מציע סיבוך פוטנציאלי (ראה דיון).
11. להשליך בזהירות את המחט מייד לאחר השלמת הזרקת intramyocardial כדי למזער את הסיכון לפציעה חדה למפעיל או עוברי האורח. שימוש חוזר במחט עלולה לגרום להקהיה של הקצה שהופך אותו מאתגר יותר כדי לחדור את שריר הלב וכתוצאה מכך בסיכון גבוה יותר של סיבוכים.

תוצאות

הזרקת Intramyocardial עכברית עם צבע הכחול או Microspheres פלורסנט

הזרקה של הצבע הכחול של אוון היא שימושית למטרות אימונים. זמן קצר לאחר הזרקה, להרדים את העכבר ולהסיר את הלב לדמיין את מיקומו של הצבע הכחול המוזרק. איור 5 מראה דוגמא של זריקה...

Discussion

ביולוגיים יכול להיות מועבר לשריר הלב על ידי הזרקה ישירה intramyocardial, הזרקת intrapericardial, או ממשל עקיף באמצעות זרם הדם. ניסויי טיפול אחרונים תא מבוסס במודלי אוטם שריר לב שתיארו גישת פתיחת בית החזה פתוחה למסירת injectate ^12-14. גורם חשוב בהצלחה של התערבות טיפולית בשריר הלב תלוי...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vevo 2100 ultrasound imaging system	Visualsonics
Vevo Integrated Rail System III	Visualsonics
Microscan MS400 transducer	Visualsonics
Microscan MS550D transducer	Visualsonics
PrecisionGlide needles	BD	305128	30 G x 1 in/2.5 cm
1 cc slip tip syringe	Exel International	26048	or equivalent
Gastight 50 μl glass syringes	Hamilton	1705
Trypan blue stain (0.4%)	Gibco	15250	or equivalent
Isoflurane	Baxter	AHN3640	or equivalent
Aquasonic 100	Parker Laboratories	(01-08)	or equivalent
Polystyrene microspheres (red fluorescent)	Life Technologies	F-8842	or equivalent