התנהגות הערכה של מערכת שיווי המשקל עכבר ההזדקנות

Summary

שליטה מוטורית וביצועי איזון ידועים להידרדר עם גיל. מאמר זה מציג מספר המבחנים סטנדרטיים פולשנית התנהגותיות עם התוספת של גירוי סיבובי פשוט לאתגר את שיווי המשקל במערכת ולהראות שינויים בביצועי איזון במודל עכברי של הזדקנות.

Abstract

ירידה בגיל הקשורים בביצועי איזון קשור לכוח הידרדרות שרירים, קואורדינציה מוטורית ותפקוד שיווי המשקל. בעוד מספר מחקרים מראים שינויים בפנוטיפ איזון עם גיל במכרסמים, מעט מאוד לבודד את תרומת שיווי המשקל כדי לאזן תחת שני תנאים נורמלים או במהלך הזדקנות. אנו משתמשים בשני מבחנים סטנדרטיים התנהגותיות כדי לאפיין את ביצועי האיזון של עכברים בנקודות גיל קבועים על פני אורך החיים: במבחן rotarod ובדיקת קרן איזון נוטה. חשוב לציין כי, הכתף בנוי מותאם אישית משמש גם כדי לעורר את מערכת שיווי המשקל של עכברים (ללא גרימת סימנים גלויים של מחלת תנועה). שתי בדיקות אלה היו בשימוש כדי להראות ששינויים בביצועים בתיווך איזון שיווי המשקל נמצאים מעל תוחלת החיים העכבריות. תוצאות ראשוניות מראות כי גם במבחן rotarod ובדיקת קרן איזון שונה ניתן להשתמש כדי לזהות שינויים בביצועי איזון במהלך הזדקנות כחלופה ליותר difficטכניקות ult ופולשניים, כגון מדידות vestibulo העינית (VOR).

Introduction

תחושת האיזון שלנו היא אולי אחד המרכיבים החיוניים התעלמו ביותר עד כה של אפילו הפעילויות המוטוריות הבסיסיות ביותר כולל הליכה ומפנה. איזון מושפע מגורמים רבים, כולל כוח שריר, קואורדינציה מוטורית ותפקוד שיווי המשקל, וזה רק בנוכחות נוירופתיה שיווי המשקל או במהלך הזדקנות נורמלית כי החשיבות של מערכת שיווי משקל לתפקוד מלא מוערכת. הפרעות למערכת שיווי המשקל הקשורים לעתים קרובות עם חוויות של סחרחורת או סחרחורת וחוסר שיווי משקל וכתוצאה מכך עלייה בסיכון לנפילות והפציעות הבאות ^1. זה הוא קריטי במיוחד באוכלוסיות מבוגרות בי נפילות הן אחד הגורמים העיקריים לפגיעה ^2.

בדיקות תפקודי שיווי המשקל מבוססים בדרך כלל על רפלקסים שיווי המשקל, בפרט, vestibulo העיני (VOR) או רפלקס vestibulo-collic (וידאו). VOR ומכשיר הווידאו הם חיוניים לייצוב תמונות עלעמדת רשתית ואת הראש בתנועות הראש והגוף בהתאמה. בדרך כלל, מדידות VOR דורשות השתלה פולשנית של סלילי חיפוש למדוד תנועות עיניים או וידאו מעקב אחר תנועות עיני ^3. זה מאתגר בעכברים בשל האופי הקטן של העין העכבר והקושי באיתור את התלמיד לוידאו ניתוח ^3. כחלופה, מכשיר הווידאו נעשה שימוש כדי למדוד את התייצבותו של הראש בתגובה לגוף תנועות בעכברים ללא הצורך בניתוח פולשני ^4. למרות זאת, מעט מחקרים להתמקד דווקא על אופן שבו מערכת שיווי המשקל מבצעת בכללותו וחשובה יותר כיצד הוא משתנה במהלך הזדקנות.

כדי להעריך את ביצועי איזון הכוללים פשוט וnoninvasively שינינו שתי בדיקות התנהגותיות נפוצות. בדיקות קרן איזון rotarod ונוטה להעריך אספקטים שונים של ביצועי מנוע במכרסמים ובמחקרים קודמים כבר בשימוש בסוללת מבחן לרכישה מלאפרופיל של יכולת המוטורית. יכולת זו יכולה להיות מושפעת על ידי מחלה או הנדסה גנטית, והוא גם רגיש לתהליכים הקשורים להתפתחות תקינה והזדקנות ^5-7. העבודה קודמת באמצעות rotarod הוכיחה כי קואורדינציה מוטורית בעכברים יורדת לאחר 3 חודשים של גיל ^8. בנוסף, חולדות מראות גירעונות איזון בולטים עם העלייה בגיל במבחן קרן איזון ^9.

מאמר זה מתאר את השימוש בבדיקות rotarod וקרן איזון בשילוב עם גירוי שיווי המשקל במטרה לאתגר את מערכת שיווי המשקל ולאפיין את ההשפעה שלאחר מכן על ביצועי איזון בעכברים צעירים ומבוגרים. בעוד שהשיטות פשוטות ולא פולשנית שתוארו לא נועדו כאמצעי עצמאי של תפקוד שיווי המשקל היקפי, הם לספק מידה התנהגותיות שימושית ופשוטה להשוואת שינויים תאיים וsubcellular בשלבים שונים של עיבוד שיווי המשקל במהלך הזדקנות נורמלית בעכברים.

Protocol

1. בעלי חיים

1. עכברים (C57/BL6) בגילאי 1, 9, ו13 חודשים ישנים התקבלו ממשאבי מרכז בעלי החיים (פרת', אוסטרליה). עכברים אלו שוכנו בכלובי עכבר סטנדרטיים במתקן בוש מכרסם באוניברסיטת סידני בשעתי אור 12/12 / מחזור כהה עם גישה למזון ומים כהרצון. הנהלים המפורטים להלן אושרו על ידי האוניברסיטה של ​​ועדת אתיקה בבעלי חיים בסידני.
2. להביא כלובי עכבר לחדר הבדיקות לפני כל בדיקה ל10 דקות, כדי לאפשר עכברים להתאקלם לסביבת הבדיקות.

2. Rotarod

1. הקים את מנגנון rotarod (איור 1 א):
   1. התקן את פינים בכל מסלול של rotarod.
      הערה: בפיני חולדה מקרה זה (70 מ"מ קוטר) נמצאים בשימוש במקום פיני עכבר (32 מ"מ קוטר) כדי להרתיע את העכברים מהיצמדות למסמרת וביצוע "סיבובים פסיביים" ^10.
   2. להניחיון פלטפורמות נחיתה המגנטית על התיל ממוקם בחלק התחתון של כל מסלול של rotarod לוודא שהם לא הטיה לגעת ברצפת rotarod וממוקם קרובים ככל האפשר לקיר הימני המגנטי של כל מסלול בלי לגעת.
      הערה: במהלך עכברי בדיקות rotarod נדרשים ללכת בכיוון קדימה להישאר על פינים מסתובבים ומואצים. כאשר עכבר הוא כבר לא מסוגל להישאר על פינים, הם נופלים ולעקור את פלטפורמת הנחיתה שלאחר מכן מפעילה את חיישן מגנטי. לקח את הזמן כדי לרדת מהמסמרת מסתובבת, סל"ד מסמרת בזמן נפילה ואת מרחק הנסיעה מחושבת באופן אוטומטי עבור כל עכבר ונרשם על מסך התצוגה בחלק הקדמי של rotarod.
   3. שקופית 2 לוחות פלסטיק שקופים לחלק הקדמי של כל מסלול rotarod עם פנלים קצרים יותר בתחתית והפנלים כבר לעיל.
   4. קלט הפרמטרים הבדיקה באמצעות לוח המקשים ממוקמים בחלק הקדמי של rotarod. עקוב steps 2.1.4.1 ל2.1.4.6 לפרמטרי בדיקת rotarod ההאצה וצעדי 2.1.4.7 ל2.1.4.12 לבדיקת הפרמטרים הקבועים מהירות rotarod.
      1. הגדר את משך הזמן המרבי של המבחן ל60 שניות.
      2. הגדר את מספר הנתיבים לשימוש (או מספר העכברים שנבדק).
      3. קבע את מהירות ההתחלה של המבחן ל5 סל"ד.
      4. הגדר את מהירות השיא של המבחן ל44 סל"ד.
      5. קבע את מהירות הרמפה של המבחן ל60 שניות.
      6. הגדר את הגודל של פינים שנבחרו ואת כיוון הסיבוב לפיני עכברים מסתובבים בכיוון קדימה.
      7. הגדר את משך הזמן המרבי של המבחן ל240 שניות.
      8. הגדר את מספר הנתיבים שישמשו ל1 כעכברים נבדקים בנפרד.
      9. קבע את מהירות ההתחלה של המבחן ל15 סל"ד.
      10. הגדר את מהירות השיא של המבחן ל15 סל"ד.
      11. קבע את מהירות הרמפה של המבחן ל0 שניות.
      12. הגדר את הגודל של פינים שנבחרו ואת כיוון הסיבוב למסמרת חולדה מסתובבת בforwaכיוון שלישי.
          הערה: ההגדרות לעיל עשויות להשתנות כדי להתאים לצרכימים של ניסויים שונים.
   5. הצב מצלמה מול rotarod למבחן rotarod מהירות קבועה, כך שההתנהגות של העכבר בניסויים יכולה להיות מוקלטת והקטעים הווידאו המשמשים לניתוח מאוחר יותר כדי לקבוע את משך זמן העכברים הצליחו להישאר על rotarod.
2. בצע את שלבי 2.2.1 ל2.2.4 למבחן rotarod ההאצה:
   1. העבר את העכבר על כל אחת מסמרת נייחת למשך 5 דקות כדי לאפשר לעכברים להתאקלם לrotarod.
   2. בעדינות לדחוף את העכברים אל הפנים גב rotarod ולהתחיל את בדיקת rotarod כאשר כל הנושאים עומדים בפני בכיוון זה (ראה איור 1).
   3. להחזיר את כל העכברים בכלובים שלהם כאשר הם נפלו מהפינים מסתובבים ולהשאיר אותם למנוחה ל10 דקות עם גישה למזון ומים.
   4. חזור על השלבים 2.2.1 ל2.2.3 כדי להשלים את הסכום כולל של 8 ניסויים והקפד לנקותפינים, נתיבים, ופלטפורמות נחיתה של rotarod לשתן וצואה, ולהזיז את פלטפורמות הנחיתה בחזרה למצב ההתחלתי שלה betwen כל ניסוי.
      הערה: 3-5 הניסויים הראשונים משמשים כניסויי אימונים כדי לאפשר לעכברים להכיר את עצמם עם המשימה. הזמן ליפול, מרחק הלך וסל"ד סוף מסמרת בעת הנפילה לכל משפט שלאחר מכן נרשם לניתוח מאוחר יותר (איור 2).
3. בצע את השלבים 2.3.1 ל2.3.8 למבחן rotarod מהירות הקבוע:
   1. העבר את העכבר על אחת מסמרת במשך 5 דקות כדי לאפשר לו להתאקלם לrotarod. להחזיר את העכבר בחזרה לכלוב שלה.
   2. להתחיל בהקלטת וידאו במצלמה ולחץ להתחיל בrotarod. לאחר מכן הנח את העכבר על מסמרת מסתובבת הבטחה הניצבת בפניה האחורי של rotarod.
   3. לעצור את הקלטת וידאו במצלמה כאשר העכבר נופל מהפינים מסתובבים, ולהחזיר את העכבר לכלוביה עבור 10 דקות עם גישה למזון ומים.
   4. חזור על השלבים 2.3.2 ו 2.3.3 עד סכום כולל של 8 ניסויים הוא רכש והקפד לנקות את פינים, נתיבים, ופלטפורמות נחיתה של rotarod לצואה ושתן, ולהזיז את פלטפורמות הנחיתה בחזרה לעמדת המוצא שלה בין כל ניסוי .
   5. הפעל את הכתף המותאם אישית שנבנה ב3 הרץ ל20 שניות כדי לאפשר לעכברים כדי להכיר את הצליל. עצור את הכתף לאחר 20 שניות ידי לכבות את התרגיל ולהניח את הידיים בכל צד של גלגל הריצה כדי לעצור אותו מלהמשיך ולטוות העבר 20 שניות הראשוניות.
      הערה: המסובב עצמו מורכב מגלגל ריצה מכרסמים מאובטחים (איור 3 א) תרגיל. במרכזו של גלגל הריצה הוא חדר קטן עם מכסה רשת שבו העכבר ממוקם (איור 3 ב). מסובבי ספינים בכיוון נגד כיוון השעון על הציר האנכי. עוצמת הגירוי עולה בקנה אחד עם מחקרים קודמים שמראים גירויים סיבוביים הנעים 0.2-3 הרץ מספיקים כדי generאכלתי תגובות VOR ומכשיר וידאו ^4,11,12.
   6. מניחים את העכבר בתוך החדר במרכז הכתף ולהחליף את המכסה.
   7. הפעל את הכתף בהגדרה של 3 הרץ ל20 שניות הנמוכה ביותר שלה. התחל rotarod ולהתחיל בהקלטת וידאו במצלמה בתקופה זו כהכנה לניסוי הקרוב. כבה את התרגיל בסוף שניות 20 ולמקם את הידיים בכל צד של גלגל הריצה כדי לעצור אותו מספינינג. בדוק שוב את העכבר על rotarod מייד לאחר על ידי העברתו במהירות אפשרית למסמרת מסתובבת.
   8. לעצור את הקלטת וידאו במצלמה כאשר העכבר נופל מהמסמרת ולהחזיר את העכבר לכלוב שלה.
4. נקה את לוחות פלסטיק השקופים עם חומר ניקוי / תערובת מים וקלה פינים גליליים, נתיבים ופלטפורמות נחיתת מתכת של rotarod עם אתנול 70% כאשר כל העכברים נבדקו.

3. קרן איזון עם שיווי המשקל אתגר

1. הגדר את baמנגנון קרן לאנס ראה כמו באיור 4 א.
   הערה: מנגנון קרן האיזון הותאם ממנגנון המתואר בקרטר ואח' (2001) ^13.. לבדיקה זו, עכברי הליכה מהקצה התחתון של הקורה, שהוא 52.5 סנטימטר מעל פני הקרקע, לתיבה חשוכה מטרה (13 x 22 סנטימטר, עם פתח סנטימטר 5 x 6) ממוקמת 60 סנטימטר מעל הקרקע (איור 4 א ). עכברים באופן טבעי לחפש את החושך והגנה על תיבת המטרה לטובת הקרן חשופה ומעודדים עוד יותר לעבור את הקורה בשיפוע הקל המנצל מנגנון הבריחה הטבעי שלהם לפעול בכיוון ¹⁴ כלפי מעלה. הקרן עצמו היא 1 מ 'אורך ויש לו חתך עגול בקוטר של 14 מ"מ. טווח מותאם של קטרי קרן יכול לשמש אשר מאפשר הנסיין להתאים את הרגישות של הבדיקה או להכיל נושאים רחבים יותר. בקצה התחתון של קרן איזון קו לבן מציין את קו הזינוק. קו נוסף היהנמשך 60 סנטימטר מקו ההתחלה בקצה הגבוה של הקורה כדי לציין את קו הסיום (איור 4 א).
   1. עמדת 2 מצלמות, אחת בכל צד של הקורה, בקצה התחתון של קרן האיזון (איור 4).
      הערה: צריכה להיות בזווית מצלמות אלה כדי ללכוד את כל אורכה של קרן האיזון ולהבטיח כי קווי התחלה וסיום מסומנים על קרן האיזון נראה בבירור. מצלמות אלה ישמשו להקלטת וידאו על התנהגותם של עכברים כפי שהם חוצים את קרן האיזון, עם קטעי וידאו וכתוצאה מכך בשימוש לניתוח מאוחר יותר.
   2. מרפד את הרצפה של תיבת המטרה עם מגבת נייר, כדי לאפשר ניקוי קל של שתן וצואה לאחר הבדיקה של כל עכבר, ולמקם את כיפת הדיור מכלוב נושאים הבית בתוך קופסא המטרה.
   3. הנח קצף הולם או חומר ריפוד אחר מתחת לקורה העלה כדי להגן על כל נושאים שנופלים מהמנגנון. עכברים שייפלו יהיו נטלו באופן מיידי על ידי הניסויאה והניח בתוך קופסא המטרה לנוח.
2. העבר את עכבר אחד בתיבת המטרה למשך 2 דקות, כך שהוא הופך להיות מוכר עם סביבה זו. לכסות את הפתח לתיבת המטרה עם יד בכפפה במשך 5 שניות אם העכבר מנסה ללכת על הקורה בתקופה זו כדי למנוע התנהגות זו.
3. לאמן את העכבר על ידי הצבתו על הקורה מחוץ לפתיחה לתיבת המטרה ומאפשר לו להיכנס לתיבת המטרה. תמשיך לאמן את העכבר על ידי הצבתו על הקורה בהדרגה יותר רחוק מתיבת המטרה עד שהעכבר הוא מסוגל ללכת מקו ההתחלה לתיבת המטרה ללא סיוע והיסוס מינימאלית. השאר את העכבר כדי לנוח בתיבת מטרת דקות 1 אחרי כל הסיבוב.
4. להתחיל לבדוק את העכבר בעת אימון הוא מוחלט.
   1. להתחיל בהקלטת וידאו במצלמות.
   2. מניחים את העכבר בקו ההתחלה של הקרן ולחכות בזמן שהוא חוצה את האלומה בכיוון של תיבת המטרה.
   3. לעצור את הקלטת וידאו על cameras כאשר העכבר מגיע לקופסה.
   4. השאר את העכבר כדי לנוח בתיבת מטרת דקות 1. הסר את כל שתן או צואה שייתכן שהופקד במהלך המשפט בזמן ההמתנה.
   5. חזור על השלבים 3.4.1 ל3.4.4 עד סך של 5 ניסויים הושלם.
5. מתג על הכתף המותאם אישית שנבנה ב3 הרץ ל20 שניות (כמו במבחן rotarod מהירות קבועה) על מנת לאפשר לעכברים כדי להכיר את הצליל. עצור את הכתף לאחר 20 שניות ידי לכבות את התרגיל ולהניח את הידיים בכל צד של גלגל הריצה כדי לעצור אותו מספינינג.
6. מניחים את העכבר בתוך החדר במרכז הכתף ולהחליף את המכסה.
7. הפעל את הכתף בהגדרה של 3 הרץ ל20 שניות הנמוכה ביותר שלה. להתחיל בהקלטת וידאו במצלמות בתקופה זו, כהכנה לניסוי הקרוב. כבה את התרגיל בסוף שניות 20 ולמקם את הידיים בכל צד של גלגל הריצה כדי לעצור אותו מלהמשיך ולטוות העבר 20 שניות הראשוניות. Transfer את העכבר לתחילת קרן האיזון במהירות אפשרית ולחכות בזמן שהעכבר חוצה את האלומה לתיבת המטרה.
8. לעצור את הקלטת וידאו במצלמות כאשר העכבר מגיע לתיבת המטרה ולהחזיר את העכבר לכלוב שלה.
9. נקה את מנגנון קרן איזון עם 70% אתנול ולשנות את מגבת נייר בתיבת השער, לאחר כל עכבר נבדק.

תוצאות

Rotarod

ביצועי המנוע של עכברים תוארו כזמן לנפול (TTF) נרשם לכל עכבר מעל 8 ניסויים. באמצעות מדידות של TTF אלה, ניתן להתוות עקומות אימון לכל עכבר. תרשים 2 מציג דוגמאות של הביצועים המוטוריים של עכבר אחד 1 בן החודש ועכבר אחד 9 חודשים ישנ?...

Discussion

שלבים קריטיים בפרוטוקול

העבודות קודמות הראו כי זה קל overtrain עכברים בשני rotarod ומכשירי קרן איזון וכתוצאה מכך, הרכישה של מדידות מדויקות יכולה להיות ¹⁵ מאתגרים. לדוגמא, לגרום לאימון יתר על rotarod יכול להוביל לעכברים לקפוץ בכוונה פיני?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rotarod	IITC Life Science Inc.	#755	"Rat dowels" = 70 mm diameter. Do not allow ethanol to contact perspex.
iPhone	Apple		Can use any type of camera. Velcro fixed to the back surface for attachment to the the 3D articulated arm.
3D articulated arm	Fisso/Baitella	Classic 3300-28	Any type of stable vertical stand would be adequate. Velcro is fixed to the apical end of the arm for iPhone attachment.
Wooden walking beam: 1 m long strip of smooth wood with a circular cross-section of 14 mm diameter			A range of diameters and cross section shapes can be used to suit experimental parameters
Wooden goal box (130 x 140 x 220 mm) made from 11 mm thick boards
Support stand made of 41 x 41 mm beams: 2 vertical beams 525 and 590 mm from ground at the start and goal ends respectively; 803 mm horizontal beam that runs along the ground directly under the walking beam; two 20 mm long beams act as "feet", joining the horizontal and vertical beams at each end; a 21 x 21 x 36 mm block hewn at the apical end of the "starting" vertical beam; a 13 x 13 mm aperture cut out of the center of this block, forming a tunnel which runs perpendicular to the walking beam.			Brace all joins with small steel brackets.
Black paint (water based)	Handycan	Acrylic Matt Black	2-3 coats for all wooden surfaces of the balance beam apparatus
Clear finish	Wattle Estapol	Polyurethane Matt	Single coat for all beams. Double coat for all other surfaces of the balance beam apparatus
Foam, packaging material			To cushion any falls from the balance beam
70% Ethanol, paper towels			Clean beam and goal box between each animal.
Gauze pads/paper towels			To line the floor of the goal box
Mouse house (from home cage)